Summary
Эта рукопись описывает производства, характеристика и возможности использования ткани инженерии 3D пищевода конструкта, полученного из нормальной первичной пищевода фибробластов человека и клеток плоского эпителия, посеянных в свиной эшафот де-cellularized. Полученные результаты показывают, формирование зрелого стратифицированного эпителия подобна нормальной человеческой пищевода.
Abstract
Заболеваемость как аденокарциномы пищевода и его предшественник, метаплазия Барретта, быстро растет в западном мире. Кроме того аденокарциномы пищевода, как правило, имеет плохой прогноз, с небольшим улучшением выживаемости в последние годы. Это трудные условия для изучения и было отсутствие подходящих экспериментальных площадок по расследованию нарушений слизистой оболочки пищевода.
Модель слизистой оболочки пищевода человека был разработан в лаборатории Макнил, который, в отличие от обычных систем 2D клеточной культуры, повторяет клетке-клетка и клетка-матрица взаимодействий, присутствующих в естественных условиях, и производит зрелый многослойный эпителий, аналогичной той, что нормального человека пищевода. Вкратце, эта модель использует нетрансформированные нормальные первичные фибробласты человека пищевода и эпителиальные клетки, выращенные в бесклеточной пищевода помост свиного происхождения. Иммуногистохимическое характеристика этой моделипо CK4, CK14, Ki67 и инволюкрина окрашивание демонстрирует соответствующий суммировании гистологии нормальной слизистой оболочки пищевода человека.
Эта модель обеспечивает надежную, биологически соответствующий экспериментальную модель слизистой оболочки пищевода человека. Это может быть легко манипулировать, чтобы исследовать ряд исследовательских вопросов, включая эффективности фармакологических агентов и последствий воздействия факторов окружающей среды, таких как алкоголь, токсины, высокая температура или желудочно-пищеводного компонентов рефлюксата. Модель также способствует длительные периоды не достижимые с обычным 2D культуры клеток, позволяя, в частности культуры, изучение влияния многократного воздействия зрелой эпителия агента интерес на срок до 20 дней. Кроме того, различные клеточные линии, такие как соли, полученные из опухолей или пищевода Барретта метаплазии, могут быть включены в модель, чтобы исследовать процессы, такие как инвазии опухоли и наркотиков responsiveneсс в более биологически соответствующий среде.
Introduction
Слизистой оболочки пищевода включает слоистую, плоскоклеточный эпителий выше слоя соединительной ткани, в собственной пластинке, и является одним из первых сайтов, сталкиваются попадании экологических стрессоров. Воздействие диетических токсинов участвует в развитии плоскоклеточного рака пищевода, в то время как duodenogastro-пищеводного рефлюкса является критическим фактором в патогенезе метаплазии Барретта, который связан с повышенным риском прогрессирования аденокарциномы пищевода. Пищевода карцином 8-й наиболее частой злокачественной опухоли в Великобритании мужчин и аденокарциномы пищевода быстро растет в западном мире 1. Кроме того, было небольшое улучшение прогноза заболевания в, с общим уровнем 5-летняя выживаемость составляет около 15%. Следовательно, существует потребность в экспериментальных площадок для расследования последствий воздействия экологического стресса на этом эпителия пищевода и их возможного участия в Develoмат ветствующую защитную эк метаплазии или неоплазии.
Несмотря на то, иммортализованных или опухолевых клеточных линий позволяют исследователей изучать реакцию эпителиальных клеток в этих стресса в пробирке, они остаются пролиферативной и не дифференцируются в зрелых эпителиальных клеток, найденных на самых верхних слоев слизистой оболочки пищевода. Кроме того, клеточные линии, которые уже подверглись туморогенез может обеспечить только ограниченную информацию о начальных ответов нормальных клеток в эпителии экологических факторов; и это этап, когда потенциал для терапевтического вмешательства может быть высокой. Наконец, обычные системы для культивирования клеток не в состоянии захватить потенциально важные взаимодействия между эпителиальных и мезенхимальных клеток и между этими клетками и окружающей матрицы, которые происходят в тканях в естественных условиях.
Животные модели обеспечивают более реалистичное микросреду для изучения реакции пищевода epitheliмкм и может включать искусственный индукцию желудочно-пищеводного рефлюкса 2. Однако он может быть более сложным, чтобы манипулировать экологических стрессоров в этих моделях, и они не могут в полной мере представлять ответ в человеческом пищевода.
Другие экспериментальные модели человека пищевода были разработаны, которые используют первичные клетки, иммортализованных клеток или клеточных линий опухоли на коллаген, коллаген или в сочетании / Матригель, содержащие каркас фибробласты 3,4. Это менее трудоемким, чтобы генерировать эти каркасы, чем бесклеточной пищевода помост, описанной в этой рукописи, и эти модели обеспечивают органотипической полезный инструмент, особенно при исследовании опухолевой инвазии 5,6, где опухоль клеточной инфильтрации в гель коллагена может быть легко наблюдается. Однако эти гели коллагена неродного механические свойства и не имеют определенные функции исходной ткани, в том числе конкретного базальной мембраны и appropriatе топографии поверхности. Это может влиять на поведение клеток, в результате, например, хуже адгезии между эпителием и строительные леса при использовании гель каркас коллагена 7. Как следствие был разработан бесклеточной свиного пищевода каркас, с тем преимуществом, что более реалистично биологически каркас и, таким образом, более подходящим для использования в качестве экспериментальной площадки. Кроме того, было показано, что лучше включать первичных клеток в пищеводе конструкций, чем иммортализованных пищевода эпителиальных клеточных линий, таких как Het-1A, так как эти клетки образуют многослойный эпителий, но не для стратификации или дифференциации 4,7,8 ,
Следовательно, этот протокол был адаптирован из метода уже используются в лаборатории Макнил для принятия тканей инженерии кожи и слизистой оболочки полости рта 9,10 и включает в себя свиной пищевода эшафот де-cellularized сочетании с первичных человеческих клетках эпителия пищевода и фибробластов. Тхис протоколом производит зрелый, стратифицированного эпителия, подобную нормальной человеческой пищевода, как продемонстрировано CK4, CK14, Ki67 и инволюкрина окрашивания. Полученная модель обеспечивает экспериментальную площадку для изучения ответов на экологический стресс, и был эффективно использован для исследования изменений в экспрессии генов в эпителии пищевода в ответ на рефлюксата компоненты 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Пищевода клетки человека получают из пациентов желудка или пищевода хирургии. Информированное согласие получено для ткани, которые будут использоваться для исследовательских целей, и ткань используется анонимно под соответствующими этическими согласований (SSREC 165/03, человека Исследование тканей Банк Лицензия 12179).
1. Выделение человека пищевода эпителиальных клеток
- Работа в ламинарного потока капот культуры ткани и с использованием стерильной техники, подготовить эпителиальных культуральную среду путем смешивания среды Игла в модификации Игла (DMEM) и F12 Хэма в соотношении 3: 1 (по объему). Добавить 10% (об / об) ФТС, 10 нг / мл эпидермального фактора роста, 0,4 мкг / мл гидрокортизона, 1,8 х 10 -4 М аденин, 5 мкг / мл инсулина, 5 мкг / мл трансферрина, 2 х 10 -7 М трийодтиронин, 1 х 10 -10 М холерного токсина, 2 × 10 -3 М глутамина, 100 МЕ / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, и 0,625 мкг / мл амфотерицина В.
- Использование стандартастерильные методы, поместить 11 мл DMEM, 10% FCS, 2 х 10 -3 М L-глутамина, 100 МЕ / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 0,625 мкг / мл амфотерицина В в культуральную колбу Т75 ткани. Добавить 1 × 10 6 летально облученных мышей 3T3 фибробластов 12 в 1 мл той же среды и инкубируют в течение ночи при 37 ° С в 5% СО 2, увлажненной атмосфере. Это даст фидерного слоя для последующей культуры эпителиальных клеток.
- Использование скальпеля и в соответствии с рекомендациями в histopathologist, рассекают приблизительно 2 см 2 образца ткани из безрецидивной фоновой области пищевода плоскоклеточный слизистой, полученной от пациентов желудка или пищевода хирургии. Транспортировки в лабораторию в 50 мл стерильного контейнера транспортной среды (PBS 100 МЕ / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 0,625 мкг / мл амфотерицина В) при комнатной температуре.
- В этот момент, хранить ткани в транспортесредний до 12 часов (на ночь) при 4 ° С, для удобства; Однако не использовать более длинные периоды хранения, как они приводят к снижению жизнеспособности клеток.
- Работа в ламинарного потока капот культуры ткани и с помощью метода стерилизации, стерилизовать лезвие скальпеля путем замачивания в 70% этаноле в течение 5 мин. Промыть в стерильной PBS.
- Поместите ткань в стерильную чашку Петри и использовать скальпель, чтобы разрезать его на 0,5 см полоски. Добавляют 5 мл 0,1% (вес / объем) трипсина в PBS в чашке Петри, поместите крышку на блюдо и инкубировать в течение 1 часа при 37 ° С.
- Добавляют 5 мл FCS в ткани в чашке Петри, чтобы ингибировать трипсин. Проведение полоску ткани с стерильным пинцетом, осторожно очистить поверхности эпителиальных с скальпелем в течение 1-2 мин на полосе, чтобы удалить эпителиальные клетки в окружающую среду. Удалить Царапины ткани и отложите в сторону. Повторите процедуру для всех тканей полос.
- Собирают среды, содержащей отдельные эпителиальные клетки в 15 мл центрифужную пробиркуи центрифугируют (5 мин, 200 мкг). Слейте надосадочную и ресуспендируют осадок в 12 мл эпителиального среды (описано в шаге 1.1).
- Вылейте и выбросьте среду от подачи слоя клеток в T75 колбу, полученного на стадии 1.2. Использование стерильной пипетки для добавления клеточной суспензии, содержащей свежеизолированных эпителиальные клетки в колбу и инкубируют при 37 ° С в 5% СО 2, увлажненной атмосфере.
- Через 24 часа слейте и отбросить культуральную среду, что также будет содержать остатков клеток, и заменить 12 мл свежего эпителиальной среды. Продолжить инкубации при 37 ° С в 5% СО 2, увлажненной атмосфере. Колонии начнут появляться в течение следующего 24 до 48 часов и может быть просмотрен путем размещения культуральной колбы в стандартном оптическом микроскопе. Вылейте отработанное культуральной среды и заменить с равным объемом свежей среды каждые 2 до 3 дней.
- После того, как колбу достигла 80% слияния, пассаж клеток 13. Сплит Cлоктей в соотношении 1: 5 для увеличения количества клеток для использования в модели. Выполните шаг 1.2, чтобы установить фидерных слоев, облученных 3T3 клеток в каждой колбе, что будет получать эпителиальные клетки 24 ч до пересева клеток.
Примечание: Используйте эпителиальные клетки в пищеводе модели, описанной ниже между проходами 1 и только 4.
2. Выделение человека Пищеводные фибробластов
- Работа в шкафу с ламинарным потоком и использованием стерильной техники, взять ткань отмененного в шаге 1.7. Место в стерильную чашку Петри и фарш мелко путем измельчения со стерильным скальпелем. Добавить 10 мл 0,5% (вес / объем) коллагеназы решение и поместите крышку на чашке Петри и инкубировать при 37 ° С в течение ночи в 5% CO 2, увлажненной атмосфере.
- Передача сводки 15 мл центрифужную пробирку и центрифугируют (10 мин, 200 мкг), тщательно слейте и отбросить супернатант и ресуспендируют осадок в 10 мл культуральной среды фибробластов (DMEM 10% FCS, 2 × 10 -3 М L-глутамина, 100 МЕ / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, и 0,625 мкг / мл амфотерицина В).
- Поместите суспензии в Т75 колбы и инкубируют при 37 ° С в 5% СО 2, увлажненной атмосфере. После 24 часов слить среду, которая будет содержать мусор и заменить 12 мл свежего фибробластов среды. Заменить культуральной среды через каждые 2 до 3 дней и прохождение клетки, когда они достигли 80% слияния 13, расщепление клеток в соотношении 1: 5 для увеличения количества клеток.
Примечание: Используйте фибробластов в модели, описанной ниже между проходами 4 и только 10.
3. Подготовка Де-cellularized пищевода строительные леса
- Получить нетронутыми свиной esophagi на бойне от свежезабитых ландрас свиней, которые используются для производства пищевых продуктов. Один единственный пищевода обеспечит достаточные каркасов примерно на 30 отдельных конструкций.
Примечание: Из-за обширного и времени соnsuming необходимости протокола стерилизации, это, как правило, стоит получения и обработки минимум 10 esophagi в одно время. - Сразу же место свеже вырезали в пищевод 180 мл стерильной горшок, содержащей приблизительно 150 мл 10% повидон-йода в течение 5 мин, чтобы уменьшить любое загрязняющих микробную нагрузку. Передача пищевод на второй горшок, содержащей приблизительно 100 мл стерильного PBS, содержащим 200 МЕ / мл пенициллина, 200 мкг / мл стрептомицина и 1,25 мкг / мл амфотерицина B.
- Замените крышку контейнера и транспортировать esophagi назад в лабораторию при комнатной температуре. Два или три esophagi можно перевозить в каждом контейнере, в зависимости от их размера.
- Однажды в лаборатории, обрабатывать ткань в ламинарном боксе в асептических условиях с использованием, чтобы минимизировать микробного загрязнения. Стерилизовать пинцет, ножницы и лезвий скальпеля путем замачивания в течение 5 мин в 70% -ном этаноле, и промывки в стерильной PBS.
- Обращайтесь с ESophagus использованием стерильных пинцетов. Используя ножницы, разрезать пищевод в продольном направлении. Промойте ткань путем размещения пищевод в 180 мл стерильной банке, содержащей около 100 мл стерильной PBS и встряхивая осторожно, чтобы удалить любой мусор.
- Очистите пробковую доску рассечение путем распыления либерально 70% этанола и дайте высохнуть.
- Удалить пищевод от PBS и с использованием стерильных игл, по контактам пищевод на борту, слизистой поверхности вверх. Возьмитесь за поверхность слизистой оболочки на одном конце пищевода с стерильных пинцетов и отстраниться от доски. Это отделить слизистую оболочку от подслизистой основной.
- Затем, используя стерильный скальпель лезвием рассекать пищевод в продольном направлении вдоль собственной пластинки, удаление контактов, как рассечение прогрессирует, чтобы слизистая быть сняты прочь.
- Сохраните расчлененный слизистую оболочку и выбросьте основной подслизистой.
- Отрежьте и выбросите наиболее проксимальных и дистальных 2 см Тон слизистой оболочке есть большее количество подслизистых желез и толще собственной пластинки в этих областях, соответственно 7.
- Используйте скальпель, чтобы вырезать оставшиеся ткани в 5 см 2. Поместите все вырезать ткань в 180 мл стерильной банке, содержащей приблизительно 150 мл стерильного PBS и агитировать мягко промойте ткань. Если обработка более чем в пять esophagi в одно время может быть необходимо использовать несколько горшков для этого и трех последующих шагов.
- Используя стерильные пинцет, передача разреза ткани в 180 мл горшок, содержащий 150 мл стерильного 1 М NaCl, 200 МЕ / мл пенициллина, 200 мкг / мл стрептомицина и 1,25 мкг / мл амфотерицина B. инкубируют в течение 72 ч при 37 ° С.
- Поместите ткань в свежем 180 мл горшок, содержащий 150 мл стерильного PBS. Эпителий будет начали заметно отделены от основной ткани. Аккуратно отделите снятие эпителий от свиного пищевода с помощью стерильного пинцета и отбросить.
- Поместите оставшиеся тВопрос в свежем 180 мл горшок и добавить 150 мл стерильного PBS. Перемешайте осторожно в течение 5 мин, чтобы вымыть. Вылейте PBS и повторить еще два раза со свежим PBS.
- Поместите все ткани в стеклянный флакон 500 мл, содержащую 400 мл стерильной 80% (об / об) растворе глицерина в течение 24 ч при комнатной температуре. Переход к 400 мл стерильной 90% (об / об) растворе глицерина в течение 24 ч.
- Хранить в 400 мл стерильной 100% раствора глицерина при комнатной температуре в течение не менее 4 месяцев для обезвоживания и стерилизации ткани при сохранении целостности базальной мембраны.
4. Производство медиакультуры
- Подготовьте хелатного сыворотки новорожденного теленка для использования в культуральной среде.
- Залить 100 г Chelex 100 в стеклянной бутылке 1 л и добавить де-ионизированной воды. Точный объем не является критическим, но достаточное количество воды должно быть добавлено, чтобы покрыть порошок Chelex. Добавить магнитную мешалку и стерилизовать автоклавированием (121 ° С в течение15 мин).
- Разрешить бутылки, чтобы охладить и Chelex урегулировать. В кабинете потока ламинарного слить лишнюю воду, добавляют 500 мл сыворотки новорожденного теленка (NCS) и оставить в течение ночи при 4 ° С.
- Остановить перемешивание и позволяют Chelex урегулировать, это может занять до 30 мин. В кабинете ламинарного потока переливать хелатированное сыворотки с помощью стерильной пипетки, заботясь, чтобы не нарушить Chelex и магазин в 10 мл аликвоты при -20 ° С.
- Подготовьте три разных средств массовой информации в шкафу с ламинарным потоком, начиная с про-пролиферации и заканчивая про-differentiative составов.
- Подготовьте композитной среды я состоит из DMEM и F12 Хэма в соотношении 3: 1 (по объему), 4 × 10 -3 М L-глутамина, 0,5 мкг / мл гидрокортизона, 1 х 10 -4 М О -phosphorylethanolamine, 2 х 10 -12 М трийодтиронина, 1,8 х 10 -4 М аденина, 1,88 × 10 -3 М CaCl 2, 4 х 10 -12 М прогестерон, 10 мкг / мл вSulin, 10 мкг / мл трансферрина, 10 нг / мл селена, 1 × 10 -3 М этаноламина и 0,1% (об / об) хелатные NCS.
- Подготовка композитной среды II в композитной среды I, за исключением замены хелатированное сыворотки с 0,1% (об / об), не хелатного NCS.
- Подготовка композитной среды III в качестве композитной среды II, за исключением опустить прогестерона и увеличение сыворотки до 2% (об / об), не хелатного NCS.
5. Производство по человеческому слизистой оболочки пищевода модели
- Выполните все работы в капюшоне ламинарного потока, используя асептической техники для поддержания стерильности. Стерилизовать все инструменты путем замачивания в 70% этаноле в течение 5 мин, до промывки в стерильной PBS.
- Накануне он требуется, увлажняет ацеллюлярную свиной пищевода эшафот. Одна часть эшафот требуется для каждой конструкции, чтобы быть готовым.
- Для увлажняет ткань место достаточно куски свиного эшафот в кастрюлю, содержащую 100 мл стерильного PBS, агитировать и выдержите в течение 10 мин. Декант в PBS и заменить свежим PBS. Повторите процесс стирки пять раз, чтобы убедиться удаление всех следов глицерина.
- Испытание строительных лесов стерильность путем инкубации разведенной ткани в течение ночи в 100 мл DMEM при 37 ° С. Если нет никаких изменений в цвете или мутности культуральной среде по окончании инкубационного периода предполагается каркас быть стерильными. После того, как бесплодие было подтверждено, поместите 5 см 2 ацеллюлярную эшафот в 6-луночного планшета в, подслизистого сторону вверх.
- Поместите стерильную медицинскую класса кольцо из нержавеющей стали (внутренний диаметр 10 мм, внешний диаметр 20 мм) на центре каждой эшафот и осторожно надавите с помощью стерильного пинцета, чтобы обеспечить адекватную печать с ткани.
- Урожай фибробласты с помощью трипсин-EDTA 13 для получения суспензии клеток. Граф клеток с использованием гемоцитометра 14. Центрифуга клеточной суспензии (10 мин, 200 XG). Ресуспендируют осадок клеток в appropriaте объемы фибробластов среды для получения конечного количества клеток 2,5 × 10 6 клеток на мл.
- Добавить 0,2 мл фибробластов среды, содержащие 5 х 10 5 пищевода фибробласты человека, в каждом кольце. Наводнение область вокруг внешней стороны кольца приблизительно 2 мл фибробластов среды. Выдержите при 37 ° С в 5% СО 2, увлажненной атмосфере.
- После 24 часов удалить кольца и фибробластов среды и добавить по крайней мере 5 мл свежей среды фибробластов в каждую лунку, убедившись, что каркас полностью погружен в среду. Культура в течение 1 недели, при 37 ° С в 5% СО 2, влажной атмосфере замены среды каждые 2 до 3 дней.
- После 1 недели удалить также пластин 6, содержащие каркасов для ламинарного наводнений капотом, снимите среду и инвертировать каждый эшафот с помощью стерильного пинцета, помещая поверхность слизистой оболочки вверх. На этот раз точка упоминается как день 0.
- Поместите стальные кольца на поверхности слизистой оболочки в центреткани, как на шаге 5.4.
- Подготовка T75 колб эпителиальных клеток для трипсинизации 13. После PBS мыть и перед добавлением трипсина-ЭДТА, добавляют 2 мл стерильного 0,02% (вес / объем) раствора ЭДТА в каждую колбу. Инкубируют в течение 2 мин при 37 ° С. Нажмите колбу осторожно, чтобы избирательно отделить подачи слой i3T3 оставляя эпителиальные клетки прилагается.
Примечание: Как правило, не практично или необходимо пациенту соответствовать эпителиальные клетки фибробластов уже включены в модели предыдущей неделе. - Вылейте раствор, содержащий EDTA фидерного слоя и добавить трипсин-ЭДТА решение для сбора эпителиальные клетки 13. Граф клеток с использованием гемоцитометра 14. Центрифуга клеточной суспензии (10 мин, 200 XG). Ресуспендируют осадок клеток в соответствующий объем композитной среды 1 до получения конечного количества клеток 5 × 10 6 клеток на мл.
- Добавить 0,2 мл композитной среды I, содержащий 1 х 10 6 эпителиальные клетки, в кольце. Flood область вокруг внешней стороны кольца с примерно 2 мл композитной среды I и поместить конструкции в инкубаторе при 37 ° С в 5% СО 2, увлажненной атмосфере.
- Через 24 ч (день 1) удалить кольца и среду и добавить по крайней мере, 5 мл свежего композитной среды I, обеспечивая каркасы полностью погружен и вернуться в инкубатор. После еще 24 ч (день 2) удалить носитель и заменены по крайней мере, 5 мл композитной среды II, снова обеспечения каркасы полностью погружен и вернуться в инкубатор.
- В день 4 место стерильной медицинской нержавеющей стали сетки сетки (2 см в ширину 2 см высокие длинные х 0,5 см), в свежих 6 чашек, один за конструкции. Используйте стерильные пинцеты для передачи конструкции на верхней части стальной арматурой, слизистой поверхности вверх.
- Добавить достаточное композитной среды III, так что жидкость достигает нижней композита, но поверхностьна воздухе, это гарантирует, что образец выдерживают при воздушной и жидкой фаз. Точный объем среды, необходимой будет варьироваться в зависимости от толщины каркасом, объем скважины и точной высоты сетки из нержавеющей стали.
- Поддержание композитов на воздухе и жидкой фаз в течение от 10 до 20 дней (день 14 до дня 24), в зависимости от требований эксперимента. Замените композитной среды III свежей средой каждые 2 до 3 дней (понедельник, среда, пятница удобно режим).
Примечание: После 5 дней в интерфейсе воздух-жидкость (День 9) конструкты имеют достаточно зрелый эпителий пищевода, который будет использоваться в экспериментах с воздействием экологических факторов на эпителия пищевода. - В конце эксперимента, зафиксировать конструкции для гистологического анализа и иммуногистохимического окрашивания 7, или экстракта белка или РНК 15 11,16 из эпителия для дальнейших Analysесть. При необходимости, сохранить кондиционированной культуральной среды для анализа внеклеточных сигнальных молекул 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эта рукопись описывает процесс, необходимый, как показано на схематическом виде на рисунке 1, чтобы культура 3D моделей эпителия пищевода человека успешно. Для подтверждения пригодности модели, как экспериментальная платформа гистологическое и иммуногистохимическое исследования были проведены сравнения культурно тканей с нормальной человеческой пищевода плоскоклеточный слизистой оболочки.
Гистологическое оценка эпителия, полученного по способу, описанному показывает зрелый, многослойный, многослойный чешуйчатый эпителий (фиг.2В), который сопоставим с наблюдаемым с нормальной человеческой пищевода (фиг.2А), хотя и более тонкие (от 5 до 10 слоев клеток по сравнению с 10 до 20 для нормального пищевода), с клетками постепенно становится более плоским и в конце концов безьядерный, поскольку они мигрируют в направлении поверхности.
Иммуногистохимический характеристика основных маркеров пролиферации и диfferentiation показывают, что микроанатомия модельного эпителия похож на нормального эпителия пищевода человека. Сопоставимые Ki67 выражение наблюдается как в родной пищевода и модели эпителия, с окрашиванием, ограниченного подмножества клеток в базальном и сразу супрабазальных слоев (3а и 3b). Это аналогично исследований, которые сообщают, что менее 10% клеток, как правило, демонстрируют экспрессию маркера пролиферации, Ki67, в нормальном эпителия пищевода 18. CK4 как правило, выражается в стратифицированной и столбчатых эпителия, но, как правило, отсутствуют в базальных слоев, а CK14 только положительным в базального слоя 19. В обоих нормальной и модели пищевода эпителия, CK14 наблюдается во всех клетках в базальном слое (рис 3D и 3Е), а CK4 наблюдается на протяжении эпителия для двух наиболее базальных слоев, кроме (рис 3G и
Попытки заменить первичные эпителиальные клетки пищевода с иммортализованных эпителиальных клеток пищевода, таких как Het-1A, оказались менее успешными, и не производит действительное модель нормального эпителия пищевода. Многослойный эпителий был сформирован; Однако пролиферативная маркер Ki67 было обнаружено по всей эпителия (рис 3C) без выражения для любых обнаруженных маркеров дифференцировки (фиг 3F, 3I и 3L), указывающее, что Het-1A клетки продуцировали гиперпролиферативных эпителий без признаков нормальной стратификации или созревание.
Тем не менее, модель былауспешно модифицированы включением опухолевые клетки путем замены первичных эпителиальных клеток с обеих аденокарциномы пищевода (OE33) или плоскоклеточный рак (OE21) клеток. Это демонстрирует гибкость модели, что позволяет использовать его в исследовании диапазон пищевода расстройств на разных этапах прогрессии через включение нескольких различных клеточных линий. Видно, что существует заметное различие в ответах от этих двух клеточных линий. OE21 плоскоклеточный клеток карциномы эпителия производит видимый на конструкции как определенной желтой области (рис 4а) с большими трещинами в пределах эпителия (рис 4В), вероятно, отражает дисфункциональных молекул клеточной адгезии. В том числе OE33 клеток аденокарциномы в модели приводит к большим количеством деградации лесов, видимого глазом как истончение эшафот после роста в 2 недели в воздух / жидкость (рис 4C) и подтверждено в Н + Е анализа какОчевидно, уменьшение толщины помост в области ниже клеток (рис 4D). Это, вероятно, будет результатом взаимодействия опухолевых клеток и фибробластов, так как каркас дегенерации не наблюдается при отсутствии фибробластов (фиг 4E и 4F). Мы наблюдали подобные воздействия на опухолевой инвазии в присутствии и в отсутствии фибробластов в эквивалентных моделей меланомы 21.
Рисунок 1: Схема, показывающая производство пищевода модели слизистой пищевода фибробласты человека высевают на подслизистую поверхности каркасом и культивируют в течение 7 дней.. Каркас инвертируется, добавлена пищевода эпителиальные клетки человека культивируют и погружен в течение 4 дней. Конструкция повышается до воздушно-жидкостной интерфейс для между 10 и 20 DAYS. В конце эксперимента конструкция может пройти дальнейший анализ, как требуется. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию рисунке.
Рисунок 2: Сравнение эпителия пищевода, произведенного в модели с нормальным человеком эпителия пищевода H + E анализа (А) нормального эпителия пищевода человека и (B) эпителия пищевода, образованного в модели слизистой оболочки пищевода человека.. Масштабная линейка 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию рисунке.
Рисунок 4: включение опухолевых клеточных линий впищевода модель. Первичные эпителиальные клетки были заменены плоского клеточной линии карциномы, OE21, или клеток аденокарциномы линии, OE33. Изображения показывают конструкцию с клетками OE21 (А) или OE33 клеток либо в сочетании с (С) или в отсутствие (E) фибробластов, до фиксации в конце периода культивирования. Эпителий в том числе OE21 (B) или клеток с OE33 (D) или без (F) фибробласты визуализируются Н + Е окрашивания. Масштабная линейка 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию рисунке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта рукопись описывает производство и характеристика биологически соответствующего модели человеческого пищевода слизистой подходящей для использования в качестве экспериментальной площадки для изучения последствий воздействия экологического стресса на эпителия пищевода.
Наиболее критические шаги для успешного производства модели пищевода слизистой человека: обеспечение того, чтобы большинство эпителиальных клеток остаются пролиферативной и уже не начали дифференцироваться перед посевом их на помост; поддержание воздушно-жидкостной интерфейс для композита, чтобы обеспечить правильное созревание эпителия; сохранения стерильности по всей длительного периода культивирования.
Из-за ограниченного количества ткани человека, доступных для выделения клеток это вообще не возможно, чтобы получить достаточное количество клеток из одного образца ткани семени Свежевыделенные клетки непосредственно на эшафот и, следовательно, расширение клеток рНASE требуется, когда клетки выращивают в стандартных 2D условиях культивирования клеток. Важно, чтобы гарантировать, что клетки остаются пролиферативная в течение этого периода. Это достигается путем обеспечения культуры никогда не позволили достичь полного слияния, с использованием клеток в модели только до прохода 4 и тщательно мониторинга морфологии клеток. Таким образом, клетки должны сохранять свою отличительную пролиферативный многоугольной морфологии и плотно "булыжной мостовой", как внешний вид, характерные пролиферативных эпителиальных клеток, а не более диффузного появления наблюдаемого в культурах, которые начали дифференцировать. Второй важный шаг контролируется, гарантируя, что клеточная культуральная среда охватывает верхнюю поверхность сетки из нержавеющей стали, используемых для подъема культуры в воздушно-жидкостной интерфейс, но самой верхней поверхности конструкции сам по себе не погружен в воду. Третий шаг зависит от строгого соблюдения протокола расширенной стерилизации при производстве де-cellularizedсвиной леса и использование хорошего метода стерильных на протяжении всего процесса.
Наши результаты показывают, что первичные клетки человека пищевода, необходимых для производства нормальный, зрелый, многослойным эпителием. Если был использован увековечена линия клеток, хотя происходит от эпителия пищевода человека, клетки оставались пролиферативная и не дифференцироваться в зрелые образуют многослойный эпителий. Полученную эпителий не может быть использован в качестве удовлетворительной модели для нормального эпителия, что свидетельствует о непригодности иммортализованных линий клеток Het-1A для использования в модели. Однако другие клеточные линии, такие как те, которые получены из пищевода опухолей или метаплазии Барретта может быть включена в модель либо вместо или в дополнение к первичных эпителиальных клеток продуцировать модели для исследования прогрессии опухоли, инвазию и в ответ на фармакологических агентов.
Эксперименты могут быть выполнены с помощью пищеводного модель для сimulate экспозицию пищевода в дискретную, пульсирующие события во время глотания или рефлюкса. Это достигается путем многократного погружени конструкции в культуральной среде, содержащей соединение (я) для тестирования и промывки в PBS перед возвращением конструкцию с интерфейсом воздух-жидкость. Время экспозиции и частоты может быть изменен, чтобы отразить процесс моделируется, гарантируя, что Эпителиальный слой подвергается окружающей фактора (ов), позволяя культура продолжить на воздушно-жидкостной интерфейс. Этот метод был использован в нашей лаборатории, чтобы исследовать воздействие обратным холодильником на нормальном эпителия пищевода, где модель подвергался конкретных желудочно-пищеводного рефлюкса компонентов в течение 10 минут два раза в день в течение 11 дней 11. Альтернативно конструкции могут быть подвержены непрерывных уровней экологический стресс путем включения этих соединений в культуральной среде. Однако, поскольку эпителий должен подвергаться воздействию воздушного и жидкой фаз для epitheлиево созревать и дифференцироваться правильно 7, это не возможно, чтобы непрерывно погрузить конструкции в культуральной среде. Следовательно, воздействие стрессора будет только через поверхность подслизистой в этих экспериментах, которые могут ограничивать значимость полученных результатов.
Техника относительно трудоемким и, следовательно, лучше подходит для скрининга относительно ограниченного числа соединений. В результате, при использовании в качестве модели экспериментальной платформы, целесообразно сначала выполнить предварительное исследование с использованием обычных методов культивирования клеток с целью выявления ограниченного числа условий до дальнейшего анализа с использованием более физиологически соответствующие пищевода модель, описанную здесь, 11. В дополнение к иммуногистохимического анализа был также можно рассматривать изменения в эпителиальных профиль экспрессии генов после воздействия экологических факторов стресса. Это было достигнуто вручную избавлением от еpithelium, извлечение РНК и превращения ее в кДНК, чтобы изолировать гены выражены и анализировать с помощью микрочипов, чтобы получить профили экспрессии генов 11. Таким образом, стало возможным увеличить имеющуюся информацию из модели в качестве экспериментальной платформы. Ранние изменения в эпителиальных профиля экспрессии генов следующие моделируемой воздействием на желудочно-пищеводного рефлюкса были предложены и из этих результатов новые области были предложены для дальнейшего исследования в профилактике развития метаплазии Барретта, в метапластического предшественника OAC 11. Модель также может быть использован для изучения экспрессии белка с использованием таких методов, как вестерн-блоттинга 15 и экспрессии генов с использованием Нозерн-блот-анализ 16. Более того исследования внеклеточных сигнальных молекул может быть выполнена на культуральной среде 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарны г-ну Роже Акройд, г-Эндрю Вайман и г Крис Стоддард, консультант хирургов в Шеффилд больницах NHS Trust Foundation, за их помощь в приобретении образцов ткани пищевода и их поддержку нашей работы. Мы благодарим Ashraful Хак за помощь включения линии опухолевых клеток в модели. Мы выражаем глубокую признательность за финансовую поддержку исследования по грантам от исследований и образования Trust Сабир (BRET) и йоркширский исследований рака (YCR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | BD Biosciences | 215240 | Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilize. Warm in 37 °C water bath before use. |
| DMEM | Labtech | LM-D1112 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F12 | Labtech | LM-H1236 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Foetal Calf Serum | Labtech | FB-1090 | |
| Epidermal Growth Factor | R+D Systems | 236-EG-200 | Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS |
| Hydorcortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2767 | Prepare 10 mg/ml solution in 0.01 M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilize before use |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T2036 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | Prepare stock solution in water |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Brand name Fungizone |
| PBS | Oxoid | BR0014 | Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilize |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| Povidone-iodine solution | Ecolab | 10830E | Brand name Videne |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| Newborn calf serum | Gibco | 26010074 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use use |
| O-phosphorylethanolamine | Sigma-Aldrich | P0503 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Lonza | 17-838Z | Used for composite media preparation |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EDTA 0.02% solution | Sigma-Aldrich | E8008 | Warm in 37 °C water bath before use |
| T75 culture flask | VWR | 734-2313 | |
| 50 ml centrifuge tube | Fisher | 11819650 | |
| 15 ml universal tube | SLS | SLS7504 | |
| 180 ml pot | VWR | 216-2603 | |
| Petri dish | SLS | 150350 | |
| 6 well plate | VWR | 734-2323 | |
| stainless steel rings | Manufactured in house - medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm | ||
| steel mesh grids | Manufactured in house - sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2 cm (w) x 2 cm (d) x 0.5 cm (h) | ||
| ki67 | Novocastra | KI67-MM1-L-CE | Clone MM1. Use at 1:100. |
| CK4 | Abcam | ab9004 | Clone 6B10. Use at 1:200. |
| CK14 | Novocastra | LL002-L-CE | Clone LL002. Use at 1:200. |
| Involucrin | Novocastra | INV | Clone SY5. Use at 1:100. |
| OE21 | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| OE33 | Sigma-Aldrich | 96070808 | |
| Het-1A | ATCC-LGC | CRL-2692 | |
| Mouse 3T3 fibroblasts | ATCC-LGC | CRL-1658 | previously growth arrested by irradiation (60 Gy) |
References
- Pera, M., Manterola, C., Vidal, O., Grande, L. Epidemiology of esophageal adenocarcinoma. J. Surg. Oncol. 92 (3), 151-159 (2005).
- Manea, G. S., Lupusoru, C., Caruntu, I. D. Experimental study on the effect of bile, and bile and hydrochloric acid mixture on the esophageal mucosa. Rom. J. Morphol. Embryol. 50 (1), 61-66 (2009).
- Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 278 (3), 1824-1830 (2003).
- Underwood, T. J., et al. A comparison of primary oesophageal squamous epithelial cells with HET-1A in organotypic culture. Biol. Cell. 102 (12), 635-644 (2010).
- Nystrom, M. L., et al. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J. Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Okawa, T., et al. The functional interplay between EGFR overexpression, hTERT activation, and p53 mutation in esophageal epithelial cells with activation of stromal fibroblasts induces tumor development, invasion, and differentiation. Genes & Development. 21 (21), 2788-2803 (2007).
- Green, N., et al. The development and characterization of an organotypic tissue-engineered human esophageal mucosal model. Tissue Eng Part A. 16 (3), 1053-1064 (2010).
- Harada, H., et al. Telomerase induces immortalization of human esophageal keratinocytes without p16INK4a inactivation. Mol. Cancer Res. 1 (10), 729-738 (2003).
- Bhargava, S., Chapple, C. R., Bullock, A. J., Layton, C., MacNeil, S. Tissue-engineered buccal mucosa for substitution urethroplasty. BJU. Int. 93 (6), 807-811 (2004).
- Ralston, D. R., et al. Keratinocytes contract human dermal extracellular matrix and reduce soluble fibronectin production by fibroblasts in a skin composite model. Br. J. Plast. Surg. 50 (6), 408-415 (1997).
- Green, N. H., et al. Pulsatile exposure to simulated reflux leads to changes in gene expression in a 3D model of oesophageal mucosa. Int. J. Exp. Pathol. 95 (3), 216-228 (2014).
- Wang, C. S., et al. Selective culture of epithelial cells from primary breast carcinomas using irradiated 3T3 cells as feeder layer. Pathol. Res. Pract. 197 (3), 175-181 (2001).
- Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. J. Vis. Exp. (16), e755 (2008).
- Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2014).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N. Am. J. Med. Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat. Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Morgan, E., et al. Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clin. Immunol. 110 (3), 252-266 (2004).
- Xu, M., et al. The abnormal expression of retinoic acid receptor-beta, p 53 and Ki67 protein in normal, premalignant and malignant esophageal tissues. World J. Gastroenterol. 8 (2), 200-202 (2002).
- Moll, R., Divo, M., Langbein, L. The human keratins: biology and pathology. Histochem. Cell Biol. 129 (6), 705-733 (2008).
- Rice, R. H., Green, H. Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross-linked envelope: activation of the cross-linking by calcium ions. Cell. 18 (3), 681-694 (1979).
- Eves, P., et al. Melanoma invasion in reconstructed human skin is influenced by skin cells - investigation of the role of proteolytic enzymes. Clin. Exp. Metastasis. 20 (8), 685-700 (2003).
