Summary
Dit manuscript beschrijft de productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een tissue engineered 3D-oesofageale construct bereid uit normale primaire menselijke slokdarm fibroblast en squameuze epitheelcellen gezaaid binnen een de-cellularized varkens schavot. De resultaten tonen de vorming van een volwassen gelaagd epitheel gelijk aan de normale menselijke esophagus.
Abstract
De incidentie van zowel esophageal adenocarcinoom en haar voorloper, Barrett's Metaplasie, snel stijgen in de westerse wereld. Verder esophageal adenocarcinoom in het algemeen een slechte prognose, met weinig verbetering in overleving afgelopen jaren. Dit zijn moeilijke omstandigheden te bestuderen en er is een gebrek aan geschikte experimentele platformen om aandoeningen van de slokdarm slijmvlies onderzoeken geweest.
Een model van de menselijke slokdarm slijmvlies is in de MacNeil laboratorium dat, in tegenstelling tot conventionele 2D celkweek systemen, recapituleert de cel-cel en cel-matrix interacties die in vivo en produceert een volwassen gestratificeerde epitheel vergelijkbaar met die van de normale menselijke ontwikkeling slokdarm. In het kort, het model maakt gebruik van niet-getransformeerde normale primaire menselijke esophagus fibroblasten en epitheelcellen gekweekt bij een-varken afgeleide acellulaire esophageal scaffold. Immunohistochemische karakterisering van dit modeldoor CK4, CK14, Ki67 en involucrine vlekken toont juiste herhaling van de histologie van het normale menselijke slokdarm slijmvlies.
Dit model verschaft een robuuste, biologisch relevant testmodel van het menselijke oesofageale slijmvlies. Het kan gemakkelijk worden gemanipuleerd om een aantal research vragen waarbij de effectiviteit van farmacologische middelen en het effect van blootstelling aan milieufactoren zoals alcohol, toxinen, hoge temperatuur of gastro-oesofageale refluxaat componenten onderzoeken. Het model maakt ook langere kweek niet worden bereikt met conventionele 2D celkweek, waardoor onder meer de studie van de effecten van herhaalde blootstelling van een volwassen epitheel aan het agens van belang tot 20 dagen. Verder zijn diverse cellijnen, zoals die afgeleid van oesofageale tumoren of Barrett's metaplasie kan worden in het model opgenomen processen als tumorinvasie en drugs responsivene onderzoekenss in een biologisch relevante omgeving.
Introduction
Het oesofageale slijmvlies omvat een gelaagd, plaveiselepitheel boven een laag van bindweefsel, de lamina propria, en is één van de eerste locaties aan geconsumeerde milieustressoren tegenkomen. Blootstelling aan voedingstoxines is betrokken bij het ontstaan van slokdarmkanker squameus carcinoom, terwijl duodenogastro-oesofageale reflux is een kritische factor in de pathogenese van Barrett's metaplasie die is geassocieerd met een verhoogd risico om esophageal adenocarcinoom. Oesofageale carcinomen zijn de 8e meest voorkomende kwaadaardige tumor in het Verenigd Koninkrijk mannen en slokdarmkanker adenocarcinoom neemt snel toe in de westerse wereld 1. Verder is er weinig verbetering in ziekteprognose, met een totale 5-jaars overlevingspercentage van ongeveer 15% geweest. Er is daarom behoefte experimenteerplatforms het effect van blootstelling aan milieustressoren deze esophagus epithelium en hun mogelijke betrokkenheid bij de ontwikke onderzoekenpment van metaplasia of neoplasie.
Hoewel geïmmortaliseerde of tumorcellijnen kunnen onderzoekers om de respons van epitheelcellen deze stressoren in vitro bestuderen, blijven ze proliferatieve en niet te differentiëren in de rijpe epitheelcellen op de bovenste lagen van de oesofageale slijmvlies. Voorts kunnen cellijnen die al tumorigenese hebben ondergaan slechts beperkte informatie over de eerste reacties van normale cellen in het epitheel milieufactoren verschaffen; en dit is de fase waarin de mogelijkheden voor therapeutische interventie hoogst kunnen zijn. Tenslotte conventionele celkweek systemen niet de potentieel belangrijke interacties tussen epitheliale en mesenchymale cellen en tussen cellen en de omringende matrix die binnen de weefsels in vivo te vangen.
Diermodellen een meer realistische micro-omgeving voor het bestuderen van de reacties van de slokdarm epithelium en kan de kunstmatige inductie van gastro-oesofageale refluxziekte 2 op te nemen. Het kan echter een grotere uitdaging om de milieu stressoren in deze modellen te manipuleren zijn en ze kunnen niet volledig de reactie binnen het menselijke slokdarm vertegenwoordigen.
Andere experimentele menselijke esophagus modellen ontwikkeld dat primaire cellen, geïmmortaliseerde cellen of tumorcellijnen gebruik op een collageen of gecombineerde collageen / Matrigel, scaffold met fibroblasten 3,4. Het is minder arbeidsintensief deze scaffolds dan acellulaire esophageal scaffold in dit manuscript beschreven genereren en deze organotypische modellen verschaffen een nuttig hulpmiddel, met name in de studie van tumorinvasie 5,6, waarbij tumorcelinfiltratie in de collageengel gemakkelijk kan worden waargenomen. Maar deze collageen gels hebben niet-inheemse mechanische eigenschappen en gebrek aan bepaalde kenmerken van het oorspronkelijke weefsel, met inbegrip van een specifiek basaal membraan en de appropriate oppervlaktetopografie. Dit kan het gedrag van cellen resulterend in beïnvloeden, bijvoorbeeld slechtere hechting tussen epitheel en scaffold bij gebruik van een collageengel scaffold 7. Bijgevolg zijn de acellulaire varkens esophageal scaffold ontwikkeld met het voordeel dat een biologisch realistische scaffold en dus meer geschikt voor gebruik als experimenteel platform. Ook is gebleken dat het beter is om primaire cellen nemen in de esophagus constructen dan geïmmortaliseerde slokdarm epitheliale cellijnen zoals Het-1A, aangezien deze cellen vormen een gelaagd epitheel maar niet om stratificeren en differentiëren 4,7,8 .
Bijgevolg is dit protocol werd aangepast van een methode die al in gebruik in de MacNeil laboratorium voor het maken van tissue engineered huid en het mondslijmvlies 9,10 en bevat een de-cellularized varkens slokdarm steiger in combinatie met primaire menselijke slokdarm epitheliale cellen en fibroblasten. This protocol vormt een volwassen gestratificeerde epitheel, vergelijkbaar met die van de normale menselijke esophagus zoals blijkt uit CK4, CK14, Ki67 en involucrine kleuring. Het resulterende model biedt een experimenteel platform voor reacties op milieustressoren studeren, en daadwerkelijk is gebruikt om veranderingen in genexpressie te onderzoeken in de slokdarm epitheel in reactie op de onderdelen 11 refluxaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menselijke slokdarm cellen worden verkregen van patiënten die maag of slokdarm operatie. Geïnformeerde toestemming is verkregen voor het weefsel te worden gebruikt voor onderzoeksdoeleinden, en het weefsel anoniem gebruikt onder de juiste ethische goedkeuringen (SSREC 165/03, Human Research Tissue Bank Licence 12179).
1. Isolatie van de Mens Slokdarmkanker epitheelcellen
- Werken in een laminaire stroming weefselkweek kap en met steriele techniek bereidt de epitheliale kweekmedium door menging Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) en Ham's F12 in een 3: 1 verhouding (v: v). Voeg 10% (v / v) FCS, 10 ng / ml epidermale groeifactor, 0,4 ug / ml hydrocortison, 1,8 x 10 -4 M adenine, 5 ug / ml insuline, 5 ug / ml transferrine, 2 x 10 -7 M triiodothyronine, 1 x 10 -10 M choleratoxine, 2 x 10 -3 M glutamine, 100 IU / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, en 0,625 ug / ml amfotericine B.
- Met behulp van standaardsteriele technieken, zet 11 ml DMEM, 10% FCS, 2 x 10 -3 M L-glutamine, 100 IU / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, en 0,625 ug / ml amfotericine B in een T75 weefselkweek kolf. Voeg 1 x 10 6 lethaal bestraalde 3T3 fibroblasten 12 in 1 ml van hetzelfde medium en incubeer overnacht bij 37 ° C in een 5% CO 2, vochtige atmosfeer. Dit zal een voederlaag voor de volgende kweken van epitheliale cellen.
- Met behulp van een scalpel en naar aanleiding van de aanbevelingen van een histopathologist, ontleden een ongeveer 2 cm 2 monster van weefsel uit de ziektevrije achtergrond regio oesofageale plaveiselcelcarcinoom slijmvlies verkregen van patiënten die maag- of slokdarmkanker operatie. Transport naar het laboratorium in een 50 ml container steriel transportmedium (PBS 100 IU / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 0,625 ug / ml amfotericine B) bij kamertemperatuur.
- Op dit moment, bewaar het weefsel in de transportmedium tot 12 uur (overnacht) bij 4 ° C, gemakshalve; echter niet langer opslagfunctie gebruikt omdat zij leiden tot verminderde levensvatbaarheid van de cellen.
- Werken in een laminaire stroming weefselkweek kap en met steriele techniek steriliseren een scalpel door het weken in 70% ethanol gedurende 5 minuten. Spoel in steriele PBS.
- Plaats het weefsel in een steriele petrischaal en gebruik de scalpel te snijden in 0,5 cm strips. Voeg 5 ml 0,1% (gew / vol) trypsine in PBS om de petrischaal, plaats het deksel op de schaal en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Voeg 5 ml FCS aan het weefsel in de petrischaal om het trypsine te remmen. Houd de strook van weefsel met een steriel pincet, voorzichtig schrapen de epitheliale oppervlak met de scalpel voor 1-2 min per strip aan de epitheliale cellen in het omringende medium te verwijderen. Verwijder de geschraapt weefsel en zet apart. Herhaal deze procedure voor alle weefselstrips.
- Verzamel het medium dat het vrijstaande epitheliale cellen in een 15 ml centrifugebuisen centrifuge (5 min, 200 x g). Giet het supernatant en resuspendeer de pellet in 12 ml van epitheliale medium (beschreven in stap 1.1).
- Giet af en het medium uit de feeder cellaag in de T75 fles bereid in stap 1.2 weggooien. Gebruik een steriele pipet om de celsuspensie die de vers geïsoleerde epitheelcellen aan de kolf en incubeer bij 37 ° C in een 5% CO 2, vochtige atmosfeer.
- Na 24 uur giet af en gooi het kweekmedium, die ook de cel puin zal bevatten, en te vervangen door 12 ml vers epitheliale medium. Verder incuberen bij 37 ° C in een 5% CO 2, vochtige atmosfeer. Kolonies zullen beginnen te verschijnen in de volgende 24 tot 48 uur en kan worden bekeken door het plaatsen van de kolf onder een standaard lichtmicroscoop. Giet het verbruikte kweekmedium en vervangen door een gelijk volume vers medium elke 2-3 dagen.
- Zodra de kolf 80% confluentie, passage van de cellen 13 bereikt. Splits de cells in een verhouding van 1: 5 tot celaantallen te verhogen voor toepassing bij het model. Volg stap 1,2 tot voedingslagen van bestraalde 3T3 cellen vast in elke kolf die wordt ontvangen epitheelcellen 24 uur vóór passage van de cellen.
Opmerking: Gebruik de epitheelcellen in de slokdarm model hieronder beschreven tussen passages 1 en slechts 4.
2. Isolatie van Human Slokdarmkanker fibroblasten
- Werken in een laminaire stroming kabinet en het gebruik van steriele techniek, neem de opzij gezet in stap 1.7 weefsel. Leg ze in een steriele petrischaal en gehakt fijn door te hakken met een steriele scalpel. Voeg 10 ml 0,5% (w / v) collagenase A oplossing en plaats het deksel op de petrischaal en incubeer bij 37 ° C geïncubeerd in een 5% CO 2, vochtige atmosfeer.
- Breng het digest op een 15 ml centrifugebuis en gecentrifugeerd (10 min, 200 x g), giet uit de bovenstaande vloeistof en resuspendeer de pellet in 10 ml van fibroblast kweekmedium (DMEM 10% FCS, 2 x 10 -3 M L-glutamine, 100 IU / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, en 0,625 ug / ml amfotericine B).
- Plaats de suspensie in een T75 kolf en geïncubeerd bij 37 ° C in een 5% CO 2, vochtige atmosfeer. Na 24 uur giet het medium, dat puin zal bevatten en te vervangen door 12 ml vers fibroblast medium. Vervang het kweekmedium om de 2 tot 3 dagen en passage cellen eenmaal ze 80% confluentie 13 bereikt, splitsing van de cellen in een 1: 5 verhouding celaantallen stijgen.
Opmerking: Gebruik de fibroblast cellen in de hieronder beschreven tussen passages 4 en slechts 10 model.
3. Voorbereiding van de De-cellularized Slokdarmkanker Steiger
- Verkrijgen intact esophagi varkens in het slachthuis van vers geslachte Landrace varkens die worden gebruikt voor de productie van levensmiddelen. Een enkele slokdarm voldoende steigers voor ongeveer 30 afzonderlijke constructies.
Let op: Als gevolg van de uitgebreide en tijd consuming sterilisatie protocol vereist, is het normaal de moeite waard het verkrijgen en verwerken van een minimum van 10 esophagi in een keer. - Onmiddellijk plaatsen van de vers uitgesneden slokdarm naar een 180 ml steriele pot met ongeveer 150 ml 10% povidon-joodoplossing gedurende 5 min elke verontreinigende microbiële reduceren. Breng de slokdarm naar een tweede pot die ongeveer 100 ml steriel PBS bevattende 200 IU / ml penicilline, 200 ug / ml streptomycine, en 1,25 ug / ml amfotericine B.
- Plaats de deksel op de houder en transporteren esophagi naar het laboratorium bij kamertemperatuur. Twee of drie esophagi kan in elke container, afhankelijk van hun grootte.
- Eenmaal in het laboratorium, het handvat van het weefsel in een laminaire stroming kap met behulp van een aseptische techniek om microbiële besmetting te minimaliseren. Steriliseer pincetten, scharen en scalpelbladen door onderdompeling gedurende 5 minuten in 70% ethanol, en spoelen in steriel PBS.
- Behandel de esophagus met steriele pincet. Met behulp van de schaar, de lengte opengesneden de slokdarm. Spoel het weefsel door het plaatsen van de slokdarm naar een 180 ml steriele pot die ongeveer 100 ml steriel PBS en voorzichtig schudden om vuil te verwijderen.
- Reinig een kurk dissectie board door te besproeien rijkelijk met 70% ethanol en laten drogen.
- Verwijder de slokdarm van de PBS, en het gebruik van steriele naalden, pin uit de slokdarm op het bord, slijmvliesoppervlak bovenste. Pak het mucosale oppervlak aan één uiteinde van de slokdarm met steriele pincet en weg te trekken van het bord. Hierdoor wordt het slijmvlies te scheiden van de onderliggende submucosa.
- Vervolgens een steriele scalpel de slokdarm longitudinaal ontleden langs de lamina propria, verwijderen kunnen de dissectie vordert om de mucosa weg te heffen.
- Bewaar de ontleed slijmvlies en de onderliggende submucosa weggooien.
- Knip en gooi de meest proximale en distale 2 cm van tHij mucosa aangezien er een groter aantal submucosale klieren en een dikkere lamina propria in die gebieden, respectievelijk 7.
- Met een scalpel om de resterende weefsel in 5 cm2 gesneden. Plaats alle de cut weefsel in een 180 ml steriele pot met ongeveer 150 ml steriele PBS en schud voorzichtig om het weefsel te spoelen. Indien voor meer dan vijf esophagi tegelijk kan het noodzakelijk zijn om meerdere potten daarvan en de drie daaropvolgende stappen gebruikt.
- Met steriele pincet, breng de gesneden weefsel in een 180 ml pot met 150 ml steriel 1 M NaCl, 200 IU / ml penicilline, 200 ug / ml streptomycine en 1,25 ug / ml amfotericine B. Incubeer gedurende 72 uur bij 37 ° C.
- Plaats het weefsel in een frisse 180 ml pot met 150 ml steriel PBS. Het epitheel is begonnen zichtbaar te scheiden van het onderliggende weefsel. Zachtjes schil de los epitheel van het varken slokdarm met steriele pincet en weggooien.
- Overgebleven tkwestie in een frisse 180 ml pot en voeg 150 ml steriele PBS. Schud zachtjes gedurende 5 min te wassen. Giet het PBS en herhaal nog tweemaal met verse PBS.
- Doe alle weefsel in een 500 ml glazen flesje met 400 ml steriel 80% (v / v) glycerol oplossing gedurende 24 uur bij kamertemperatuur geroerd. Breng 400 ml van steriele 90% (v / v) glycerol oplossing gedurende nog eens 24 uur.
- Bewaren in 400 ml steriele 100% glycerol oplossing bij kamertemperatuur gedurende ten minste 4 maanden uitdrogen en steriliseren weefsel terwijl de integriteit van de basaalmembraan.
4. De productie van de Cultuur Media
- Bereid gechelateerde pasgeboren kalfsserum voor toepassing in het kweekmedium.
- Giet 100 g Chelex 100 in een glazen 1 liter fles en voeg gedeïoniseerd water. Het exacte volume is niet kritisch, maar voldoende water worden toegevoegd aan de Chelex poeder bedekken. Voeg een magnetische roerder en steriliseren in de autoclaaf (121 ° C gedurende15 min).
- Laat de fles af te koelen en de Chelex om zich te vestigen. In een laminaire flowkast giet het overtollige water, voeg 500 ml pasgeboren kalverserum (NCS) en laat een nacht roeren bij 4 ° C.
- Stop met roeren en laat het Chelex om zich te vestigen, dit kan tot 30 min. In een laminaire flowkast decanteer het gechelateerde serum met een steriele pipet, verzorgen de Chelex en opslag niet te verstoren in 10 ml porties bij -20 ° C.
- Bereid drie verschillende media in een laminaire stroming kast, te beginnen met de pro-proliferatieve en eindigend met pro-differentiatieve formuleringen.
- Bereid Composite Medium I bestaat uit DMEM en Ham F12 in een 3: 1 verhouding (v: v), 4 x 10 -3 M L-glutamine, 0,5 ug / ml hydrocortison, 1 x 10 -4 M O -phosphorylethanolamine, 2 x 10 -12 M triiodothyronine, 1,8 x 10 -4 M adenine, 1,88 x 10 -3 M CaCl 2, 4 x 10 -12 M progesteron, 10 ug / ml inSulin, 10 gg / ml transferrine, 10 ng / ml seleen, 1 x 10 -3 M ethanolamine en 0,1% (v / v) gecheleerd NCS.
- Bereid Composite Medium II Composite Medium I dan vervangen gechelateerde serum met 0,1% (v / v) niet-gechelateerde NCS.
- Bereid Composite Medium III Composite Medium II welaten progesteron en verhoging serum 2% (v / v) niet-gechelateerde NCS.
5. De productie van de Human Esophageal Mucosa Model
- Voer alle werkzaamheden in een laminaire stroming kap, met behulp van aseptische techniek om een steriele omgeving te behouden. Steriliseer alle gereedschappen door het weken in 70% ethanol gedurende 5 minuten, voor het spoelen in steriel PBS.
- De dag voordat het nodig is, hydrateren de acellulaire varkens esophageal scaffold. Een stuk van scaffold vereist voor elke construct wordt bereid.
- Om het weefsel plaats voldoende stukken van varkens steiger hydrateren in een pot met 100 ml steriel PBS, ageren en genieten voor de 10 min. Decant de PBS en te vervangen door verse PBS. Herhaal het wasproces vijfmaal verwijdering van alle sporen glycerol te verzekeren.
- Test de steiger steriliteit door het incuberen van het weefsel overnacht gerehydrateerd in 100 ml DMEM bij 37 ° C. Als er geen verandering in de kleur of troebelheid van het kweekmedium aan het eind van de incubatieperiode het skelet wordt verondersteld steriel zijn. Zodra steriliteit is bevestigd, plaatst de 5 cm 2 acellulaire scaffold in een 6 wei-plaat, submucosale kant naar boven.
- Plaats een steriele chirurgisch stalen ring (inwendige diameter 10 mm, uitwendige diameter 20 mm) op het midden van elke steiger en voorzichtig aandrukken met steriele forceps, een voldoende afdichting met het weefsel te verzekeren.
- Oogst de fibroblasten via trypsine-EDTA 13 om een celsuspensie te produceren. Tel de cellen met een hemocytometer 14. Centrifugeer de celsuspensie (10 min, 200 x g). Resuspendeer de celpellet in een Aangepast decorte volume van fibroblast medium tot een uiteindelijke celgetal van 2,5 x 10 6 cellen per ml produceren.
- Voeg 0,2 ml van fibroblast medium, dat 5 x 10 5 mens slokdarm fibroblasten, in elke ring. Bedek het hele gebied rond de buitenkant van de ring met ongeveer 2 ml van fibroblast medium. Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO 2, vochtige atmosfeer.
- Na 24 uur verwijdert de ringen en fibroblast medium en voeg ten minste 5 ml vers fibroblast medium aan elk putje zodat de steiger zich geheel in medium. Kweek gedurende 1 week bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde atmosfeer vervangen van het medium elke 2 tot 3 dagen.
- Na 1 week verwijder de 6 goed platen met de steigers om een laminaire overstroming kap, verwijder het medium en keer elke steiger met behulp van een steriel pincet, het plaatsen van het mucosale oppervlak bovenste. Dit tijdstip is aangeduid als dag 0.
- Plaats de stalen ringen aan het slijmvliesoppervlak in het midden vanhet weefsel in stap 5.4.
- Bereid de T75 kolven van epitheelcellen van 13 trypsine. Nadat de PBS te wassen en voorafgaand aan het toevoegen van trypsine-EDTA-oplossing, voeg 2 ml steriel 0,02% (w / v) EDTA-oplossing aan elke kolf. Incubeer gedurende 2 minuten bij 37 ° C. Tik op de kolf voorzichtig om selectief los de i3T3 feeder laag terwijl de epitheelcellen bevestigd.
Opmerking: Het is meestal niet praktisch of nodig patiënt overeenkomen met de epitheelcellen van de reeds opgenomen in het model de voorafgaande week fibroblasten. - Giet de EDTA-oplossing die het voederlaag toevoegen trypsine-EDTA-oplossing om de epitheelcellen 13 oogsten. Tel de cellen met een hemocytometer 14. Centrifugeer de celsuspensie (10 min, 200 x g). Resuspendeer de cel pellet in een geschikt volume van Composite Medium 1 tot een uiteindelijke celgetal van 5 x 10 6 cellen per ml produceren.
- Voeg 0,2 ml van Composite Medium I, met 1 x 10 6 epitheelcellen in de ring. Bedek het hele gebied rond de buitenkant van de ring met ongeveer 2 ml van Composite Medium I en plaats de constructen in de incubator bij 37 ° C in een 5% CO 2, vochtige atmosfeer.
- Na 24 uur (dag 1) verwijder de ringen en medium en voeg ten minste 5 ml vers Composite Medium I, zodat de steigers zijn geheel onder water en terug naar de incubator. Na nog eens 24 uur (dag 2) Verwijder het medium en vervangen door ten minste 5 ml Composite Medium II en zorgt op de steigers zijn geheel onder water en terug naar de incubator.
- Op dag 4 place steriele medische kwaliteit roestvrij staal gaas roosters (2 cm breed x 2 cm lang x 0,5 cm hoog), in de frisse 6 well platen, één per construct. Gebruik steriele pincet om de constructen te brengen op de bovenzijde van de stalen roosters, slijmvliesoppervlak boven.
- Voeg voldoende Composite Medium III zodat de vloeistof bereikt de onderzijde van de samengestelde, maar het oppervlakblootgesteld aan de lucht, zorgt dit ervoor dat het monster wordt op een lucht-vloeistof grensvlak. Het juiste volume medium gevraagd, zal variëren afhankelijk van de dikte van het skelet, het volume van de put en de precieze hoogte van de roestvrij stalen rooster.
- Handhaaf de samenstellingen bij een lucht-water grensvlak gedurende tussen 10 en 20 dagen (dag 14 tot dag 24), afhankelijk van de vereisten van het experiment. Vervang de Composite Medium III met vers medium elke 2 tot 3 dagen (maandag, woensdag, vrijdag is een gebruiksvriendelijke regime).
Let op: Na 5 dagen bij een lucht-vloeistof interface (Dag 9) de constructen hebben een voldoende rijp oesofageale epitheel worden gebruikt in experimenten van de invloed van omgevingsfactoren op de slokdarm epitheel. - Aan het eind van het experiment, bevestig de constructen voor histologische analyse en immunohistochemische kleuring 7 of extract eiwit 15 of RNA 11,16 van het epitheel voor verdere analysis. Desgewenst behoudt het geconditioneerde kweekmedium voor analyse van extracellulaire signaalmoleculen 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit manuscript beschrijft het proces benodigde getoond in schematische vorm in figuur 1, de cultuur 3D-modellen van de menselijke esophagus epithelium succes. Om de geschiktheid van het model te bevestigen als experimenteel platform histologische en immunohistochemische studies uitgevoerd vergelijken van de gekweekte normale humane weefsels esophageal squameuze slijmvlies.
Histologische evaluatie van het epitheel door de beschreven werkwijze wordt een volwassen, multi-layered, meerlagig plaveiselepitheel (figuur 2B) die vergelijkbaar is met die van de normale menselijke esophagus (figuur 2A), alhoewel dunnere (5-10 cellagen tegenover 10 tot 20 voor de normale slokdarm), met de cellen die geleidelijk aan vleien en uiteindelijk kernloze ze migreren naar het oppervlak.
Immunohistochemische karakterisatie van belangrijke merkers van proliferatie en differentiation tonen dat de microanatomie van het model epitheel is gelijk aan de normale menselijke esophagus epithelium. Vergelijkbare Ki67 expressie waargenomen in zowel de natieve slokdarm en het model epitheel, met kleuring beperkt tot een subset van cellen in de basale en onmiddellijk suprabasale lagen (Figuren 3A en 3B). Dit is analoog aan studies die melden dat minder dan 10% van de cellen vertonen doorgaans expressie van de proliferatie merker, Ki67, in de normale esophagus epithelium 18. CK4 wordt gewoonlijk uitgedrukt in gestratificeerde en kolomvormige epitheel maar is in het algemeen afwezig in de basale lagen terwijl CK14 alleen positief in de basale laag 19. In zowel de normale als model esophageal epitheel wordt CK14 waargenomen in alle cellen van de basale laag (Figuren 3D en 3E), terwijl CK4 waargenomen gehele epitheel uitzondering van de twee meest basale lagen (figuren 3G en
Pogingen om de primaire esophageal epitheelcellen vervangen geïmmortaliseerde esophageal epitheelcellen, zoals Het-1A, waren minder succesvol en produceerde geen geldig model van de normale esophagus epithelium. Meerlagig epitheel gevormd; maar de proliferatieve marker Ki67 werd gedurende het epitheel (figuur 3C) geen expressie gedetecteerd voor markers van differentiatie waargenomen (Figuren 3F, 3I en 3L), wat aangeeft dat de Het-1A cellen die een hyperproliferatieve epitheel zonder aanwijzingen voor normale stratificatie of rijping.
Echter, is het model geweestmet succes aangepast om tumorcellen te nemen door de vervanging van primaire epitheelcellen met ofwel slokdarmkanker adenocarcinoom (OE33) of plaveiselcelcarcinoom (OE21) cellen. Dit demonstreert de flexibiliteit van het model, waardoor het gebruik ervan in het onderzoek van een reeks oesofageale aandoeningen in verschillende stadia van de progressie door de opneming van een aantal verschillende cellijnen. Te zien is dat er een duidelijk verschil in de reacties van deze twee cellijnen. OE21 squameuze carcinoomcellen produceert een epitheel zichtbaar op het construct als gedefinieerd gele (Figuur 4A) met grote spleten in het epitheel (figuur 4B), waarschijnlijk disfunctionele celadhesie moleculen weerspiegelen. Waaronder OE33 adenocarcinoma cellen in het model leidt tot een grote hoeveelheid scaffold afbraak zichtbaar met het blote oog als een verdunning van de steiger na 2 weken groei aan het lucht / vloeistof-grensvlak (figuur 4C) en bevestigd in H + E analyseEen duidelijke vermindering van de dikte van het skelet in het gebied onder de cellen (Figuur 4D). Dit is waarschijnlijk een gevolg van een interactie tussen de tumorcellen en fibroblasten, omdat het skelet degeneratie niet wordt waargenomen in de afwezigheid van fibroblasten (Figuren 4E en 4F). We hebben soortgelijke effecten op tumorinvasie in de aanwezigheid en afwezigheid van fibroblasten in equivalente melanoom model 21 waargenomen.
Figuur 1: Schematische weergave van de productie van de oesofageale slijmvlies model menselijke esophagus fibroblasten gezaaid op het oppervlak van submucusweefsel de steiger en gedurende 7 dagen.. De scaffold wordt omgekeerd, menselijke slokdarm epitheliale cellen toegevoegd en gekweekt onder water gedurende 4 dagen. Het construct wordt verhoogd tot een lucht-water grensvlak gedurende tussen 10 en 20 days. Aan het einde van het experiment het construct verdere analyse zoals vereist kan ondergaan. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Vergelijking van epitheel geproduceerd esophageal model met normale menselijke esophagus epithelium H + E analyse van (A) normale menselijke esophagus epithelium en (B) esophagus epithelium gevormd in het model van de menselijke slokdarm slijmvlies.. Schaal bar is 500 pm. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.
Figuur 4: De opname van tumorcellijnen inde slokdarm model. De primaire epitheelcellen werden vervangen door de plaveiselcelcarcinoom cellijn, OE21 of de adenocarcinoom cellijn, OE33. Beelden tonen het construct met OE21 cellen (A) of OE33 cellen hetzij in combinatie met (C), of bij afwezigheid van (E) fibroblasten, voorafgaand aan bevestiging aan het eind van de kweekperiode. De epithelia inclusief OE21 (B) of OE33 cellen met (D) zonder of (F) fibroblasten worden gevisualiseerd door H + E kleuring. Schaal bar is 500 pm. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit manuscript beschrijft de productie en karakterisering van een biologisch relevante menselijke esophagus mucosale model geschikt voor gebruik als een experimenteel platform om het effect van blootstelling aan milieustressoren op de esophagus epithelium bestuderen.
De belangrijkste stappen voor de succesvolle productie van een humaan oesofageale slijmvlies model zijn: ervoor zorgen dat de meeste epitheelcellen proliferatieve blijven zitten en nog niet begonnen te differentiëren voordat ze zaaien op het schavot; het handhaven van een air-vloeistof interface voor de samengestelde correcte rijping van het epitheel te waarborgen; het handhaven van de steriliteit gedurende de verlengde kweekperiode.
Vanwege de beperkte hoeveelheden van humaan weefsel vindt celisolatie het niet algemeen mogelijk om voldoende cellen te verkrijgen van een enkel weefselmonster op vers geïsoleerde cellen zaad direct op de scaffold en dientengevolge een celexpansie phase vereist indien de cellen worden gekweekt in standaard 2D celkweekomstandigheden. Het is belangrijk dat proliferatieve cellen blijven gedurende deze periode. Dit wordt bereikt door ervoor te zorgen dat de kweken niet mogen volledige confluentie bereiken, waarvoor cellen in het model slechts tot passage 4 en zorgvuldig toezicht celmorfologie. Aldus cellen moeten de onderscheidende proliferatieve veelhoekige morfologie en de tight "geplaveide" pavement-achtige uiterlijk kenmerk van proliferatieve epitheelcellen in plaats van de diffuser verschijning waargenomen in kweken die zijn begonnen te differentiëren behouden. De tweede kritische stap wordt gecontroleerd door te verzekeren dat het celkweekmedium omvat het bovenoppervlak van de roestvrijstalen roosters gebruikt om de kweken tillen lucht-vloeistof interface, maar het bovenste oppervlak van het construct zelf niet ondergedompeld. De derde stap is afhankelijk van de strikte naleving van de uitgebreide sterilisatie protocol bij de productie van de de-cellularizedvarkens scaffold en het gebruik van goede steriele techniek gedurende het proces.
Onze resultaten tonen aan dat primaire humane oesofageale cellen dienen een normale, volwassen, gestratificeerde epitheel produceren. Als een geïmmortaliseerde cellijn werd gebruikt, alhoewel afgeleid van de menselijke esophagus epithelium, de cellen bleef proliferatieve en niet differentiëren tot een volwaardige gestratificeerde epitheel vormen. De resulterende epitheel kan niet worden gebruikt als bevredigend model voor de normale epitheel, waaruit de ongeschiktheid van de geïmmortaliseerde cellijn Het-1A voor toepassing in het model. Echter andere cellijnen zoals die afgeleid van oesofageale tumoren of Barrett's Metaplasie kan in het model worden opgenomen, hetzij in plaats van of in aanvulling op de primaire epitheelcellen modellen voor een studie op tumorprogressie, invasie en de reactie op farmacologische agentia.
Experimenten worden uitgevoerd met de slokdarm model simulate de blootstelling van de slokdarm op discrete, pulsatiele gebeurtenissen tijdens slikken of reflux. Dit wordt bereikt door herhaaldelijk dompelen de constructen in kweekmedium dat de verbinding (en) te testen en spoelen in PBS, voordat de construct een lucht-vloeistof grensvlak. De belichtingstijden en frequentie kunnen worden aangepast om het proces wordt gesimuleerd geven, zodat de epitheellaag wordt blootgesteld aan de omgevingsfactor (en) terwijl de kweek kan verder bij een lucht-vloeistof grensvlak. Deze werkwijze is gebruikt in ons laboratorium om het effect van reflux voor de normale esophageal epithelium, waarbij het model werd blootgesteld aan specifieke gastro-oesofageale reflux componenten gedurende 10 minuten twee keer per dag gedurende 11 dagen 11 onderzoeken. Alternatief kunnen de constructen worden blootgesteld aan voortdurende niveaus van milieustressoren door het opnemen van deze verbindingen in het kweekmedium. Aangezien het epitheel wordt blootgesteld aan een lucht-vloeistof interface voor het epithelium te rijpen en differentiëren behoren 7, is het niet mogelijk om continu onderdompelen constructen in het kweekmedium. Bijgevolg zal blootstelling aan de stressveroorzakende factor alleen via het submucosale oppervlak in deze experimenten, waarin de relevantie van resultaten verkregen kunnen beperken.
De techniek is arbeidsintensief en daardoor beter geschikt voor de screening van relatief beperkte aantal verbindingen. Dientengevolge, wanneer het model als experimenteel platform, dient eerst vooronderzoeken toepassing van conventionele celkweektechnieken een beperkt aantal condities voorafgaand identificeren verdere analyse met het meer fysiologisch relevante esophageal model 11 hier worden beschreven. Naast immunohistochemische analyse is het ook mogelijk geweest om veranderingen in de epitheliale genexpressieprofiel na blootstelling aan milieustressoren onderzoeken. Dit werd bereikt door handmatig te ontdoen van de epithelium, het extraheren van het RNA geconverteerd naar cDNA te isoleren van de genen worden tot expressie gebracht en analyseren van microarray te verkrijgen genexpressieprofielen 11. Hierdoor is het mogelijk om de beschikbare informatie van het model toenemen als experimenteel platform. Vroege veranderingen in de epitheliale genexpressieprofiel volgende gesimuleerde blootstelling aan gastro-oesofageale reflux zijn voorgesteld en uit deze resultaten nieuwe gebieden voorgesteld voor verder onderzoek bij het voorkomen van de ontwikkeling van Barrett's metaplasie de metaplastische voorloper OAC 11. Het model kan ook worden gebruikt om eiwitexpressie te bestuderen onder toepassing van werkwijzen zoals Western blot-analyse 15 en genexpressie middels Northern-blotanalyse 16. Bovendien studies van extracellulaire signaalmoleculen kunnen worden uitgevoerd op het kweekmedium 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zijn dankbaar dat de heer Roger Ackroyd, de heer Andrew Wyman en de heer Chris Stoddard, Consultant Chirurgen op Sheffield Teaching Hospitals NHS Foundation Trust, voor hun hulp bij het verwerven van slokdarmkanker weefselmonsters en hun steun aan ons werk. Wij danken Ashraful Haque voor zijn hulp opnemen tumorcellijnen in het model. Wij erkennen dankbaar financiële steun voor deze studie door subsidies van de Bardhan Research en Education Trust (BRET) en Yorkshire Cancer Research (YCR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | BD Biosciences | 215240 | Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilize. Warm in 37 °C water bath before use. |
| DMEM | Labtech | LM-D1112 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F12 | Labtech | LM-H1236 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Foetal Calf Serum | Labtech | FB-1090 | |
| Epidermal Growth Factor | R+D Systems | 236-EG-200 | Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS |
| Hydorcortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2767 | Prepare 10 mg/ml solution in 0.01 M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilize before use |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T2036 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | Prepare stock solution in water |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Brand name Fungizone |
| PBS | Oxoid | BR0014 | Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilize |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| Povidone-iodine solution | Ecolab | 10830E | Brand name Videne |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| Newborn calf serum | Gibco | 26010074 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use use |
| O-phosphorylethanolamine | Sigma-Aldrich | P0503 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Lonza | 17-838Z | Used for composite media preparation |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EDTA 0.02% solution | Sigma-Aldrich | E8008 | Warm in 37 °C water bath before use |
| T75 culture flask | VWR | 734-2313 | |
| 50 ml centrifuge tube | Fisher | 11819650 | |
| 15 ml universal tube | SLS | SLS7504 | |
| 180 ml pot | VWR | 216-2603 | |
| Petri dish | SLS | 150350 | |
| 6 well plate | VWR | 734-2323 | |
| stainless steel rings | Manufactured in house - medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm | ||
| steel mesh grids | Manufactured in house - sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2 cm (w) x 2 cm (d) x 0.5 cm (h) | ||
| ki67 | Novocastra | KI67-MM1-L-CE | Clone MM1. Use at 1:100. |
| CK4 | Abcam | ab9004 | Clone 6B10. Use at 1:200. |
| CK14 | Novocastra | LL002-L-CE | Clone LL002. Use at 1:200. |
| Involucrin | Novocastra | INV | Clone SY5. Use at 1:100. |
| OE21 | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| OE33 | Sigma-Aldrich | 96070808 | |
| Het-1A | ATCC-LGC | CRL-2692 | |
| Mouse 3T3 fibroblasts | ATCC-LGC | CRL-1658 | previously growth arrested by irradiation (60 Gy) |
References
- Pera, M., Manterola, C., Vidal, O., Grande, L. Epidemiology of esophageal adenocarcinoma. J. Surg. Oncol. 92 (3), 151-159 (2005).
- Manea, G. S., Lupusoru, C., Caruntu, I. D. Experimental study on the effect of bile, and bile and hydrochloric acid mixture on the esophageal mucosa. Rom. J. Morphol. Embryol. 50 (1), 61-66 (2009).
- Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 278 (3), 1824-1830 (2003).
- Underwood, T. J., et al. A comparison of primary oesophageal squamous epithelial cells with HET-1A in organotypic culture. Biol. Cell. 102 (12), 635-644 (2010).
- Nystrom, M. L., et al. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J. Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Okawa, T., et al. The functional interplay between EGFR overexpression, hTERT activation, and p53 mutation in esophageal epithelial cells with activation of stromal fibroblasts induces tumor development, invasion, and differentiation. Genes & Development. 21 (21), 2788-2803 (2007).
- Green, N., et al. The development and characterization of an organotypic tissue-engineered human esophageal mucosal model. Tissue Eng Part A. 16 (3), 1053-1064 (2010).
- Harada, H., et al. Telomerase induces immortalization of human esophageal keratinocytes without p16INK4a inactivation. Mol. Cancer Res. 1 (10), 729-738 (2003).
- Bhargava, S., Chapple, C. R., Bullock, A. J., Layton, C., MacNeil, S. Tissue-engineered buccal mucosa for substitution urethroplasty. BJU. Int. 93 (6), 807-811 (2004).
- Ralston, D. R., et al. Keratinocytes contract human dermal extracellular matrix and reduce soluble fibronectin production by fibroblasts in a skin composite model. Br. J. Plast. Surg. 50 (6), 408-415 (1997).
- Green, N. H., et al. Pulsatile exposure to simulated reflux leads to changes in gene expression in a 3D model of oesophageal mucosa. Int. J. Exp. Pathol. 95 (3), 216-228 (2014).
- Wang, C. S., et al. Selective culture of epithelial cells from primary breast carcinomas using irradiated 3T3 cells as feeder layer. Pathol. Res. Pract. 197 (3), 175-181 (2001).
- Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. J. Vis. Exp. (16), e755 (2008).
- Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2014).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N. Am. J. Med. Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat. Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Morgan, E., et al. Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clin. Immunol. 110 (3), 252-266 (2004).
- Xu, M., et al. The abnormal expression of retinoic acid receptor-beta, p 53 and Ki67 protein in normal, premalignant and malignant esophageal tissues. World J. Gastroenterol. 8 (2), 200-202 (2002).
- Moll, R., Divo, M., Langbein, L. The human keratins: biology and pathology. Histochem. Cell Biol. 129 (6), 705-733 (2008).
- Rice, R. H., Green, H. Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross-linked envelope: activation of the cross-linking by calcium ions. Cell. 18 (3), 681-694 (1979).
- Eves, P., et al. Melanoma invasion in reconstructed human skin is influenced by skin cells - investigation of the role of proteolytic enzymes. Clin. Exp. Metastasis. 20 (8), 685-700 (2003).
