Summary
Biolistische transformatie een methode om stabiele integratie van DNA genereren in het genoom van de opportunistische pathogeen Cryptococcus neoformans via homologe recombinatie. We zullen biolistische transformatie van een construct, waarin het gen codeert acetaat kinase gefuseerd met de fluorescerende tag mCherry in C. neoformans is aangetoond.
Abstract
De basidiomycete Cryptococcus neoformans, een invasieve opportunistische pathogeen van het centrale zenuwstelsel, is de meest voorkomende oorzaak van fungale meningitis wereldwijd resulteert in meer dan 625.000 doden per jaar wereldwijd. Hoewel elektroporatie is ontwikkeld voor de transformatie van plasmiden Cryptococcus, alleen biolistische levering een effectief middel om lineair DNA die kunnen worden geïntegreerd in het genoom door homologe recombinatie transformeren.
Acetaat is aangetoond dat een belangrijk fermentatieproduct tijdens cryptococcal infectie, maar de betekenis hiervan is nog niet bekend. Een bacteriële pad bestaande uit enzymen xylulose-5-fosfaat / fructose-6-fosfaat fosfoketolase (Xfp) en acetaat kinase (Ack) is een van drie manieren waarop acetaat productie C. neoformans. Hier tonen we de biolistische transformatie van een construct,waarin het gen codeert Ack is gefuseerd met de fluorescente tag mCherry, in C. neoformans. Wij bevestigen dan is integratie van de ACK -mCherry fusie in de ACK locus.
Protocol
OPMERKING: De algemene opzet van dit protocol is geschetst in figuur 1.
1. C. neoformans Voorbereiding
- Voor elke transformatie reactie, groeien een 2-3 ml O / N cultuur van C. neoformans in YPD-medium bij 30 ° C onder schudden bij 250 rpm.
- Centrifugeer de O / N kweek gedurende 5 min bij 900 x g bij 10 ° C en de bovenstaande vloeistof.
- Resuspendeer elk celpellet in 300 gl gist pepton dextrose (YPD) medium.
- Met glasparels, verspreid zachtjes 300 pl van de gewassen celsuspensie op YPD-agar met 1 M sorbitol.
- Laat platen drogen bij kamertemperatuur gedurende 3-4 uur.
2. Gold microdrager Voorbereiding
- Resuspendeer 0,25 g 0,6 pm goud kralen in 1 ml van DDH 2 O, centrifugeer gedurende 1 min bij 900 xg om de kralen pellet en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de gouden kralen in 1 ml 100% ethanol. </ Li>
- Verdeel de kralen in 4 buizen 250 pl elk en met 750 ul 100% ethanol.
- Store goud kraal fracties bij 4 ° C.
3. DNA Voorbereiding
- Bereid oranje macrodrager biolistische schijven door onderdompeling ze in 100% ethanol met behulp van een tang. Plaats schijven in een grote petrischaal die drieriet drogen (zorg ervoor dat de drieriet niet de schijven raken).
- Eenmaal droog, drukt u op de macrodrager discs in de zilveren schijf houders (voorheen afgeveegd met 100% ethanol).
- Vortex gouden kralen (bereid als in stap 2) en 12 pi aliquot in een 1,5 ml microcentrifugebuis, één buis per transformatie.
- Aan elke buis volledig: 2 ug DNA (bij voorkeur 2 ui 1 ug / ul DNA), 10 pl 2,5 M CaCl2, en 2 gl 1 M spermidine vrije base.
- Stel een negatieve controle in stap 3.4, maar zonder DNA.
- Vortex elke buis en incubeer bij kamertemperatuur5 min. Tik zachtjes tegen elke buis af en toe naar de vaste kralen resuspenderen tijdens deze incubatie.
- Spin buizen bij 225 xg gedurende 30 sec om de DNA-gecoate gouden kralen pellet. Verwijder voorzichtig het supernatant (door pipetteren of aspiratie) en gooi deze weg.
- Resuspendeer kralen volledig in 600 pi 100% ethanol door langzaam en neer te pipetteren.
- Spin buizen bij 225 xg gedurende 30 seconden om de kralen pellet zonder verpakking. Verwijder de bovenstaande vloeistof voorzichtig.
- Resuspendeer de DNA-gecoate gouden kralen in 8 pi 100% ethanol door langzaam en neer te pipetteren.
- Pipetteer de DNA-gecoate gouden kralen op het midden van de biolistische schijf in een 1 cm diameter en laten drogen.
OPMERKING: Een droge gouden cirkel zichtbaar op het midden van de biolistische schijf aangeeft dat een voldoende concentratie van goud kralen aanwezig is.
OPMERKING: De macrodrager schijven geladen met DNA-gecoate gouden kralen zijn nu klaar voor gebruik met het gen pistool.
4. OPERATIONELE de Gene Gun
- Schakel de vacuümpomp.
- Zet de heliumgas door de knop naar links tot een druk van ongeveer 2.200 psi is bereikt over de manometer.
- Schakel het gen pistool door het opgooien van de rode schakelaar aan de linkerkant.
- Wees er zeker van dat de debieten voor het vacuüm en de ventilatie worden aangepast, zodat het vacuüm zal bereiken 28 inch Hg binnen 15 sec.
- Zorg ervoor dat de afstand tussen de breekplaat en macrodrager is ongeveer 3/8 inch.
- Maak de hele kamer door afvegen met ethanol.
- Dompel de breekplaten in 100% ethanol. Laten drogen op een steriele ondergrond (bv, petrischaal).
- Gebruik een momentsleutel om de breuk schijf houder los te maken. Plaats een schone breuk schijf in de houder. Schroef de breuk schijf houder terug op zijn plaats en draai met de momentsleutel door er één keer naar rechts.
OPMERKING: Breekschijven zal worden vervangen na elke shoot. - Dompel the gaasjes in 100% ethanol. Laten drogen op een steriele ondergrond (bv, petrischaal).
- Eenmaal droog, plaats een gewassen gaas op de witte kunststof montageplaat. Plaats de macrodrager schijf houder DNA-kant naar beneden in de disc kamer. Schroef op de zilveren dop en plaats de montageplaat in de hoogste slot.
OPMERKING: Het scherm mesh zal worden vervangen na elke shoot. - Plaats een YPD agar plaat met 1 M sorbitol op de bodemplaat.
- Shut deurtje en vastklikken.
- Houd de middelste rode schakelaar tot vacuüm gaan en laat het vacuüm tot 28 inch Hg te bereiken. Zodra de juiste vacuüm niveau is bereikt, zet deze schakelaar op de onderste positie. Als u klaar bent, houdt u de rode knop aan de rechterkant om te vuren. Wanneer de breekplaat knalt, onmiddellijk het vuur knop los en druk op de middelste rode schakelaar in de middelste stand om de kamer te ventileren naar 0 psi.
- Reinig breekplaat puin en schakel het gen pistool. Schakel vervolgens de helium gas door de knop met de klok mee, en ten slotte, zet de vacuümpomp.
5. Plating getransformeerde cellen
- Laat de transformatie platen zitten bij kamertemperatuur gedurende 4 uur om de cellen te herstellen.
- Pipetteer 700 ul van YPD op de plaat. Gebruik een celschraper zachtjes schrapen van de cellen uit de agar en pipet vloeistof in een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis. Herhaal deze stap om ervoor te zorgen alle cellen zijn hersteld van de plaat.
- Pellet cellen bij 225 g gedurende 30 sec. Verwijder de bovenstaande vloeistof.
- Resuspendeer de pellet in 500 ui YPD.
- Pipetteer 100 ul van de celsuspensie op het midden van de YPD + antibioticum verdeeld en met glasparels.
- Laat omgekeerde platen bij kamertemperatuur gedurende 3-4 dagen. Zoals kolonies verschijnen, pleister op nieuwe YPD- + antibiotica platen.
6. Genomisch DNA Isolatie PCR
LET OP: Dit is een aangepaste versie met behulp van reagenss uit een DNA-zuivering kit (zie tabel van Materialen).
- Kweek een cultuur 5 ml van elk van de C. neoformans transformanten in YPD vloeibaar bij 30 ° C onder schudden bij 250 rpm O / N.
- Pellet 3 ml cellen bij 900 xg en resuspendeer in 600 ul van kernen lysisoplossing.
- Voeg de suspensie tot een nieuwe 1,5 ml microcentrifuge buis met 200 ui 0,5 mm zuur gewassen glasparels.
- Meng gedurende 45 seconden in een mini beadbeater bij omgevingstemperatuur, koel buis op ijs en herhaal.
- Laat monster om zich te vestigen op ijs gedurende 2 minuten en breng supernatant naar een nieuwe 1,5 ml buis. Voeg 200 ul van proteïne precipitatie-oplossing aan elke buis (100 ui voor elke 600 pl supernatant teruggewonnen) en vortex krachtig gedurende 20 seconden.
- Laat monsters te vestigen op ijs gedurende 5 minuten en centrifugeer bij 11.000 xg gedurende 3 min.
- Breng het supernatans een schone buis van 1,5 ml die 300 pl RT isopropanol. Voorzichtig mengen door inversie.
- Centrifuge monsters bij 11.000 xg gedurende 2 minuten, verwijder voorzichtig het supernatant en tap de buizen op keukenpapier.
- Voeg 300 ul van RT 70% ethanol aan elke buis en voorzichtig omkeren om de pellet te wassen.
- Centrifuge monsters bij 11.000 xg gedurende 2 minuten, en verwijder voorzichtig al het ethanol.
- Giet de buis op een schone papieren handdoeken, en laat de pellet aan de lucht drogen voor 10-15 min.
- Voeg 50 pl DNA rehydratatie oplossing en 1,5 ul RNase-oplossing in elk pellet en vortex.
- Centrifugeer de monsters gedurende 5 seconden om alle vloeistof uit de dop te verwijderen.
- Incubeer monsters bij 37 ° C gedurende 15 min.
- Hydrateren het DNA door de monsters te incuberen bij 65 ° C gedurende 1 uur.
- Kwantificeren DNA spectrofotometrisch door de absorptie bij 260 nm (A260 een lezing van 1,0 is gelijk aan -50 ug / ml dubbelstrengs DNA), en gebruik tot 200 ng per PCR reactie.
7. RNA isolatie voorReverse transcriptase-PCR.
- Met behulp van een RNA-zuivering kit (zie tabel van Materialen), volg de instructies van de fabrikant om RNA te isoleren van gistcellen met behulp van een minibeadbeater.
- Kwantificeren de concentratie van het RNA door meting van de absorptie bij 260 nm (A260 een lezing van 1,0 is gelijk aan ~ 40 pg / ml enkelstrengs RNA).
- Met behulp van een RT-PCR kit (zie tabel van Materialen), volg de instructies van de fabrikant voor het opzetten van RT-PCR-reacties met ongeveer 1 ug van RNA. Voor de in deze studie verkregen resultaten de in tabel 1 vermelde primers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een succesvolle biolistische transformatie van C. neoformans kan worden verkregen door het volgen van dit protocol schema (figuur 1). Met biolistische transformatie, is een succesvolle shoot van de gecoate gouden kralen aangegeven door een gouden ring zichtbaar op het bord nadat het DNA is geschoten (Figuur 2A). Kolonies verschijnt binnen 4-5 dagen wanneer bewaard bij kamertemperatuur na het uitplaten van de cellen teruggewonnen uit de YPD + 1M sorbitol platen op selectieve media. Transformeren 2 ug DNA moet resulteren in 20 tot 30 kolonies (Figuur 2B). Wanneer kolonies verschijnen, moeten zij opnieuw uitgestreken op selectieve media voor afzonderlijke kolonies.
De individuele kolonies worden gekweekt in YPD medium en zowel DNA als RNA kan worden geïsoleerd uit deze cellen en geanalyseerd door PCR en RT-PCR goede integratie en expressie te bevestigen. Als dit protocol wordt gebruikt gelabeld genfusie, zoals in dit voorbeeld, de primers zou t behoefteo gloeien binnen het coderende gebied van het gen van belang (primer 2) en binnen de 3 'niet-coderende gebied van het gen van belang (primer 4) (figuur 3A). Met dit construct, werd het DNA uit de PCR reactie sequentie voor een bevestiging dat de mCherry tag gefuseerd in frame met de ACK gen. Een positieve PCR bevestiging zou een groter PCR-product van het DNA geïsoleerd uit de getransformeerde cellen ten opzichte van de DNA geïsoleerd uit wildtype cellen. Een andere PCR-reactie zou ook moeten worden uitgevoerd met gebruikmaking van de primer set (primers 2 & 5), waar één primer anneals buitenkant van het construct en in de omliggende genoom (primer 5) om de juiste recombinatie te bevestigen in de gewenste locus (primer 7 in tabel 1) (Figuur 3B). RT-PCR zal worden gebruikt om ervoor te zorgen dat zowel het gen van interesse en de tag worden beide uitgedrukt in (Figuur 3C). Sequencing van de RT-PCR-fusieproduct indicates dat de tag goed gefuseerd aan het gen op het RNA niveau.
Als dit protocol wordt gebruikt om knock-out een gen van interesse dient primer sets voor PCR zijn ontworpen dat één primer hybridiseert aan een genoomsequentie buiten wanneer het construct moet recombineren in het genoom en de andere primer hybridiseert hetzij in de coderende regio van het gen of de selectieve merker. Een positieve bevestiging dat het construct succesvol en correct heeft gerecombineerd in het genoom zou de aanwezigheid van de juiste maat product voor de primer set die anneals binnen de marker maar niet met de primer set die versmelt met het gen van belang zijn. Een andere primer set moet worden dat één primer die buiten de ontworpen construct dat wordt gebruikt met PCR te bevestigen dat de recombinatie plaatsgevonden op het juiste locus hybridiseert heeft. In hetzelfde ontwerp om een knockout maken, wordt RNA geïsoleerd uit zowel de getransformeerde cellen en wildtype (WT) cellen en RT-PCR uitgevoerd om te bevestigen dat er geen expressie van het gen van belang wordt waargenomen vanuit de getransformeerde cellen.
Omdat een fluorescerende tag gefuseerd met de ACK gen, een bevestiging dat recombinatie was succesvol in de gewenste locus en RNA wordt vertaald naar eiwit door fluorescentie microscopie (figuur 4). Idealiter zijn de omstandigheden reeds vastgesteld wanneer bekend is dat het eiwit van belang wordt uitgedrukt. Indien het fluorescentiesignaal te laag te observeren, is er een mogelijkheid dat succesvolle recombinatie nog voorkomt, maar groeiomstandigheden moeten worden gewijzigd in de kans dat optimale voorwaarden is voldaan voldoende expressie, die tot een lage fluorescentie signaal. Dit zou moeten worden bevestigd door andere werkwijzen zoals een Western blot.
"/>
Figuur 1. Protocol regeling.
Figuur 2A. DNA-gecoate gouden kralen succesvol schot op een YPD + 1M sorbitol plaat. Een oranje patch gezien in het midden van de YPD + 1M sorbitol plaat door de DNA-gecoate gouden kralen, aangeeft juiste goud bereiding, alsmede een succesvolle shoot . Figuur 2B. Het transformeren van 2 ug van DNA resultaten in 20-30 kolonies per plaat. Als de cellen werden verdund zoals vermeld in het protocol, worden ongeveer 20-30 kolonies voorafgaand aan de plating op selectieve media verwacht. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3A. Schema van de ACK: mCherry:.. Neo constructie en primer ontwerp Figuur 3B PCR gebruikt om succesvolle homologe recombinatie te bevestigen. Lanen 1 en 2: PCR producten verkregen met behulp van primers 2 en 5 (tabel 1) met genomisch DNA van wildtype C. neoformans H99 (laan 1) en het ACK: mCherry getransformeerde stam (laan 2). Verwachte maten zijn 1511 en 5622 bp, respectievelijk. Lanen 3 en 4 zijn de DNA-producten van de C. neoformans H99 (verwachte lengte 1443 bp) en het ACK: mCherry (verwachte lengte 5552 bp) stammen, respectievelijk gebruik van primers 2 en 4 in Tabel 1. Lanen 5 en 6 zijn de DNA-producten van de C. neoformans H99 (niet hechten) en ACK: mCherry (verwachte lengte 3016 bp) stammen, respectievelijk met primers 1 en 3. Figuur 3C RT-PCR bevestiging van expressie van de mCherry tag.. De top rijstroken zijn de cDNA producten van het ACKmCherry fusieproduct (verwachte grootte 683 bp) versterkt uit de C. neoformansH99 en het ACK. MCherry stammen behulp van primers 2 en 3 in Tabel 1 Het actine-gen werd opgenomen als controle en werd geamplificeerd onder dezelfde omstandigheden als ACKmCherry (verwachte lengte 567 bp) met behulp van primers 6 en 7 in tabel 1. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Fluorescentie van de mCherry tagged Ack. Microscopische analyse van stammen die Ack gefuseerd aan een mCherry tag met een excitatie optimaal bij 587 nm en een emissie optimaal bij 610 nm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| 1 | KI003 | 5 '- GTA GCG AGG TCT GGA AGC CAC - 3' |
| 2 | ACKmChRT-F | 5'GCT TTG GCC GGT ACT ACC AAC -3 |
| 3 | ACKmChRT-R | 5'-GAC AGC TTC AAG TAG TCG GGG -3 ' |
| 4 | KI004 | 5 '- GAC TTG GGG AAG AGG AAT TC - 3' |
| 5 | KI0032 | 5 '- CGG GGT ACC ATC AAT AAA AGC TTT CTT CAC TCC - 3' |
| 6 | Actine 1 | 5'-CGC TAT CCT CCG TAT CGA TCT TGC -3 ' |
| 7 | Actine 2 | 5'CAG CTG GAA GGT AGA CAA AGA GGC -3 ' |
Tabel 1. PCR en RT-PCR-primers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de awards van de National Science Foundation (Award # 0.920.274) en de Zuid-Carolina Experiment Station Project SC-1.700.340. Deze paper isTechnical Bijdrage No. 6283 van de Clemson University Experiment Station. De auteurs danken dr Lukasz Kozubowski voor zijn nuttig advies bij de ontwikkeling van deze laatste protocol en Dr. Cheryl Ingram-Smith, Katie Glenn, en Grace Kisirkoi voor hun kritische lezing van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 μm gold beads | Bio-Rad | 165-2262 | http://www.bio-rad.com |
| Spermadine-free base | Sigma- Aldrich | S0266 | https://www.sigmaaldrich.com |
| G418 - Sulfate (Neomycin) | Gold Biotechnology | G-418-10 | www.goldbio.com |
| Hygromycin | Gold Biotechnology | H-270-1 | www.goldbio.com |
| 1350 psi Rupture Discs | Bio-Rad | 165-2330 | http://www.bio-rad.com |
| Stopping Screens | Bio-Rad | 165-2336 | http://www.bio-rad.com |
| Macrocarriers discs | Bio-Rad | 165-2335 | http://www.bio-rad.com |
| YPD Broth | Becton Dickinson & Co. | 242820 | www.bd.com |
| Agar | Becton Dickinson & Co. | 214530 | www.bd.com |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | http://www.fishersci.com |
| PDS-1000/He System | Bio-Rad | 165-2257 | http://www.bio-rad.com |
| Microscope | Zeiss | Axio | http://www.zeiss.com/microscopy |
| KOD One Step PCR Kit | EMD Millipore | 71086-4 | http://www.emdmillipore.com |
| One Step RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | www.qiagen.com |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | www.promega.com |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | www.qiagen.com |
| Mini Beadbeater - 1 | BioSpecs | 3110BX | http://www.biospec.com |
| Microfuge 18 Centrifuge | Beckman Coulter | F241.5P | www.beckmancoulter.com |
| Microplate Spectrophotometer | BioTek | EPOCH | www.biotek.com |
References
- Price, M. S., et al. Cryptococcusneoformans requires a functional glycolytic pathway for disease but not persistence in the host. MBio. 2, e00103-e00111 (2011).
- Bubb, W. A., et al. Heteronuclear NMR studies of metabolites produced by Cryptococcusneoformans in culture media: identification of possible virulence factors. Magn Reson Med. 42, 442-453 (1999).
- Himmelreich, U., et al. Identification of metabolites of importance in the pathogenesis of pulmonary cryptococcoma using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Microbes Infect. 5, 285-290 (2003).
- Wright, L., et al. Metabolites released by Cryptococcusneoformans var. neoformans and var. gattii differentially affect human neutrophil function. Microbes Infect. 4, 1427-1438 (2002).
- Hu, G., Cheng, P. Y., Sham, A., Perfect, J. R., Kronstad, J. W. Metabolic adaptation in Cryptococcusneoformans during early murine pulmonary infection. Mol Microbiol. 69, 1456-1475 (2008).
- Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. Acetate kinase: not just a bacterial enzyme. Trends Microbiol. 14, 249-253 (2006).
- Davidson, R. C., et al. Gene disruption by biolistic transformation in serotype D strains of Cryptococcus neoformans. Fungal Genet Biol: FG & B. 29, 38-48 (2000).
- Toffaletti, D. L., Rude, T. H., Johnston, S. A., Durack, D. T., Perfect, J. R. Gene transfer in Cryptococcusneoformans by use of biolistic delivery of DNA. J. Bacteriol. 175, 1405-1411 (1993).
- Edman, J. C., Kwon-Chung, K. J. Isolation of the URA5 gene from Cryptococcusneoformans var. neoformans and its use as a selective marker for transformation. Mol Cell Biol. 10, 4538-4544 (1990).
- Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. Complementation of a capsule-deficient mutation of Cryptococcus neoformans restores its virulence. Mol Cell Biol. 14, 4912-4919 (1994).
- Del Poeta, M., et al. Topoisomerase I is essential in Cryptococcusneoformans: role In pathobiology and as an antifungal target. Genetics. 152, 167-178 (1999).
- McClelland, C. M., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. High frequency transformation of Cryptococcusneoformans and Cryptococcusgattii by Agrobacteriumtumefaciens. Fungal Genet Biol:FG & B. 42, 904-913 (2005).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Nicola, A. M., Frases, S., Casadevall, A. Lipophilic dye staining of Cryptococcusneoformans extracellular vesicles and capsule. Eukaryot Cell. 8, 1373-1380 (2009).
