Summary
生物射弹转化是用于产生的DNA的稳定整合入条件致病菌新生隐球菌通过同源重组的基因组中的方法。我们将展示一个结构，它具有融合到荧光标记mCherry到新生隐球菌基因编码醋酸激酶的基因枪转化。
Abstract
所述担子菌新生隐球菌 ，中枢神经系统的一种侵入性致病菌，是真菌性脑膜炎全世界导致全世界每年超过625000例死亡的最常见的原因。虽然电穿孔已经被开发用于质粒在隐球菌的转化，生物射弹仅递送提供了转换，该转换可以集成到通过同源重组的基因组线性DNA的有效手段。
乙酸已被证明是隐球菌感染期间的一个主要的发酵产物，但这种意义尚不清楚。一种细菌途径中的酶木酮糖-5-磷酸/果糖-6-磷酸磷酸（XFP）和乙酸激酶（ACK）所组成，是用于生产乙酸在C 3潜在途径1 新型隐球菌 。在这里，我们展示了一个结构的基因枪转化，已确认编码基因融合到荧光标记mCherry，为C.新型隐球菌 。然后，我们确认整合到ACK -mCherry融合到所述ACK轨迹。
Protocol
注：本协议的总体方案是在图1列出。
1. C.新型隐球菌准备
- 对于每一个转化反应，增长C.一个2-3毫升的O / N培养隐球菌在YPD培养基中在30℃下250rpm摇动。
- 离心的O / N培养5分钟，在900×g离心10℃并弃去上清液。
- 重悬在300微升酵母蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基的每个细胞沉淀。
- 使用玻璃珠，轻轻地将300微升洗涤细胞悬浮液在含1M山梨醇的YPD琼脂上。
- 允许板，以在常温下干燥3-4小时。
2.金微载体的制备
- 悬浮0.25克0.6微米的金珠1毫升DDH 2 O的中，离心900 XG 1分钟沉淀珠子，去除上清。
- 重悬金珠在1ml的100％乙醇。</ li>
- 分发珠粒成4管，250微升每种，然后添加750微升的100％乙醇。
- 商店金珠等分在4℃。
3. DNA准备
- 通过浸没其中在100％乙醇使用镊子制备橙大载体基因枪光盘。地方光盘插入含有燥石膏干大培养皿（确保燥石膏不接触光盘）。
- 一旦干燥，按大载体盘入银盘支架（先前擦平用100％乙醇）。
- 涡旋金珠（其制备如上述步骤2）和等分12微升到1.5 ml离心管，每1转化管。
- 添加到每个管中顺序：2的DNA的微克（优选2微升的1微克/微升的DNA），10微升的2.5M的CaCl 2，和2μl的1M亚精胺游离碱。
- 设置一个阴性对照如在步骤3.4，但没有的DNA。
- 涡流每个管和孵化在室温下5分钟。轻轻一抖各管偶尔此孵化过程中重悬落户珠。
- 旋管在225×g离心30秒以沉淀DNA包被的金颗粒。小心取出上清液（吹打或抽吸），并丢弃。
- 完全在600微升的100％乙醇重悬珠子通过缓慢上下抽吸。
- 旋管在225×g离心30秒以沉淀珠无填料。小心地取出并弃去上清液。
- 通过慢慢地上下吹打重悬DNA包被的金颗粒在8微升的100％乙醇。
- 吸管将DNA包覆的金颗粒上的1厘米直径的所述生物射弹盘的中心并且允许干燥。
注：干燥金圆上的生物射弹盘的中心可见指示金珠的足够的浓度存在。
注：装载有DNA包被金颗粒的大载体盘现在准备用于与基因枪使用。
4.Ø操作摄像机基因枪
- 开启真空泵上。
- 转动旋钮，直到大约2200磅的压力打开氦气达到压力表。
- 通过翻转的红色开关左侧打开基因枪。
- 可以肯定的流速为真空和通气被调整，以便在真空将达到在15秒内28英寸汞柱。
- 可以肯定的破裂盘和大载体之间的距离大约是3/8英寸。
- 通过擦拭用乙醇清洁整个室。
- 淹没在100％乙醇的破裂盘。允许无菌表面干上（ 例如 ，培养皿）。
- 使用扭矩扳手松开爆破片固定器。将干净的爆破片到支架。爆破片支架螺丝放回原位，并一度将其向右拧紧力矩扳手。
注：安全盘会在每次拍摄所取代。 - 淹没日Ë纱网在100％的乙醇。允许无菌表面干上（ 例如 ，培养皿）。
- 一旦干燥，放置一个洗涤目筛上的白色塑料安装板。下来将大载体盘持有者DNA侧进盘室。拧上银帽，然后将安装板中的最高槽。
注：该网筛将分别拍摄后进行更换。 - 放置含1M山梨糖醇在底板的YPD琼脂平板上。
- 关上房间的门和锁到位。
- 按下并按住中间的红色开关高达从事真空，并允许真空达到28英寸汞柱。一旦合适的真空度达到，将此开关向下的位置。准备就绪后，按住上的火权的红色开关。当爆破片弹出，立即释放火按钮，按下中间的红色开关至中间位置，以发泄室0磅。
- 清理掉破裂盘碎片和关闭基因枪。然后关闭heliu米气体通过转动旋钮顺时针，最后，关闭真空泵关闭。
5.电镀转化细胞
- 允许转化板坐于RT搅拌4小时，以使细胞恢复。
- 吸移管700微升的YPD的上板。用细胞刮刀轻轻刮去细胞脱落琼脂和吸管液体进入无菌1.5毫升microfuge管。重复此步骤，以确保所有的细胞已被追回从板块。
- 沉淀细胞在225×g离心30秒。取出并弃去上清液。
- 悬浮在500微升YPD的沉淀。
- 吸移管将100μl细胞悬浮液到YPD +抗生素板的中心和散布用玻璃珠。
- 离开倒板在RT 3-4天。作为殖民地的出现，补丁到新的YPD +抗生素板块。
6.基因组DNA提取的PCR
注：这是使用试剂的修改版本从DNA纯化试剂盒S（见表材料）。
- 成长5毫升培养每个C.的隐球菌转化体在YPD液体在30℃下250rpm摇动O / N。
- 颗粒3毫升细胞在900 XG，重悬在600微升的核裂解液。
- 添加该悬浮液到一个新的1.5 ml离心管用200μl0.5mm的酸洗涤的玻璃珠。
- 在小型珠磨器在环境温度下，凉爽管在冰上匀化45秒，并重复。
- 允许样品定居在冰上2分钟，转移上清至新的1.5毫升管。加入200微升蛋白沉淀溶液到每个管中，（100微升每600微升上清液中回收的）和旋涡剧烈持续20秒。
- 允许样品定居在冰上5分钟，并离心在11000×g离心3分钟。
- 上清转移到一个干净的1.5毫升管含有300微升RT异丙醇。颠倒轻轻拌匀。
- 离心机样品在11000 XG为2分钟，小心取出上清液，漏管到纸巾。
- 添加300微升的RT的70％乙醇到每个管中，并轻轻颠倒以洗涤沉淀。
- 在11000×g离心2分钟，并小心地离心样品除去所有的乙醇。
- 排空管子上清洁纸巾，并允许沉淀在空气中干燥10-15分钟。
- 加入50微升的DNA补液溶液和1.5微升RNA酶溶液，以每个颗粒和旋涡。
- 离心样品5秒到从盖除去所有的液体。
- 孵育的样品在37℃下进行15分钟。
- 通过温育的样品在65℃下1小时再水合的DNA。
- 通过测量260nm处的吸光度分光光度计定量的DNA（一个A 260读数为1.0，相当于约50微克/毫升的双链DNA），并使用高达200纳克在每个PCR反应。
7. RNA分离的逆转录PCR。
- 使用RNA纯化试剂盒（见表材料），按照制造商的说明，从使用minibeadbeater酵母细胞中分离RNA。
- 通过测量260nm处的吸光度定量RNA的浓度（的A 260读数为1.0，相当于〜40微克/毫升的单链RNA）。
- 采用RT-PCR试剂盒（见表材料），按照制造商的说明设置了大约1微克RNA的RT-PCR反应。在这项研究中获得的结果，使用表1中所列的引物。
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Representative Results
C.的成功基因枪转化隐球菌可以按照此协议方案（ 图1）而获得。用生物射弹转化，的涂覆金珠成功的射门由金环上的板可见指示后该DNA是射门（ 图2A）。在室温下电镀回收的细胞从所述的YPD + 1M山梨醇板到选择性培养基后，当左菌落出现在4至5天。转化2微克的DNA应导致20至30的菌落（ 图2B）。当菌落出现，应再划线在选择性培养基上进行单个菌落。
单个菌落可以生长在YPD介质，DNA和RNA可以从这些细胞中分离和分析通过PCR和RT-PCR检测，以确认正确的整合和表达。如果该协议被用于标记基因融合，如在本实施例中，引物将需要吨感兴趣（引物2）的基因的编码区域内和3'非编码的兴趣（引物4）（ 图3A）的基因的区域内Ò退火。用该构建，从PCR反应扩增的DNA进行测序另一个确认该mCherry标记物融合在框架中向ACK基因。一个正的PCR确认将是一个较大的PCR产物从转化的细胞相比，由野生型细胞中分离的分离的DNA的DNA。另一个PCR反应也需要进行利用引物组（引物2和5），其中一个引物退火的构建体的外和周围的基因组（引物5）内，以确认正确的重组到表所需的基因座（引物7 1）（图3B）。 RT-PCR法将被用来确保感兴趣两个基因和标记都被 表达（ 图3C）。对RT-PCR融合产物INDI的测序凯茨该标签被适当地融合到在RNA水平的基因。
如果该协议被用于敲除目标基因，引物组进行PCR，应设计为使得一个引物退火的基因组序列的其中的构建体应重组入基因组外，其他引物退火或者在编码区域该基因或选择性标记。一个正确认该构建体已经成功地和正确地重组到基因组中。将正确大小产物的存在对于该标记物内，但不与退火到感兴趣的基因的引物组退火的引物组。另一引物组应当由具有一个引物退火的设计构建体，其用于以PCR方法，以确认该重组事件在正确轨迹发生的外部。在相同的设计，以创造一个敲除，RNA是从两个转化的细胞和野生型（WT）细胞中分离，和RT-PCR是进行，以确认所关注的基因的表达没有被从转化的细胞观察。
因为荧光标记物融合到所述ACK基因，另一个确认该重组是成功的成所需的轨迹和该RNA被翻译成蛋白质是通过荧光显微镜（ 图4）。理想的情况下，条件已经成立，其中，已知的感兴趣的蛋白质被表达。然而，如果荧光信号太低观察，有一种可能性，即成功的重组仍然发生，但是生长条件需要的机会最佳条件没有得到满足足够的表达，这将导致低的荧光被改变信号。这将需要通过其他方法来确认，如蛋白质印迹。
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图1.协议方案。
图2A。 DNA包被的金珠成功射击到YPD + 1M山梨醇板。橙色补丁见于YPD + 1M山梨醇板的中心是由于DNA包被的金颗粒，这表明适当金制剂，以及作为一个成功的芽图2B。转化2微克DNA结果在每盘20-30的殖民地。如果细胞稀释中提到的协议，大约20-30菌落镀选择性介质之前的预期。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3A。概略所述ACK的：mCherry：新构建体和引物设计图3B的PCR用于证实成功的同源重组。泳道1和2：PCR产物使用引物2和5（表1）与来自野生型C.基因组DNA获得的隐球菌 H99（泳道1）和ACK：mCherry转化菌株，（泳道2）。预计尺寸为1511和5622 bp的分别。泳道3和4分别是C的DNA产物隐球菌 H99（预期大小1443碱基对）和ACK：mCherry（预期大小5552 bp）的菌株，分别使用引物2和4在表1中泳道5和6是C的DNA产物隐球菌 H99（不应退火）和ACK：mCherry（预期大小3016 bp）的菌株，分别使用引物1和mCherry标记的表达。 图3C的RT-PCR确认。顶端泳道是ACKmCherry融合产物（预期大小683 bp）的距离C.扩增的cDNA产物新型隐球菌H99和ACK：使用表1中的引物2和3 mCherry株的肌动蛋白基因被包括在内作为对照，在相同条件下被扩增为ACKmCherry（预期大小567 bp）的使用引物6和表1中7。 请这里查看这个数字的放大版本。
图4.荧光mCherry的标签确认 。株产确认的微观分析融合与激发最佳的587 nm和610 nm的发射最佳的一个mCherry标签。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 1 | ķI003 | 5' - GTA GCG AGG TCT GGA AGC CAC - 3' |
| 2 | ACKmChRT-F | 5'- GCT TTG GCC GGT ACT ACC AAC -3 |
| 3 | ACKmChRT-R | 5'-GAC AGC TTC AAG TCG TAG GGG -3' |
| 4 | KI004 | 5' - GAC TTG GGG AAG AGG AAT TC - 3' |
| 五 | KI0032 | 5' - CGG GGT ACC ATC AAT AAA AGC TTT CTT CAC TCC - 3' |
| 6 | 肌动蛋白1 | 5'-CGC TAT CCT CCG TAT CGA TCT TGC -3' |
| 7 | 肌动蛋白2 | 5'-CAG CTG GAA GGT AGA CAA AGA GGC -3' |
表1 PCR和RT-PCR引物。
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Acknowledgments
这项工作是由美国国家科学基金会（奖＃0920274）和南卡罗来纳州实验站项目SC-1700340奖励支持。克莱姆森大学实验站本文isTechnical贡献号6283。作者感谢卢卡斯Kozubowski博士，他在这最后的协议和谢丽尔英格拉姆 - 史密斯博士，凯蒂格伦，和Grace Kisirkoi其关键手稿阅读的发展有益的建议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 μm gold beads | Bio-Rad | 165-2262 | http://www.bio-rad.com |
| Spermadine-free base | Sigma- Aldrich | S0266 | https://www.sigmaaldrich.com |
| G418 - Sulfate (Neomycin) | Gold Biotechnology | G-418-10 | www.goldbio.com |
| Hygromycin | Gold Biotechnology | H-270-1 | www.goldbio.com |
| 1350 psi Rupture Discs | Bio-Rad | 165-2330 | http://www.bio-rad.com |
| Stopping Screens | Bio-Rad | 165-2336 | http://www.bio-rad.com |
| Macrocarriers discs | Bio-Rad | 165-2335 | http://www.bio-rad.com |
| YPD Broth | Becton Dickinson & Co. | 242820 | www.bd.com |
| Agar | Becton Dickinson & Co. | 214530 | www.bd.com |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | http://www.fishersci.com |
| PDS-1000/He System | Bio-Rad | 165-2257 | http://www.bio-rad.com |
| Microscope | Zeiss | Axio | http://www.zeiss.com/microscopy |
| KOD One Step PCR Kit | EMD Millipore | 71086-4 | http://www.emdmillipore.com |
| One Step RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | www.qiagen.com |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | www.promega.com |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | www.qiagen.com |
| Mini Beadbeater - 1 | BioSpecs | 3110BX | http://www.biospec.com |
| Microfuge 18 Centrifuge | Beckman Coulter | F241.5P | www.beckmancoulter.com |
| Microplate Spectrophotometer | BioTek | EPOCH | www.biotek.com |
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