Summary
التحول Biolistic هو طريقة تستخدم لتوليد التكامل مستقر من الحمض النووي في الجينوم من الانتهازية الأدعومية الممرض المستخفية من خلال إعادة التركيب مثلي. وسوف نظهر التحول biolistic من بناء، والتي لديها خلات كيناز ترميز الجينات تنصهر إلى العلامة فلوري mCherry إلى C. الأدعومية.
Abstract
وbasidiomycete المستخفية المورمة، وهو ممرض الانتهازية الغازية من الجهاز العصبي المركزي، هي السبب الأكثر شيوعا لالتهاب السحايا الفطرية الناتجة في جميع أنحاء العالم في أكثر من 625،000 حالة وفاة سنويا في جميع أنحاء العالم. وعلى الرغم من وضعت Electroporation للللتحول من البلازميدات في المستخفية، ويوفر تسليم biolistic فقط وسيلة فعالة لتحويل DNA الخطية التي يمكن دمجها في الجينوم عن طريق إعادة التركيب مثلي.
وقد تبين خلات أن يكون المنتج التخمير كبير خلال العدوى بالمستخفيات، ولكن أهمية هذا ومن غير المعروف حتى الان. وهناك مسار البكتيريا تتكون من الانزيمات زايلولوز-5-فوسفات / الفركتوز-6-فوسفات فسفوكيتولاز (XFP) وكيناز خلات (ACK) هو واحد من ثلاثة مسارات محتملة لإنتاج خلات في C. الأدعومية. هنا، علينا أن نظهر التحول biolistic لبناء،الذي الجين ترميز ACK تنصهر إلى العلامة الفلورسنت mCherry، إلى C. الأدعومية. نحن بعد تأكيد تكامل الانصهار ACK -mCherry في موضع ACK.
Protocol
ويرد المخطط العام لهذا البروتوكول في الشكل رقم 1: ملاحظة.
1. C. إعداد الأدعومية
- لكل رد فعل التحول، وتنمو 2-3 مل O / N ثقافة C. الأدعومية في YPD المتوسطة في 30 ° C تهتز في 250 دورة في الدقيقة.
- الطرد المركزي O / N الثقافة لمدة 5 دقائق في 900 x ج في 10 ° C وتجاهل طاف.
- و resuspend كل بيليه الخلية في 300 ميكرولتر من ببتون الخميرة سكر العنب (YPD) متوسطة.
- باستخدام الخرز والزجاج، وامتدت بلطف 300 ميكرولتر من تعليق الخلية غسلها على YPD أجار التي تحتوي على 1 M السوربيتول.
- السماح لوحات لتجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-4 ساعة.
2. الذهب ناقل دقيق التحضير
- و resuspend 0.25 غرام من 0.6 ميكرون حبات الذهب في 1 مل من DDH 2 O، الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 900 x ج لتكوير حبات، وإزالة طاف.
- resuspend والخرز الذهب في 1 مل من الإيثانول بنسبة 100٪. </ لى>
- توزيع حبات الى 4 أنابيب، 250 ميكرولتر لكل منهما، وإضافة 750 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪.
- متجر مأخوذة الذهب حبة في 4 درجات مئوية.
3. إعداد DNA
- إعداد البرتقال أقراص macrocarrier biolistic التي غمر بها في الإيثانول بنسبة 100٪ باستخدام ملقط. أقراص مكان في طبق بتري كبير يحتوي على drierite لتجف (تأكد من drierite لا تلمس أسطوانة).
- الجاف مرة واحدة، اضغط على أقراص macrocarrier إلى أصحاب الفضة القرص (محو سابقا إلى أسفل مع الإيثانول بنسبة 100٪).
- الخرز دوامة الذهب (أعدت كما في الخطوة 2) وقسامة 12 ميكرولتر إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge، أنبوب واحد في التحول.
- إضافة إلى كل أنبوب من أجل: 2 ميكروغرام من الحمض النووي (ويفضل 2 ميكرولتر من 1 ميكروغرام / ميكرولتر من DNA)، و 10 ميكرولتر 2.5 M CaCl 2، وقاعدة حرة 2 ميكرولتر 1 M سبيرمدين.
- إعداد سيطرة سلبية كما في الخطوة 3.4 ولكن مع عدم وجود الحمض النووي.
- دوامة كل أنبوب واحتضان عند درجة حرارة الغرفة ل5 دقائق. نفض الغبار بلطف كل أنبوب في بعض الأحيان إلى resuspend والخرز تسويتها خلال هذه الحضانة.
- أنابيب تدور في 225 x ج لمدة 30 ثانية لتكوير حبات الذهب المغلفة DNA. إزالة بعناية طاف (قبل pipetting أو الطموح) وتجاهل.
- Resuspend الخرز تماما في 600 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ من قبل pipetting ببطء صعودا وهبوطا.
- تدور الأنابيب في 225 x ج لمدة 30 ثانية لتكوير حبات من دون تغليف. إزالة بعناية وتجاهل طاف.
- resuspend والخرز الذهب المغلفة DNA في 8 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ من قبل pipetting ببطء صعودا وهبوطا.
- ماصة حبات الذهب المغلفة DNA على مركز القرص biolistic في 1 سم القطر والسماح ليجف.
ملاحظة: حلقة الذهب المجففة مرئية على مركز القرص biolistic تشير إلى أن تركيز كاف من حبات الذهب موجودا.
ملاحظة: أقراص macrocarrier محملة حبات الذهب المغلفة DNA هي الآن جاهزة للاستخدام مع مدفع الجينات.
4. Operating الجينات بندقية
- بدوره على مضخة فراغ.
- بدوره على غاز الهيليوم من خلال تحويل مقبض عكس عقارب الساعة حتى ضغط ما يقرب من 2،200 رطل يتم التوصل على مقياس الضغط.
- بدوره على بندقية الجينات عن طريق التقليب التحول الأحمر على اليسار.
- تأكد من أن معدلات التدفق للفراغ وتنفيس يتم تعديل ذلك الفراغ سوف تصل إلى 28 بوصة زئبق خلال 15 ثانية.
- تأكد من أن المسافة بين القرص تمزق وmacrocarrier ما يقرب من 3/8 بوصة.
- تنظيف الغرفة بأكملها من خلال مسح أسفل مع الايثانول.
- غمر أقراص تمزق في الإيثانول بنسبة 100٪. السماح ليجف على سطح معقم (على سبيل المثال، طبق بتري).
- استخدام وجع عزم الدوران لتخفيف حامل القرص تمزق. إدراج قرص تمزق نظيفة في حامل. المسمار حامل القرص تمزق العودة الى المكان وتشديد مع عزم دوران وجع بتحويلها مرة واحدة إلى اليمين.
سيتم استبدال أقراص تمزق بعد كل تبادل لاطلاق النار: ملاحظة. - غمر عشرشاشات شبكة الإلكترونية في الإيثانول بنسبة 100٪. السماح ليجف على سطح معقم (على سبيل المثال، طبق بتري).
- الجاف مرة واحدة، ووضع شاشة شبكة غسلها على البيضاء لوحة التركيب البلاستيك. ضع القرص macrocarrier الجانب DNA حامل أسفل الى غرفة القرص. المسمار على الغطاء الفضي، ووضع لوحة التركيب في أعلى فتحة.
ملاحظة: سيتم استبدال شاشة شبكة بعد كل تبادل لاطلاق النار. - وضع لوحة YPD أجار التي تحتوي على 1 M السوربيتول على لوحة أسفل.
- اغلاق باب الغرفة وقفل في مكانه.
- دفع مع الاستمرار على مفتاح أحمر الأوسط يصل إلى الانخراط فراغ والسماح للفراغ لتصل إلى 28 بوصة زئبق. حالما يتم التوصل إلى مستوى فراغ السليم، نقل التبديل هذا الموضع الأسفل. عندما تصبح جاهزة، اضغط باستمرار على مفتاح أحمر على الحق في اطلاق النار. عندما ينبثق القرص تمزق، والإفراج فورا على زر اطلاق النار ودفع التحول الأحمر المتوسطة إلى موقف وسط للتنفيس عن الغرفة 0 رطل.
- تنظيف الحطام قرص تمزق وإيقاف بندقية الجينات. ثم إيقاف heliuالغاز م من خلال تحويل اتجاه عقارب الساعة مقبض الباب، وأخيرا، إيقاف مضخة فراغ.
5. خلايا التصفيحات حولت
- السماح لوحات التحول للجلوس في RT لمدة 4 ساعة للسماح للخلايا لاسترداد.
- ماصة 700 ميكرولتر من YPD على طبق. استخدام مكشطة خلية لكشط بلطف خلايا الخروج من السائل أجار وماصة في العقيمة 1.5 مل microfuge أنبوب. كرر هذه الخطوة لضمان تم انتشال جميع الخلايا من لوحة.
- بيليه الخلايا في 225 x ج لمدة 30 ثانية. إزالة وتجاهل طاف.
- Resuspend وبيليه في 500 ميكرولتر من YPD.
- ماصة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية على مركز للYPD + لوحات المضادات الحيوية وتنتشر باستخدام الخرز الزجاجي.
- ترك لوحات مقلوبة في RT لمدة 3-4 أيام. كما تظهر المستعمرات، والتصحيح على YPD الجديد + لوحات للمضادات الحيوية.
6. عزل الحمض النووي الجيني لPCR
ملاحظة: هذا هو نسخة معدلة باستخدام كاشفالصورة من مجموعة تنقية الحمض النووي (انظر الجدول من المواد).
- تنمو ثقافة 5 مل من كل من C. الأدعومية transformants في YPD السائل عند 30 درجة مئوية تهتز في 250 دورة في الدقيقة O / N.
- بيليه 3 مل من الخلايا في 900 x ج، و resuspend في 600 ميكرولتر من حل تحلل أنويتها.
- إضافة تعليق لأنبوب جديد microcentrifuge 1.5 مل مع 200 ميكرولتر من 0.5 ملم حمض غسلها الخرز الزجاجي.
- التجانس لمدة 45 ثانية في beadbeater صغيرة عند درجة حرارة الغرفة، أنبوب بارد على الجليد، وتكرار.
- السماح عينة ليستقر على الجليد لمدة 2 دقيقة ونقل طاف لأنبوب جديد 1.5 مل. إضافة 200 ميكرولتر من البروتين هطول الأمطار حل لكل أنبوب، (100 ميكرولتر لكل 600 ميكرولتر من طاف استرداد) ودوامة بقوة لمدة 20 ثانية.
- تسمح عينات ليستقر على الجليد لمدة 5 دقائق، والطرد المركزي في 11،000 x ج لمدة 3 دقائق.
- نقل طاف لتنظيف أنبوب 1.5 مل تحتوي على 300 ميكرولتر من RT الأيزوبروبانول. المزيج بلطف بواسطة انقلاب.
- عينات الطرد المركزي في 11،000 x ج لمدة 2 دقيقة، وإزالة بعناية طاف، واستنزاف الأنابيب على مناشف ورقية.
- إضافة 300 ميكرولتر من RT 70٪ من الإيثانول إلى كل أنبوب، وعكس بلطف لغسل بيليه.
- عينات الطرد المركزي في 11،000 x ج لمدة 2 دقيقة، وإزالة بعناية كل من الإيثانول.
- استنزاف أنبوب على مناشف ورقية نظيفة، والسماح للبيليه الهواء الجاف لمدة 10-15 دقيقة.
- إضافة 50 ميكرولتر من محلول معالجة الجفاف DNA و 1.5 ميكرولتر من حل ريبونوكلياز لكل بيليه ودوامة.
- عينات الطرد المركزي لمدة 5 ثانية لإزالة كل من السائل من الغطاء.
- احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- ترطيب الحمض النووي التي يحتضنها العينات عند 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- تحديد DNA طيفيا من خلال قياس الامتصاصية في 260 نانومتر (وهي A 260 قراءة 1.0 ما يعادل ~ 50 ميكروغرام / DNA المزدوج تقطعت بهم السبل مل)، واستخدام ما يصل إلى 200 نانوغرام في كل رد فعل PCR.
7. عزل الحمض النووي الريبي لعكس الناسخ-PCR.
- باستخدام طقم تنقية RNA (انظر الجدول المواد)، اتبع إرشادات الشركة المصنعة لعزل الحمض النووي الريبي من خلايا الخميرة باستخدام minibeadbeater.
- قياس تركيز الحمض النووي الريبي عن طريق قياس الامتصاصية في 260 نانومتر (وهي A 260 قراءة 1.0 ما يعادل ~ 40 ميكروغرام / مل واحد الذين تقطعت بهم السبل RNA).
- باستخدام عدة RT-PCR (انظر الجدول المواد)، اتبع إرشادات الشركة المصنعة لاقامة ردود الفعل RT-PCR مع ما يقرب من 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي. للنتائج التي تم الحصول عليها في هذه الدراسة، استخدم الاشعال المدرجة في الجدول 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتحول biolistic الناجح لC. ويمكن الحصول على الأدعومية باتباع هذا المخطط بروتوكول (الشكل 1). مع التحول biolistic، يشار إلى تبادل لاطلاق النار الناجح لحبات الذهب المغلفة من قبل خاتم من الذهب واضحة على لوحة بعد DNA هو النار (الشكل 2A). يجب أن تظهر المستعمرات في غضون 4 إلى 5 أيام عندما ترك في درجة حرارة الغرفة بعد طلاء الخلايا المستخرجة من لوحات السوربيتول YPD + 1M على وسائط انتقائية. يجب تحويل 2 ميكروغرام من الحمض النووي يؤدي في 20 و 30 مستعمرات (الشكل 2B). عندما تظهر المستعمرات، ينبغي restreaked على وسائل الإعلام انتقائية للمستعمرات فردية.
يمكن زراعة المستعمرات الفردية في وسائل الإعلام YPD، وكل من الحمض النووي RNA ويمكن عزل من هذه الخلايا وتحليلها من خلال PCR وRT-PCR لتأكيد التكامل السليم والتعبير. إذا تم استخدام هذا البروتوكول لالموسومة الانصهار الجين، كما في هذا المثال، فإن الاشعال يحتاج رس يصلب في المنطقة ترميز الجين من الفائدة (التمهيدي 2) وداخل المنطقة 3 'غير المكودة من الجينات في المصالح (التمهيدي 4) (الشكل 3A). مع هذا التصور، كان التسلسل في تضخيم الحمض النووي من رد فعل PCR لتأكيد آخر الذي تنصهر العلامة mCherry في الإطار إلى الجين ACK. ومن شأن تأكيدا PCR الإيجابي يكون أكبر منتج PCR من الحمض النووي معزولة عن الخلايا تحولت مقارنة الحمض النووي معزولة عن خلايا نوع البرية. سيحتاج رد فعل آخر PCR أيضا إلى أن تتم الاستفادة من مجموعة التمهيدي (الاشعال 2 & 5) حيث anneals التمهيدي واحد خارج من بناء وداخل الجينوم المحيطة بها (التمهيدي 5) لتأكيد إعادة التركيب الصحيح في الموضع المطلوب (التمهيدي 7 في الجدول 1) (الشكل 3B). وسوف تستخدم RT-PCR للتأكد من أن كلا من الجينات في المصالح والعلامة كلاهما يجري التعبير عنه (الشكل 3C). تسلسل RT-PCR الانصهار المنتج ومؤشراتكيتس أن الوسم تنصهر بشكل صحيح لهذا الجين على مستوى الحمض النووي الريبي.
إذا تم استخدام هذا البروتوكول لضرب الجين من الفائدة، ومجموعات التمهيدي لPCR يجب أن تصمم بحيث التمهيدي واحد anneals لتسلسل الجينوم خارج حيث يجب إعادة تجميع بناء في الجينوم، والتمهيدي الآخرين anneals إما في المنطقة الترميز من الجينات أو في علامة انتقائية. ومن شأن تأكيدا الإيجابي الذي معاد للبناء بنجاح وبشكل صحيح في الجينوم يكون وجود المنتج الحجم الصحيح لمجموعة التمهيدي التي anneals داخل علامة ولكن ليس مع مجموعة التمهيدي التي anneals لهذا الجين من الفائدة. وينبغي بذل مجموعة أخرى التمهيدي الذي لديه التمهيدي واحد أن anneals خارج بناء تصميم، والذي يستخدم مع PCR لتأكيد أن هذا الحدث وقع إعادة التركيب في موضع الصحيح. في نفس التصميم لخلق بالضربة القاضية، يتم عزل الحمض النووي الريبي من كل من الخلايا تحولت والبرية من نوع (WT) الخلايا، وRT-PCR هو أجريت للتأكد من أن أي تعبير عن الجينات في المصالح ويلاحظ من الخلايا المتحولة.
لأنه لم تنصهر علامة فلوري إلى الجين ACK، أن إعادة التركيب كان تأكيد آخر على نجاح في مكان المطلوب ويتم ترجمة ذلك RNA إلى البروتين من خلال المجهر الفلورسنت (الشكل 4). من الناحية المثالية، وقد تم بالفعل إنشاء الظروف حيث أنه من المعروف أن البروتين من الفائدة يتم التعبير عنها. ومع ذلك، إذا كان إشارة الفلورسنت منخفضة جدا للاحتفال، وهناك احتمال أن إعادة التركيب الناجح لا يزال حدث، ولكن تحتاج إلى تغيير في فرصة التي لم يتم الوفاء الظروف المثلى للتعبير كافية، الأمر الذي يؤدي إلى انخفاض الفلورسنت ظروف النمو إشارة. وهذا من شأنه تحتاج إلى تأكيد من خلال وسائل أخرى مثل وصمة عار الغربية.
"/>
الشكل 1. مخطط البروتوكول.
الشكل 2A. حبات الذهب المغلفة بالرصاص DNA بنجاح على طبق من ذهب السوربيتول YPD + 1M. هو التصحيح البرتقال ينظر في وسط لوحة السوربيتول YPD + 1M يرجع ذلك إلى حبات الذهب المغلفة الحمض النووي، مشيرا إلى إعداد الذهب السليم، فضلا عن تبادل لاطلاق النار الناجح . الشكل 2B. تحويل 2 ميكروغرام من نتائج فحص الحمض النووي في 20-30 المستعمرات في لوحة. إذا كانت تضعف الخلايا كما هو مذكور في بروتوكول، ومن المتوقع قبل الطلاء على وسائل الإعلام الانتقائي حوالي 20-30 المستعمرات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3A. التخطيطي لACK: mCherry:.. بناء الجدد والتصميم التمهيدي الشكل 3B PCR تستخدم لتأكيد نجاح إعادة التركيب مثلي. الممرات 1 و 2: المنتجات PCR تم الحصول عليها باستخدام بادئات 2 و 5 (الجدول 1) مع الحمض النووي الجيني من النوع البري C. الأدعومية H99 (حارة 1) وACK: سلالة mCherry تحولت، (حارة 2). الأحجام المتوقعة هي 1511 حتى 5622 سنة مضت، على التوالي. الممرات 3 و 4 هي المنتجات DNA من C. الأدعومية H99 (حجم المتوقع 1443 بي بي) وACK: mCherry (حجم المتوقع 5552 بي بي) سلالات، على التوالي، وذلك باستخدام الاشعال 2 و 4 في الجدول رقم 1. الممرات 5 و 6 هي المنتجات DNA من C. الأدعومية H99 (لا ينبغي أن يصلب) وACK: mCherry (يتوقع حجم 3016 بي بي) سلالات، على التوالي، وذلك باستخدام الاشعال 1 و 3. الشكل 3C RT-PCR تأكيد التعبير عن العلامة mCherry. أعلى الممرات هي المنتجات [كدنا من الانصهار المنتج ACKmCherry (يتوقع حجم 683 بي بي) تضخيمها من C. الأدعوميةH99 وACK: سلالات mCherry باستخدام بادئات 2 و 3 في الجدول 1 أدرج هذا الجين الأكتين كعنصر تحكم وتتضخم تحت نفس الظروف التي ACKmCherry (حجم المتوقع 567 بي بي) باستخدام بادئات 6 و 7 في الجدول 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. الإسفار للmCherry الموسومة ACK. التحليل المجهري للسلالات إنتاج ACK تنصهر فيها على علامة mCherry مع الأمثل الإثارة في 587 نانومتر والأمثل الانبعاثات في 610 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| 1 | KI003 | 5 "- GTA GCG AGG TCT GGA AGC CAC - 3" |
| 2 | ACKmChRT-F | 5'- GCT TTG دول مجلس التعاون الخليجي GGT ACT ACC AAC -3 |
| 3 | ACKmChRT-R | 5'- GAC AGC TTC AAG TAG TCG GGG -3 " |
| 4 | KI004 | 5 "- GAC TTG GGG AAG AGG AAT TC - 3" |
| 5 | KI0032 | 5 "- CGG GGT ACC ATC AAT AAA AGC TTT CTT CAC TCC - 3" |
| 6 | الأكتين 1 | 5'- CGC TAT CCT CCG TAT CGA TCT TGC -3 " |
| 7 | الأكتين 2 | 5'- CAG CTG غا GGT AGA CAA AGA GGC -3 " |
الجدول 1. PCR وRT-PCR الاشعال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من الجوائز من مؤسسة العلوم الوطنية (جائزة # 0920274) وساوث كارولينا تجربة مشروع محطة SC-1700340. هذه الورقة isTechnical مساهمة رقم 6283 من محطة تجربة جامعة كليمسون. الكتاب أشكر الدكتور لوكاس Kozubowski للحصول على المشورة المفيدة له في تطوير هذا البروتوكول النهائي والدكتور شيريل انجرام سميث، كاتي جلين، وغريس Kisirkoi لقراءة نقدية لها من المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 μm gold beads | Bio-Rad | 165-2262 | http://www.bio-rad.com |
| Spermadine-free base | Sigma- Aldrich | S0266 | https://www.sigmaaldrich.com |
| G418 - Sulfate (Neomycin) | Gold Biotechnology | G-418-10 | www.goldbio.com |
| Hygromycin | Gold Biotechnology | H-270-1 | www.goldbio.com |
| 1350 psi Rupture Discs | Bio-Rad | 165-2330 | http://www.bio-rad.com |
| Stopping Screens | Bio-Rad | 165-2336 | http://www.bio-rad.com |
| Macrocarriers discs | Bio-Rad | 165-2335 | http://www.bio-rad.com |
| YPD Broth | Becton Dickinson & Co. | 242820 | www.bd.com |
| Agar | Becton Dickinson & Co. | 214530 | www.bd.com |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | http://www.fishersci.com |
| PDS-1000/He System | Bio-Rad | 165-2257 | http://www.bio-rad.com |
| Microscope | Zeiss | Axio | http://www.zeiss.com/microscopy |
| KOD One Step PCR Kit | EMD Millipore | 71086-4 | http://www.emdmillipore.com |
| One Step RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | www.qiagen.com |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | www.promega.com |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | www.qiagen.com |
| Mini Beadbeater - 1 | BioSpecs | 3110BX | http://www.biospec.com |
| Microfuge 18 Centrifuge | Beckman Coulter | F241.5P | www.beckmancoulter.com |
| Microplate Spectrophotometer | BioTek | EPOCH | www.biotek.com |
References
- Price, M. S., et al. Cryptococcusneoformans requires a functional glycolytic pathway for disease but not persistence in the host. MBio. 2, e00103-e00111 (2011).
- Bubb, W. A., et al. Heteronuclear NMR studies of metabolites produced by Cryptococcusneoformans in culture media: identification of possible virulence factors. Magn Reson Med. 42, 442-453 (1999).
- Himmelreich, U., et al. Identification of metabolites of importance in the pathogenesis of pulmonary cryptococcoma using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Microbes Infect. 5, 285-290 (2003).
- Wright, L., et al. Metabolites released by Cryptococcusneoformans var. neoformans and var. gattii differentially affect human neutrophil function. Microbes Infect. 4, 1427-1438 (2002).
- Hu, G., Cheng, P. Y., Sham, A., Perfect, J. R., Kronstad, J. W. Metabolic adaptation in Cryptococcusneoformans during early murine pulmonary infection. Mol Microbiol. 69, 1456-1475 (2008).
- Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. Acetate kinase: not just a bacterial enzyme. Trends Microbiol. 14, 249-253 (2006).
- Davidson, R. C., et al. Gene disruption by biolistic transformation in serotype D strains of Cryptococcus neoformans. Fungal Genet Biol: FG & B. 29, 38-48 (2000).
- Toffaletti, D. L., Rude, T. H., Johnston, S. A., Durack, D. T., Perfect, J. R. Gene transfer in Cryptococcusneoformans by use of biolistic delivery of DNA. J. Bacteriol. 175, 1405-1411 (1993).
- Edman, J. C., Kwon-Chung, K. J. Isolation of the URA5 gene from Cryptococcusneoformans var. neoformans and its use as a selective marker for transformation. Mol Cell Biol. 10, 4538-4544 (1990).
- Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. Complementation of a capsule-deficient mutation of Cryptococcus neoformans restores its virulence. Mol Cell Biol. 14, 4912-4919 (1994).
- Del Poeta, M., et al. Topoisomerase I is essential in Cryptococcusneoformans: role In pathobiology and as an antifungal target. Genetics. 152, 167-178 (1999).
- McClelland, C. M., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. High frequency transformation of Cryptococcusneoformans and Cryptococcusgattii by Agrobacteriumtumefaciens. Fungal Genet Biol:FG & B. 42, 904-913 (2005).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Nicola, A. M., Frases, S., Casadevall, A. Lipophilic dye staining of Cryptococcusneoformans extracellular vesicles and capsule. Eukaryot Cell. 8, 1373-1380 (2009).
