Summary
כתב יד זה מתאר את הייצור, אפיון ושימושים פוטנציאליים של רקמת מבנה הוושט 3D מהונדס הוכנה מפיברובלסטים נורמלים עיקריים אנושיים הוושט ותאי אפיתל קשקש זורעים בתוך פיגום חזירי דה-cellularized. התוצאות מראות ההיווצרות של האפיתל מרובדת בוגר דומה לושט האדם הנורמלי.
Abstract
השכיחות של שתי אדנוקרצינומה של הוושט ומבשרה, מטפלזיה של בארט, עולה במהירות בעולם המערבי. יתר על כן אדנוקרצינומה של הוושט בדרך כלל יש פרוגנוזה גרועה, עם שיפור קטן בשיעורי הישרדות בשנים האחרונות. אלה הם תנאים קשים ללמוד ויש כבר חוסר פלטפורמות ניסוי מתאימים לחקור הפרעות של רירית הוושט.
מודל של רירית הוושט האנושית פותח במעבדה מקניל ש, בניגוד למערכות תרבית תאי 2D קונבנציונליות, משחזרת אינטראקציות תא-תא ותא-מטריצה הנוכחיות in vivo ומייצר האפיתל בוגר, מרובד דומה לזה של האדם הנורמלי וושט. בקצרה, המודל מנצל תאים נורמלים fibroblasts הוושט האנושי הראשוני ואפיתל-שינה לא גדלו בתוך פיגום הוושט acellular נגזר חזירי. אפיון immunohistochemical של מודל זהעל ידי CK4, CK14, Ki67 וinvolucrin צביעה מדגימה שחזור מתאים של היסטולוגיה של רירית הוושט אדם הנורמלית.
מודל זה מספק מודל חזק, רלוונטי מבחינה ביולוגית ניסיוני של רירית הוושט האנושית. זה יכול בקלות לטפל לחקור מספר שאלות מחקר כולל את האפקטיביות של סוכנים תרופתיים ואת ההשפעה של חשיפה לגורמים סביבתיים כגון אלכוהול, רעלים, טמפרטורה גבוהה או רכיבי refluxate גסטרו-הוושט. המודל מאפשר גם תקופות תרבות מורחבות לא השגה עם תרבות קונבנציונלית תא 2D, המאפשרת, בין היתר, המחקר על ההשפעה של חשיפה חוזרת ונשנית של האפיתל בוגר לסוכן של ריבית לעד 20 ימים. יתר על כן, מגוון רחב של שורות תאים, כגון אלה שמקורם בגידולים בושט או מטפלזיה של בארט, ניתן לשלב את המודל כדי לחקור תהליכים כגון פלישת גידול וresponsivene סמיםss ביותר מבחינה ביולוגית רלוונטי סביבה.
Introduction
רירית הוושט כוללת אפיתל מרובדת, קשקש מעל שכבה של רקמת חיבור, propria lamina, והוא אחד מהאתרים הראשונים שנתקלים בגורמי לחץ סביבתיים בליעה. חשיפה לרעלים תזונתיים מעורבת בפיתוח של קרצינומה של קשקש הוושט, תוך ריפלוקס duodenogastro-הוושט הוא גורם קריטי בפתוגנזה שלו של בארט מטפלזיה, אשר מזוהה עם עלייה בסיכון להתקדמות לאדנוקרצינומה של הוושט. קרצינומה של הוושט היא הגידול הממאיר הנפוץ ביותר -8 בגברים בבריטניה ואדנוקרצינומה של הוושט גדל במהירות בעולם המערבי 1. יתר על כן, חל שיפור קטן בתחזית מחלה, עם שיעור הישרדות של 5 שנים כוללת של כ -15%. כתוצאה מכך יש צורך בפלטפורמות ניסוי כדי לחקור את ההשפעה של חשיפה לגורמי לחץ סביבתי על אפיתל הוושט זה ומעורבותם האפשרית בdevelopment של מטפלזיה או גידולים.
למרות שורות תאים הונצחו או גידול לאפשר לחוקרים ללמוד את התגובה של תאי האפיתל ללחצים אלה במבחנה, הם נשארים שגשוג ולא מצליחים להתמיין אפיתל התאים הבוגרים שנמצאו בשכבות העליונות של רירית הוושט. יתר על כן, תאי קווים שכבר עברו tumorigenesis עשויים לספק מידע מוגבל בלבד לגבי התגובות הראשוניות של תאים נורמלים בתוך האפיתל לגורמים סביבתיים; וזה השלב שבו הפוטנציאל להתערבות טיפולית עשוי להיות הגבוה ביותר. לבסוף, מערכות תרבית תאים קונבנציונליות לא מצליחות ללכוד את האינטראקציות הפוטנציאליות חשובות בין תאי אפיתל mesenchymal ובין תאים אלה והמטריצה סביב המתרחשים בתוך רקמות in vivo.
מודלים של בעלי החיים לספק מייקרו-סביבה מציאותית יותר ללימוד התגובות של epitheli הוושטאממ ויכול לשלב האינדוקציה המלאכותית ריפלוקס גסטרו-הוושט 2. עם זאת זה יכול להיות מאתגר יותר כדי לתפעל את גורמי הלחץ הסביבתיים במודלים האלה והם לא יכולים לייצג את התגובה בתוך הוושט האנושי באופן מלא.
מודלים הוושט אחרים ניסיוניים אנושיים פותחו לנצל תאים ראשוניים, תאים הונצחו או שורות תאי גידול בקולגן, או בשילוב fibroblasts קולגן / Matrigel, פיגום המכיל 3,4. זה פחות עבודה אינטנסיבית כדי ליצור פיגומים אלה מפיגום הוושט acellular המתואר בכתב היד הזה, ומודלי organotypic אלה מספקים כלי שימושי, במיוחד במחקר של פלישת גידול 5,6, שבו תאי גידול חדירות לג'ל קולגן יכול להיות בקלות נצפה. עם זאת יש לי ג'ל קולגן אלה תכונות מכאניות שאינם ילידי הארץ וחסרי תכונות מסוימות של הרקמה המקורית, כולל קרום במרתף ספציפי וappropriatטופוגרפיה משטח דואר. זה יכול להשפיע על התנהגותם של תאים וכתוצאה מכך, לדוגמא, הדבקה עניות בין האפיתל והפיגום בעת שימוש בפיגום ג'ל קולגן 7. כתוצאה מכך פיגום הוושט חזירי acellular פותח, עם היתרון של להיות יותר מציאותי מבחינה ביולוגית פיגום ולכן יותר מתאים לשימוש כפלטפורמה ניסיונית. זה גם הוכח שעדיף לשלב תאים ראשוניים למבני הוושט מאשר קווים הנציחו הוושט אפיתל תאים, כגון Het-1A, מאז תאים אלה יוצרים אפיתל רב שכבתי, אבל לא מצליחים רבד או להבדיל 4,7,8 .
כתוצאה מכך, פרוטוקול זה הותאם משיטה כבר בשימוש במעבדה מקניל להכנת עור רקמות מהונדסים ורירית פה 9,10 ומשלב פיגום הוושט חזירי דה-cellularized בשילוב עם תאים ראשוניים אדם הוושט אפיתל fibroblasts. תיפרוטוקול של מייצר האפיתל בוגר, מרובדת, דומה לזו של וושט האדם הנורמלי כפי שהודגם על ידי CK4, CK14, Ki67 וinvolucrin מכתים. מודל התוצאה מספק פלטפורמה ניסיונית ללמוד תגובות ללחצים סביבתיים, ונעשה בו שימוש בצורה יעילה כדי לחקור שינויים בביטוי גנים באפיתל הוושט בתגובה לrefluxate רכיבים 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
תאי הוושט אדם מתקבלים מחולים שעברו ניתוח קיבה או הוושט. הסכמה מדעת מתקבלת לרקמה לשמש למטרות מחקר, והרקמות המשמשות בעילום שם תחת האישורים האתיים המתאימים (SSREC 165/03, רקמות מחקר אנושי בנק רישיון 12,179).
1. בידוד של אדם תאי אפיתל הוושט
- עבודה במנדף תרבית רקמת זרימה למינרית ובאמצעות טכניקה סטרילית, להכין מדיום תרבות אפיתל על ידי ערבוב הבינוני של הנשר השתנה Dulbecco (DMEM) וF12 של בשר חזיר ביחס 3: 1 (v: v). הוסף 10% (V / V) FCS, 10 ng / גורם גדילה באפידרמיס מיליליטר, 0.4 מיקרוגרם / מיליליטר הידרוקורטיזון, 1.8 x 10 -4 אדנין, 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, מיקרוגרם M 5 / מיליליטר transferrin, 2 x 10 -7 M triiodothyronine, 1 x 10 -10 רעלן הכולרה M, 2 x 10 -3 M גלוטמין, 100 IU / פניצילין מיליליטר, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, ו0.625 מיקרוגרם / מיליליטר amphotericin B.
- שימוש סטנדרטיטכניקות סטרילי, לשים 11 מיליליטר של DMEM, 10% FCS, 2 x 10 L- גלוטמין -3 M, 100 IU / פניצילין מיליליטר, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, ו0.625 מיקרוגרם / B amphotericin מיליליטר לתוך בקבוק תרבית רקמת T75. הוסף 1 x 10 6 העכבר 3T3 fibroblasts קטלני מוקרן 12 ב 1 מיליליטר של המדיום זהה ודגירת לילה על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2, אווירת humidified. זה יהיה לייצר שכבת מזין לתרבות הבאה של תאי האפיתל.
- באמצעות אזמל ובעקבות המלצות histopathologist, לנתח מדגם כ 2 סנטימטר 2 של רקמה מאזור הרקע ללא מחלה של רירית הוושט קשקש מתקבל מחולים שעברו ניתוח קיבה או הוושט. הובלה למעבדה במכל 50 מיליליטר של מדיום תחבורת סטרילי (פניצילין מיליליטר PBS 100 IU /, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין ו0.625 מיקרוגרם / מיליליטר amphotericin B) בטמפרטורת חדר.
- בשלב זה, לאחסן את הרקמה בתחבורהבינוני עד 12 שעות (לילה) בשעה 4 מעלות צלזיוס, לנוחות; עם זאת אין להשתמש בתקופות אחסון ארוכות יותר כפי שהם יגרמו לכדאיויות תא מופחתות.
- עבודה במנדף תרבית רקמת זרימה למינרית ובאמצעות טכניקה סטרילית, לעקר להב סכין מנתחים על ידי השריית באתנול 70% במשך 5 דקות. יש לשטוף בPBS סטרילי.
- הנח את הרקמה בצלחת פטרי סטרילי ולהשתמש באזמל כדי לחתוך אותו לרצועות 0.5 סנטימטר. הוסף 5 מיליליטר של 0.1% (w / v) טריפסין ב PBS לצלחת פטרי, למקם את המכסה על צלחת דגירה עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס.
- הוסף 5 מיליליטר של FCS לרקמה בצלחת פטרי לעכב טריפסין. מחזיק את הרצועה של רקמה עם מלקחיים סטריליות, בעדינות לגרד את פני השטח אפיתל עם להב סכין המנתחים במשך 1-2 דקות לכל רצועה כדי להסיר את תאי אפיתל לתוך המדיום שמסביב. להסיר את הרקמה מגורדת ומניח בצד. חזור על התהליך עבור כל רצועות הרקמה.
- לאסוף את המדיום המכיל את תאי האפיתל המנותק לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטרצנטריפוגות (5 דקות, 200 XG). יוצקים את supernatant ו resuspend גלולה ב 12 מיליליטר של מדיום אפיתל (מתואר בשלב 1.1).
- יוצקים את וזורקים בינוניים משיכבת תאי מזין בבקבוק T75 מוכן בשלב 1.2. השתמש פיפטה סטרילית להוסיף את ההשעיה התא המכילה את תאי האפיתל הטרי המבודדים לבקבוק ולדגור על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2, אווירת humidified.
- לאחר 24 שעות לשפוך ותשאיר את מדיום התרבות, שיכיל גם פסולת תא, ולהחליף עם 12 מיליליטר של מדיום אפיתל הטרי. המשך דוגרים על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2, אווירת humidified. מושבות יתחילו להופיע מעל שעות 24 עד 48 הבאות ויכולות להיות שנצפו על ידי הצבת בקבוק התרבות תחת מיקרוסקופ אור רגילה. יוצקים את מדיום התרבות בילה ולהחליף עם נפח שווה של מדיום חדש כל 2 עד 3 ימים.
- ברגע שהגיע לבקבוק 80% confluency, מעבר התאים 13. פיצול גאמות ביחס של 1: 5 להגדלת מספרים סלולריים לשימוש במודל. בצע שלב 1.2 להקים שכבות מזין של 3T3 תאים מוקרנים בכל בקבוק שיהיה קבלת תאי האפיתל 24 שעות לפני passaging התאים.
הערה: השתמש בתאי אפיתל במודל הוושט המתואר להלן בין קטעי 1 ו -4 בלבד.
2. בידוד של fibroblasts הוושט אדם
- עבודה בזרימה למינרית ובאמצעות טכניקה סטרילית, לקחת הרקמה להפריש בשלב 1.7. מניחים בצלחת פטרי סטרילי וברר היטב על ידי קיצוץ בסכין אזמל סטרילי. להוסיף 10 מיליליטר של 0.5% (w / v) collagenase פתרון ומניח את המכסה על צלחת פטרי ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך לילה ב5% CO 2, אווירת humidified.
- העבר את התקציר לצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר ו צנטריפוגות (10 דקות, 200 XG), בזהירות לשפוך את וזורקים supernatant ו resuspend גלולה ב 10 מיליליטר של מדיום התרבות פיברובלסטים (DMEM 10% FCS, 2 x 10 L- גלוטמין -3 M, 100 IU / פניצילין מיליליטר, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, ו0.625 מיקרוגרם / מיליליטר amphotericin B).
- מניחים את ההשעיה לתוך בקבוק T75 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2, אווירת humidified. לאחר 24 שעות לשפוך את המדיום, אשר יכיל פסולת ולהחליף עם 12 מיליליטר של מדיום פיברובלסטים טרי. החלף את מדיום התרבות כל 2 עד 3 ימים ותאי מעבר ברגע שהם הגיעו 80% confluency 13, פיצול התאים ביחס של 1: 5 להגדלת מספרים סלולריים.
הערה: השתמש בתאי פיברובלסטים במודל שתואר להלן בין קטעי 4 ו -10 בלבד.
3. הכנת פיגום הוושט cellularized-דה
- להשיג esophagi חזירי שלם בבית שחיטה חזירים landrace טרי נשחטו המשמשים לייצור מזון. וושט אחד יספק פיגומים מספיקים לכ -30 מבנים נפרדים.
הערה: בשל שיתוף הנרחב וזמןnsuming פרוטוקול עיקור הנדרש, זה בדרך כלל שווה קבלת ועיבוד מינימאלי של 10 esophagi בפעם אחת. - מייד למקם את הוושט הטרי נכרת לתוך סיר סטרילי 180 מיליליטר מכיל כ 150 מיליליטר של 10% פתרון povidone- יוד למשך 5 דקות כדי להפחית עומס כלשהו של חיידקים מזהמים. העבר את הוושט לסיר שני מכיל כ 100 מיליליטר של PBS סטרילי המכיל 200 IU / פניצילין מיליליטר, 200 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, ו1.25 מיקרוגרם / מיליליטר amphotericin B.
- החזר את המכסה על המכל ולהעביר את esophagi בחזרה למעבדה בטמפרטורת חדר. יכול להיות מועבר שניים או שלוש esophagi בכל מיכל, בהתאם לגודלם.
- פעם אחת במעבדה, להתמודד עם הרקמה במכסת מנוע זרימה למינרית באמצעות טכניקת aseptic כדי למזער זיהום מיקרוביאלי. לעקר פינצטה, מספריים ולהבי אזמל על ידי שריה במשך 5 דקות באתנול 70%, והשטיפה בPBS סטרילי.
- ידית esophagus באמצעות פינצטה סטרילית. בעזרת המספריים, לחתוך פתוח הוושט longitudinally. יש לשטוף את הרקמה על ידי הצבת הוושט לתוך סיר סטרילי 180 מיליליטר מכיל כ 100 מיליליטר של PBS סטרילי ורועד בעדינות כדי להסיר כל פסולת.
- נקה לוח נתיחת פקק על ידי ריסוס בנדיבות עם אתנול 70% ולאפשר לו להתייבש.
- הסר את הוושט מPBS, ובאמצעות מחטים סטריליות, להצמיד את הוושט על הלוח, עליון משטח הרירי. לתפוס את המשטח הרירי בקצה אחד של הוושט עם פינצטה סטרילי ולהתרחק מהלוח. זה יהיה להפריד את הרירית מsubmucosa הבסיסי.
- לאחר מכן, השתמש בסכין אזמל סטרילי כדי לנתח את הוושט longitudinally לאורך propria lamina, הסרת סיכות כנתיחה מתקדמת כדי לאפשר הרירית יוסרו משם.
- שמור את הרירית גזור וזורקים את submucosa הבסיסי.
- מנותק ולהשליך 2 סנטימטר הפרוקסימלי ודיסטלי ביותר של tהוא הרירית כמו שיש מספר גדול יותר של בלוטות submucosal וpropria lamina עבה באזורים אלה, בהתאמה 7.
- השתמש באזמל כדי לחתוך את הרקמה שנותרה לתוך 5 סנטימטר 2. מניחים את כל הרקמה לחתוך לתוך סיר סטרילי 180 מיליליטר מכיל כ 150 מיליליטר של PBS סטרילי ולהתסיס בעדינות כדי לשטוף את הרקמה. אם עיבוד יותר מחמש esophagi בפעם אחת ייתכן שיהיה צורך להשתמש בסירים רבים לכך ושלושה השלבים הבאים.
- בעזרת פינצטה סטרילי, להעביר את הרקמה לחתוך לתוך סיר 180 מיליליטר המכיל 150 מיליליטר של סטרילית M NaCl 1, 200 IU / פניצילין מיליליטר, 200 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין ו1.25 מיקרוגרם / מיליליטר amphotericin B. דגירה של 72 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
- הנח את הרקמה לתוך סיר 180 מיליליטר טרי המכיל 150 מיליליטר סטרילי PBS. אפיתל יהיה החל להפריד בעליל מהרקמה הבסיסית. לקלף בעדינות את האפיתל הניתוק מושט החזיר באמצעות מלקחיים סטרילית וזורקים.
- מניחים את לא נותרנושא לתוך סיר 180 מיליליטר טרי ולהוסיף 150 מיליליטר של PBS סטרילי. להתסיס בעדינות במשך 5 דקות לשטוף. יוצקים את PBS ולחזור פעמיים נוספות עם PBS הטרי.
- מניחים את כל הרקמה לתוך בקבוק זכוכית 500 מיליליטר מכיל 400 מיליליטר של 80% סטרילי (v / v) פתרון גליצרול למשך 24 שעות בטמפרטורת חדר. העבר ל -400 מיליליטר של 90% סטרילי (v / v) פתרון גליצרול לשעה 24 נוספת.
- אחסן ב400 מיליליטר של תמיסה סטרילית 100% גליצרול בטמפרטורת חדר למשך מינימום של 4 חודשים ללייבש ולעקר את הרקמות תוך שמירה על שלמותו של הקרום במרתף.
4. הפקה של התקשורת והתרבות
- הכן סרום עגל שזה עתה נולד chelated לשימוש במדיום התרבות.
- יוצקים של Chelex 100 100 גרם לתוך בקבוק זכוכית 1 ליטר ולהוסיף מים דה מיוננים. הנפח המדויק אינו קריטי אך מספיק מים, יש להוסיף כדי לכסות את אבקת Chelex. הוסף בוחש מגנטי ולעקר ידי מעוקר (121 מעלות צלזיוס במשך15 דק ').
- לאפשר את הבקבוק להתקרר וChelex להתיישב. בזרימה ממשלה למינרית לשפוך את המים העודפים, להוסיף 500 מיליליטר של סרום יילוד עגל (NCS) ולהשאיר לעורר לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
- תפסיק לבחוש ולאפשר Chelex להתיישב, זה יכול לקחת עד 30 דקות. בזרימה למינרית למזוג סרום chelated באמצעות פיפטה סטרילית, נזהר שלא להפריע את Chelex, וחנות ב 10 aliquots מיליליטר ב -20 ° C.
- הכן שלוש תקשורת שונה בזרימה למינרית, החל פרו-שגשוג וכלה בניסוחים פרו-differentiative.
- הכן Composite בינוני אני מורכב מF12 DMEM והכרעיים ביחס 3: 1 (v: v), 4 x 10 L- גלוטמין -3 M, 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר הידרוקורטיזון, 1 x 10 -4 -phosphorylethanolamine O M, 2 x 10 -12 triiodothyronine M, 1.8 x 10 -4 אדנין M, 1.88 x 10 -3 M CaCl 2, 4 x 10 פרוגסטרון M -12, 10 מיקרוגרם / מיליליטר בsulin, 10 מיקרוגרם / מיליליטר transferrin, 10 ng / ml סלניום, 1 x 10 -3 ethanolamine M ושל 0.1% (V / V) NCS chelated.
- הכן Composite בינוני השני כComposite בינוני אני מלבד להחליף סרום chelated עם 0.1% (V / V) NCS לא chelated.
- הכן Composite בינוני III כComposite בינוני השני מלבד פרוגסטרון להשמיט וסרום עלייה של 2% (V / V) NCS לא chelated.
5. הפקה של הוושט רירית דגם האדם
- לבצע את כל העבודה בזרימה למינרית, תוך שימוש בטכניקה aseptic לשמור על סביבת סטרילית. לעקר את כל הכלים על ידי השריית באתנול 70% במשך 5 דקות, לפני השטיפה בPBS סטרילי.
- היום לפני שהוא נדרש, רעננות פיגום הוושט חזירי acellular. חתיכת פיגום אחד נדרש עבור כל מבנה כדי להיות מוכן.
- לרעננות החתיכות מספיק מקום רקמה של פיגום חזירי לתוך סיר המכיל של PBS סטרילי 100 מיליליטר, להתסיס ומשרים למשך 10 דקות. Decant PBS ולהחליף עם PBS הטרי. חזור על תהליך הכביסה חמש פעמים כדי להבטיח הסרת כל עקבות גליצרול.
- בדוק את עקרות פיגום על ידי דוגרים רקמת rehydrated הלילה בשל DMEM 100 מיליליטר ב 37 מעלות צלזיוס. אם אין שינוי בצבע או העכירות של מדיום התרבות בסוף תקופת הדגירה פיגום הנחה הוא להיות סטרילי. ברגע שעקרות אושרו, למקם את פיגום 2 acellular 5 סנטימטרים לתוך צלחת 6 היטב, צד submucosal עליון.
- מניחים טבעת סטרילי כיתה רפואית פלדת אל-חלד (פנימיים בקוטר 10 מ"מ, קוטר 20 מ"מ חיצוני) על גבי במרכז כל פיגום ולחץ בעדינות כלפי מטה באמצעות מלקחיים סטריליים, על מנת להבטיח חותם נאות עם הרקמה.
- לקצור את fibroblasts באמצעות טריפסין-EDTA 13 לייצר השעיה תא. ספירת התאים באמצעות haemocytometer 14. צנטריפוגה ההשעיה התא (10 דקות, 200 XG). Resuspend התא גלולה לappropriate נפח בינוני פיברובלסטים לייצר ספירת תאים סופית של 2.5 x 10 6 תאים לכל מיליליטר.
- להוסיף 0.2 מיליליטר של מדיום פיברובלסטים, המכיל 5 x 10 5 fibroblasts הוושט אנושי, בתוך כל טבעת. להציף את סביב החלק החיצוני של טבעת האזור עם כ 2 מיליליטר של מדיום פיברובלסטים. לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2, אווירת humidified.
- לאחר 24 שעות להסיר את מדיום טבעות ופיברובלסטים ולהוסיף לפחות 5 מיליליטר של מדיום פיברובלסטים טרי היטב כל אחד, על מנת להבטיח כי הפיגום הוא שקוע לחלוטין במדיום. תרבות לשבוע 1, על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2, אווירת humidified החלפה בינונית כל 2 עד 3 ימים.
- לאחר השבוע 1 להסיר את 6 הצלחות המכילות גם פיגומים למכסה מנוע מבול מינרית, להסיר את המדיום ולהפוך כל פיגום באמצעות מלקחיים סטרילית, הצבת המשטח הרירי עליונה. נקודת זמן זו נקראת יום 0.
- מניחים את טבעות פלדה על פני השטח הריריים במרכזהרקמה כמו בשלב 5.4.
- הכן את צלוחיות T75 של תאי האפיתל לtrypsinization 13. לאחר PBS לשטוף ולפני התוספת של פתרון טריפסין-EDTA, להוסיף 2 מיליליטר של 0.02% סטרילי (w / v) פתרון EDTA לכל בקבוק. דגירה של 2 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הקש הבקבוק בעדינות כדי לנתק באופן סלקטיבי את שכבת מזין i3T3 תוך השארת תאי האפיתל מצורף.
הערה: זה בדרך כלל לא מעשי או הכרחי לחולה להתאים את תאי האפיתל לfibroblasts כבר שולב במודל בשבוע שעבר. - יוצקים את פתרון EDTA המכיל שכבת המזין ולהוסיף פתרון טריפסין-EDTA לקצור את תאי האפיתל 13. ספירת התאים באמצעות haemocytometer 14. צנטריפוגה ההשעיה התא (10 דקות, 200 XG). Resuspend התא גלולה לנפח מתאים של Composite בינוני 1 לייצר ספירת תאים סופית של 5 x 10 6 תאים לכל מיליליטר.
- להוסיף 0.2 מיליליטר של Composite בינוני אני, המכיל 1 x 10 6 תאים אפיתל, בתוך הטבעת. להציף את סביב החלק החיצוני של הטבעת עם כ 2 מיליליטר של Composite בינוני אני האזור ולהציב את המבנים לתוך החממה ב 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2, אווירת humidified.
- לאחר 24 שעות (יום 1) להסיר את הטבעות ובינוניות ולהוסיף לפחות 5 מיליליטר של מדיום אני Composite הטרי, להבטיח את הפיגומים שקועים באופן מלא ולחזור לחממה. לאחר שעה נוספת 24 (יום 2) להסיר את המדיום ולהחליף עם לפחות 5 מיליליטר של Composite בינוני השני, שוב הבטחת הפיגומים שקועים באופן מלא ולחזור לחממה.
- ביום רשתות 4 מקום כיתה רפואית סטריליים נירוסטה רשת (2 סנטימטרים X 2 סנטימטר רחב ארוך x 0.5 ס"מ), לתוך צלחות 6 גם טריות, אחד לכל מבנה. השתמש פינצטה סטרילית להעביר את המבנים על גבי רשתות פלדה, עליון משטח הרירי.
- להוסיף Composite מספיק בינוני III, כך שהנוזל מגיע לחלק התחתון של מרוכבים, אבל על פני השטח הואחשוף לאוויר, זה מבטיח כי המדגם נשמרים בממשק אוויר נוזלי. הנפח המדויק של המדיום הנדרש ישתנה בהתאם לעובי של הפיגום, היקף וגם את הגובה המדויק של רשת הנירוסטה.
- לשמור על חומרים מרוכבים בממשק אוויר נוזלי לבין 10 ל 20 ימים (יום 14 ליום 24), בהתאם לדרישות של הניסוי. החליפו את Composite בינוני III עם מדיום חדש כל 2 עד 3 ימים (יום שני, רביעי, שישי הוא משטר ידידותי למשתמש).
הערה: לאחר 5 ימים בממשק אוויר נוזלי (יום 9) יש לי המבנים אפיתל הוושט מספיק בוגר לשימוש בניסויים של ההשפעה של גורמים סביבתיים על אפיתל הוושט. - בסוף הניסוי, לתקן את המבנים לניתוח היסטולוגית ומכתים immunohistochemical 7, או חלבון תמצית 15 או RNA 11,16 מן האפיתל לanalys נוסףהוא. במידת הצורך, לשמור על התרבות בינונית המותנה לניתוח של מולקולות איתות תאית 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כתב יד זה מתאר את התהליך הנדרש, שמוצג בצורה סכמטית באיור 1, למודלי 3D תרבות של האפיתל הוושט האנושי בהצלחה. כדי לאשר את התאמתו של המודל כהיסטולוגית פלטפורמה ניסיונית ומחקרי immunohistochemical כבר התחייבו השוואת הרקמות התרבותית עם רירית הוושט קשקש אדם נורמלית.
הערכה היסטולוגית של האפיתל המיוצר על ידי השיטה המתוארת תערוכות האפיתל בוגר, רב שכבתי, מרובד קשקש (איור 2) אשר ניתן להשוות לזה שנצפה בוושט (איור 2 א) האדם הנורמלי, אם כי (5 עד 10 שכבות דקות יותר של תאים לעומת 10 עד 20 לושט הרגיל), עם התאים הולכים ולהחמיא וסופו של הדבר anuclear כפי שהם נודדים לכיוון פני השטח.
אפיון immunohistochemical של סמנים העיקריים של התפשטות ודיfferentiation להוכיח כי microanatomy של האפיתל המודל דומה לאפיתל הוושט האדם הנורמלי. ביטוי Ki67 דומה נצפה בשני וושט הילידים ואפיתל המודל, עם כתמים מוגבלים לקבוצת משנה של תאים בתוך הבסיס ושכבות מייד suprabasal (איורים 3 א ו 3 ב). זה דומה למחקרים שדיווחו כי פחות מ -10% מתאים בדרך כלל להראות ביטוי של סמן השגשוג, Ki67, באפיתל הוושט הרגיל 18. CK4 בדרך כלל לידי ביטוי בepithelia מרובדת ועמודים אך בדרך כלל נעדרים משכבות הבסיס תוך CK14 הוא חיובי רק בשכבת בסיס 19. בשני epithelia הוושט הנורמלי ומודל, CK14 הוא ציין בכל התאים בשכבת הבסיס (3D דמויות ו3E) תוך CK4 הוא ציין ברחבי אפיתל למעט שתי שכבות בסיסיות ביותר (איורים 3G ו
הניסיונות להחליף את תאי אפיתל הוושט העיקריים עם תאי אפיתל הונצחו בושט, כגון Het-1A, היו פחות מוצלחים ולא לייצר מודל תקף של אפיתל הוושט הרגיל. אפיתל רב שכבתי הוקם; עם זאת סמן שגשוג Ki67 זוהה לאורך אפיתל (איור 3 ג) ללא ביטוי המזוהה עבור כל סמנים של בידול (איורים 3F, 3I ו3L), מצביעים על כך שתאי Het-1A מיוצרים אפיתל hyperproliferative ללא עדות לריבוד או הרגילים התבגרות.
עם זאת, המודל היהשינוי בהצלחה לשלב תאים סרטניים על ידי ההחלפה של תאי האפיתל עיקריים עם או אדנוקרצינומה של הוושט (OE33) או קרצינומה של תאי קשקש (OE21). זה מדגים את הגמישות של המודל, המאפשר את השימוש בו בחקירת מגוון של הפרעות בושט בשלבים שונים של התקדמות באמצעות ההכללה של מספר שורות תאים שונים. ניתן לראות כי יש הבדל ניכר בתגובות משתי שורות תאים אלה. קרצינומה של תאי קשקש OE21 מייצר אפיתל גלוי על המבנה כאזור צהוב מוגדר (איור 4 א) עם שסעים גדולים באפיתל (איור 4), עשויים לשקף מולקולות הידבקות תא מתפקדות. כולל תאי אדנוקרצינומה OE33 בתוך תוצאות המודל בכמות גדולה של השפלה פיגום, גלויה על ידי העין כדילול של הפיגום לאחר צמיחת 2 שבועות על ממשק אוויר / נוזל (איור 4C) ואישר בניתוח H + E כירידה ברורה בעובי של הפיגום באזור שמתחת לתאים (איור 4D). זה עשוי להיות תוצאה של אינטראקציה בין התאים הסרטניים ופיברובלסטים, מאז ניוון הפיגום לא נצפה בהעדר fibroblasts (4E דמויות ו4F). יש לנו נצפו השפעות דומות על פלישת גידול בנוכחות והיעדרות של fibroblasts במודלים מלנומה שווים 21.
איור 1: תרשים סכמטי המציג את הייצור של מודל רירית הוושט הוושט fibroblasts אדם הם זורעים על פני השטח submucosal של הפיגום ותרבית למשך 7 ימים.. הפיגום הפוך, תאי אפיתל הוושט אדם הוסיפו ותרבותיים שקועים במשך 4 ימים. המבנה עולה לממשק אוויר נוזלי לבין 10 ל 20 daי"ש. בסוף ניסוי המבנה יכול לעבור ניתוח נוסף כנדרש. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.
איור 2: השוואה של האפיתל המיוצר במודל הוושט עם נורמלי אפיתל הוושט אנושי ניתוח H + E של אפיתל הוושט אדם הנורמלי () ואפיתל הוושט (ב ') הוקם במודל של רירית הוושט האדם.. בר סולם הוא 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.
איור 4: ההכללה של שורות תאי גידול בתוךמודל הוושט. תאי האפיתל העיקריים הוחלפו על ידי קו קשקש תא קרצינומה, OE21, או שורת תאי אדנוקרצינומה, OE33. תמונות מראות את המבנה עם תאי OE21 () או תאי OE33 או בשיתוף עם (ג) או בהעדר fibroblasts (E), לפני תיקון בתום תקופת התרבות. Epithelia כולל OE21 (ב) או תאי OE33 עם (ד) או בלי fibroblasts (F) הם דמיינו ידי צביעת H + E. בר סולם הוא 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כתב יד זה מתאר את הייצור ואפיון של מודל ברירית הוושט רלוונטי מבחינה ביולוגית אנושי מתאים לשימוש כפלטפורמה ניסיונית ללמוד את ההשפעה של חשיפה לגורמי לחץ סביבתי על אפיתל הוושט.
השלבים הקריטיים ביותר לייצור המוצלח של מודל ברירית הוושט אדם: להבטיח כי הרוב המכריע של תאי האפיתל להישאר שגשוג ולא התחיל כבר להבדיל לפני זריעתם על הפיגום; שמירה על ממשק אוויר נוזלי למרוכבים כדי להבטיח הבשלה נכונה של האפיתל; שמירה על סטריליות בכל תקופת התרבות המורחבת.
בשל הכמויות מוגבלות של רקמה אנושית הזמינות לבידוד תא זה הוא בדרך כלל לא ניתן להשיג מספיק תאים מדגימת רקמה אחת זרע תאים מבודדים טרי ישירות על גבי הפיגום וכתוצאה מכך ph הרחבת תאASE נדרש בו התאים גדלים בתנאי תרבית תאי 2D סטנדרטיים. חשוב לוודא שתאים יישארו שגשוג בתקופה זו. זו מושגת על ידי הבטחה שהתרבויות לא מורשות להגיע confluency מלא, תוך שימוש בתאים במודל רק עד למעבר 4 וניטור מורפולוגיה תא בזהירות. כך תאים צריכים לשמור המורפולוגיה שלהם ייחודי שגשוג מצולעים והאופייני ההדוק "מרוצף" כמו מדרכה-מראה של תאי האפיתל שגשוג ולא את המראה המפוזר יותר נצפה בתרבויות שהחלו להבחין. השלב הקריטי השני נשלט על ידי הבטחה כי מדיום תרבית תאים מכסה את פני השטח העליונים של רשתות נירוסטה משמשות להרים את התרבויות לממשק אוויר נוזלי אבל על פני השטח העליונים של המבנה עצמו אינו שקוע. הצעד השלישי תלוי בהקפדה על פרוטוקול העיקור הארוך כאשר ייצור דה-cellularizedפיגום חזירי ושימוש בטכניקה סטרילית טובה לאורך כל התהליך.
התוצאות שלנו מראות כי תאי הוושט אנושיים ראשוניים נדרשים לייצר אפיתל נורמלי, בוגר, מרובד. אם נעשה שימוש בשורת תאים הנציחה, אם כי נגזר מאפיתל הוושט האנושי, התאים נשארו שגשוג ולא הצליחו להבחין בצורת אפיתל מרובדת בוגרת. האפיתל וכתוצאה מכך לא יכול לשמש כמודל מספק לאפיתל הנורמלי, הממחיש את אי-ההתאמה של הקו סלולארי הונצח Het-1A לשימוש במודל. עם זאת ניתן לשלב שורות תאים אחרות, כגון אלו המתקבלים מגידולים בושט או מטפלזיה של בארט למודל או במקום או בנוסף לתאי האפיתל העיקריים לייצר מודלים לחקר התקדמות גידול, פלישה והתגובה לסוכנים תרופתיים.
ניתן לבצע ניסויים תוך שימוש במודל של הוושט ליםimulate החשיפה של הוושט לבדיד אירועים, pulsatile בבליעה או רפלוקס. זו מושגת על ידי השריית שוב ושוב המבנים במדיום תרבות המכיל התרכובת (ים) להיבדק ושטיפה בPBS לפני החזרת המבנה לממשק אוויר נוזלי. ניתן לשנות זמני החשיפה והתדירות כדי לשקף את התהליך שמדומה, להבטיח כי את שכבת האפיתל חשופה לגורם הסביבתי (ים) תוך מתן אפשרות לתרבות להמשיך בממשק אוויר נוזלי. שיטה זו נעשתה שימוש במעבדה שלנו כדי לחקור את ההשפעה של ריפלוקס באפיתל הוושט הרגיל, שבו המודל נחשף למרכיבי ריפלוקס גסטרו-הוושט ספציפיים במשך 10 דקות פעמיים ביום למשך 11 ימים 11. לחלופין יכול להיות חשופה לרמות בונה רציפות של גורמי לחץ סביבתיים על ידי כולל תרכובות אלה במדיום התרבות. עם זאת, מאז האפיתל חייב להיות חשוף לממשק אוויר נוזלי לepitheאיליום להתבגר ולבדל כראוי 7, לא ניתן לצלול ברציפות המבנים במדיום התרבות. כתוצאה מכך, חשיפה ללחץ תהיה רק באמצעות משטח submucosal בניסויים אלה, שעלולים להגביל את הרלוונטיות של תוצאות שהתקבלו.
הטכניקה היא יחסית עבודה אינטנסיבית וכתוצאה מכך הוא מתאים יותר להקרנת מספרים מצומצמים יחסית של תרכובות. כתוצאה מכך, בעת שימוש במודל כפלטפורמה ניסיונית, זה מתאים לראשון לבצע מחקרים ראשוניים תוך שימוש בטכניקות תרבות תא קונבנציונליות לזהות מספר מוגבל של תנאים מוקדמים לניתוח נוסף תוך שימוש במודל הוושט יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית שתואר כאן 11. בנוסף לניתוח immunohistochemical זה כבר ניתן גם לבחון שינויים בפרופיל ביטוי גני אפיתל בעקבות חשיפה לפגעי סביבה. זו הושגה על ידי הפשטה משם באופן ידני את הדוארpithelium, חילוץ RNA והפיכתו לcDNA כדי לבודד את הגנים לידי ביטוי וניתוח על ידי microarray לקבל ביטוי גני פרופילי 11. בדרך זו ניתן היה להגדיל את המידע זמין מהמודל כפלטפורמה ניסיונית. שינויים מוקדמים בפרופיל ביטוי גני אפיתל בעקבות חשיפה מדומה לריפלוקס גסטרו-הוושט הוצעו ומתוצאות אלה תחומים חדשים הוצעו לחקירה נוספת במניעת התפתחותו של בארט מטפלזיה, מבשר metaplastic 11 OAC. המודל יכול לשמש גם כדי ללמוד ביטוי חלבון בשיטות כגון ניתוח מערבי כתם 15 וביטוי גנים באמצעות ניתוח כתם צפון 16. מחקרי יתר על כן של מולקולות איתות תאית יכולים להתבצע על מדיום התרבות 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים למר רוג'ר אקרויד, מר אנדרו ויימן ומר כריס Stoddard, יועץ מנתחים בשפילד הוראת בתי החולים NHS Foundation Trust, לעזרתם ברכישת דגימות רקמת הוושט ותמיכתם של העבודה שלנו. אנו מודים Ashraful Haque על עזרתו בשילוב שורות תאי גידול למודל. הכרת תודה אנו מודים תמיכה כספית למחקר זה על ידי מענקים מBardhan המחקר והחינוך בנאמנות (ברנדה) וחקר סרטן יורקשייר (YCR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | BD Biosciences | 215240 | Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilize. Warm in 37 °C water bath before use. |
| DMEM | Labtech | LM-D1112 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Ham's F12 | Labtech | LM-H1236 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Foetal Calf Serum | Labtech | FB-1090 | |
| Epidermal Growth Factor | R+D Systems | 236-EG-200 | Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS |
| Hydorcortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2767 | Prepare 10 mg/ml solution in 0.01 M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilize before use |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T2036 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | Prepare stock solution in water |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Brand name Fungizone |
| PBS | Oxoid | BR0014 | Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilize |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| Povidone-iodine solution | Ecolab | 10830E | Brand name Videne |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| Newborn calf serum | Gibco | 26010074 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use use |
| O-phosphorylethanolamine | Sigma-Aldrich | P0503 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Lonza | 17-838Z | Used for composite media preparation |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | Warm in 37 °C water bath before use |
| EDTA 0.02% solution | Sigma-Aldrich | E8008 | Warm in 37 °C water bath before use |
| T75 culture flask | VWR | 734-2313 | |
| 50 ml centrifuge tube | Fisher | 11819650 | |
| 15 ml universal tube | SLS | SLS7504 | |
| 180 ml pot | VWR | 216-2603 | |
| Petri dish | SLS | 150350 | |
| 6 well plate | VWR | 734-2323 | |
| stainless steel rings | Manufactured in house - medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm | ||
| steel mesh grids | Manufactured in house - sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2 cm (w) x 2 cm (d) x 0.5 cm (h) | ||
| ki67 | Novocastra | KI67-MM1-L-CE | Clone MM1. Use at 1:100. |
| CK4 | Abcam | ab9004 | Clone 6B10. Use at 1:200. |
| CK14 | Novocastra | LL002-L-CE | Clone LL002. Use at 1:200. |
| Involucrin | Novocastra | INV | Clone SY5. Use at 1:100. |
| OE21 | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| OE33 | Sigma-Aldrich | 96070808 | |
| Het-1A | ATCC-LGC | CRL-2692 | |
| Mouse 3T3 fibroblasts | ATCC-LGC | CRL-1658 | previously growth arrested by irradiation (60 Gy) |
References
- Pera, M., Manterola, C., Vidal, O., Grande, L. Epidemiology of esophageal adenocarcinoma. J. Surg. Oncol. 92 (3), 151-159 (2005).
- Manea, G. S., Lupusoru, C., Caruntu, I. D. Experimental study on the effect of bile, and bile and hydrochloric acid mixture on the esophageal mucosa. Rom. J. Morphol. Embryol. 50 (1), 61-66 (2009).
- Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 278 (3), 1824-1830 (2003).
- Underwood, T. J., et al. A comparison of primary oesophageal squamous epithelial cells with HET-1A in organotypic culture. Biol. Cell. 102 (12), 635-644 (2010).
- Nystrom, M. L., et al. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J. Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Okawa, T., et al. The functional interplay between EGFR overexpression, hTERT activation, and p53 mutation in esophageal epithelial cells with activation of stromal fibroblasts induces tumor development, invasion, and differentiation. Genes & Development. 21 (21), 2788-2803 (2007).
- Green, N., et al. The development and characterization of an organotypic tissue-engineered human esophageal mucosal model. Tissue Eng Part A. 16 (3), 1053-1064 (2010).
- Harada, H., et al. Telomerase induces immortalization of human esophageal keratinocytes without p16INK4a inactivation. Mol. Cancer Res. 1 (10), 729-738 (2003).
- Bhargava, S., Chapple, C. R., Bullock, A. J., Layton, C., MacNeil, S. Tissue-engineered buccal mucosa for substitution urethroplasty. BJU. Int. 93 (6), 807-811 (2004).
- Ralston, D. R., et al. Keratinocytes contract human dermal extracellular matrix and reduce soluble fibronectin production by fibroblasts in a skin composite model. Br. J. Plast. Surg. 50 (6), 408-415 (1997).
- Green, N. H., et al. Pulsatile exposure to simulated reflux leads to changes in gene expression in a 3D model of oesophageal mucosa. Int. J. Exp. Pathol. 95 (3), 216-228 (2014).
- Wang, C. S., et al. Selective culture of epithelial cells from primary breast carcinomas using irradiated 3T3 cells as feeder layer. Pathol. Res. Pract. 197 (3), 175-181 (2001).
- Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. J. Vis. Exp. (16), e755 (2008).
- Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2014).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N. Am. J. Med. Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat. Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Morgan, E., et al. Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clin. Immunol. 110 (3), 252-266 (2004).
- Xu, M., et al. The abnormal expression of retinoic acid receptor-beta, p 53 and Ki67 protein in normal, premalignant and malignant esophageal tissues. World J. Gastroenterol. 8 (2), 200-202 (2002).
- Moll, R., Divo, M., Langbein, L. The human keratins: biology and pathology. Histochem. Cell Biol. 129 (6), 705-733 (2008).
- Rice, R. H., Green, H. Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross-linked envelope: activation of the cross-linking by calcium ions. Cell. 18 (3), 681-694 (1979).
- Eves, P., et al. Melanoma invasion in reconstructed human skin is influenced by skin cells - investigation of the role of proteolytic enzymes. Clin. Exp. Metastasis. 20 (8), 685-700 (2003).
