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Bioengineering

एक 3 डी ऊतक इंजीनियर मानव इसोफेजियल mucosal मॉडल का उत्पादन, लक्षण और क्षमता का उपयोग करता

Published: May 18, 2015 doi: 10.3791/52693
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Materials Science and Engineering, University of Sheffield, 2Department of Oncology and Insigneo Institute for in silico Medicine, University of Sheffield, 3Department of Histopathology, Sheffield Teaching Hospitals NHS Foundation Trust

Summary

इस पांडुलिपि उत्पादन, लक्षण और सामान्य प्राथमिक मानव esophageal तंतुप्रसू और एक de-cellularized सुअर का पाड़ के भीतर वरीयता प्राप्त स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं से तैयार एक ऊतक इंजीनियर 3 डी esophageal निर्माण की क्षमता का उपयोग करता वर्णन करता है। परिणाम सामान्य मानव घेघा करने के लिए इसी तरह की एक परिपक्व स्तरीकृत उपकला के गठन प्रदर्शित करता है।

Abstract

esophageal ग्रंथिकर्कटता और उसके अग्रदूत, बैरेट इतरविकसन दोनों की घटनाओं, पश्चिमी दुनिया में तेजी से बढ़ रहे हैं। इसके अलावा esophageal ग्रंथिकर्कटता आम तौर पर हाल के वर्षों में जीवित रहने की दरों में थोड़ा सुधार के साथ एक गरीब रोग का निदान है। ये अध्ययन करने के लिए कठिन परिस्थितियों कर रहे हैं और esophageal म्यूकोसा के विकारों की जांच के लिए उपयुक्त प्रयोगात्मक प्लेटफार्मों की कमी हुई है।

मानव esophageal म्यूकोसा की एक मॉडल पारंपरिक 2 डी सेल संस्कृति प्रणालियों के विपरीत, विवो में मौजूद सेल सेल और सेल-मैट्रिक्स बातचीत का स्मरण दिलाता है और सामान्य मानव के समान एक परिपक्व, स्तरीकृत उपकला पैदा करता है, जो मेकनेल प्रयोगशाला में विकसित किया गया है घेघा। संक्षेप में, मॉडल एक सुअर का व्युत्पन्न अकोशिकीय esophageal पाड़ के भीतर हो गैर तब्दील प्राथमिक मानव esophageal fibroblasts के सामान्य और उपकला कोशिकाओं का इस्तेमाल करता है। इस मॉडल के immunohistochemical लक्षण वर्णनCK4, CK14, Ki67 द्वारा और involucrin धुंधला सामान्य मानव esophageal mucosa के ऊतक विज्ञान की उचित आवृत्ति को दर्शाता है।

इस मॉडल को मानव esophageal म्यूकोसा के एक मजबूत, जैविक रूप से प्रासंगिक प्रयोगात्मक मॉडल प्रदान करता है। यह आसानी से औषधीय एजेंटों की प्रभावशीलता और ऐसी शराब, जहर, उच्च तापमान या गैस्ट्रो esophageal refluxate घटक के रूप में पर्यावरणीय कारकों के लिए जोखिम के प्रभाव सहित अनुसंधान सवालों का एक नंबर की जांच करने के लिए चालाकी से किया जा सकता है। मॉडल भी सक्रिय करने के पारंपरिक 2 डी सेल संस्कृति, अन्य बातों के साथ साथ प्राप्त नहीं बढ़ाया संस्कृति अवधि की सुविधा, अप करने के लिए 20 दिनों के लिए ब्याज की एजेंट को एक परिपक्व उपकला के कई बार प्रदर्शन के प्रभाव का अध्ययन। इसके अलावा, इस तरह के esophageal ट्यूमर या बैरेट इतरविकसन से ली गई उन के रूप में सेल लाइनों की एक किस्म है, ऐसे ट्यूमर आक्रमण और नशीली दवाओं के responsivene के रूप में प्रक्रियाओं की जांच के लिए मॉडल में शामिल किया जा सकता हैएक और अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक वातावरण में एस एस।

Introduction

esophageal म्यूकोसा संयोजी ऊतक, लामिना propria की एक परत के ऊपर एक स्तरीकृत, स्क्वैमस उपकला शामिल हैं, और किया जाता पर्यावरण तनाव मुठभेड़ की पहली साइटों में से एक है। Duodenogastro esophageal भाटा esophageal ग्रंथिकर्कटता करने के लिए प्रगति की वृद्धि की जोखिम के साथ जुड़ा हुआ है जो बैरेट इतरविकसन, के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण कारक है, जबकि आहार विषाक्त पदार्थों के संपर्क में, esophageal स्क्वैमस कार्सिनोमा के विकास में फंसा है। इसोफेजियल कार्सिनोमा ब्रिटेन पुरुषों और esophageal ग्रंथिकर्कटता में 8 वें सबसे आम घातक ट्यूमर को तेजी से पश्चिमी दुनिया 1 में बढ़ती जा रही है कर रहे हैं। इसके अलावा, लगभग 15% की समग्र 5 साल की जीवित रहने की दर के साथ रोग रोग का निदान में थोड़ा सुधार, कर दिया गया है। नतीजतन विकास में इस esophageal उपकला पर पर्यावरण तनाव के लिए जोखिम के प्रभाव और उनके संभावित संलिप्तता की जांच के लिए प्रयोगात्मक प्लेटफार्मों के लिए एक की जरूरत हैइतरविकसन या रसौली के pment।

अमर या ट्यूमर सेल लाइनों शोधकर्ताओं इन विट्रो में इन तनाव को उपकला कोशिकाओं की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने की अनुमति है, वे प्रफलन रहते हैं और esophageal म्यूकोसा के ऊपरवाला परतों पर पाया परिपक्व उपकला कोशिकाओं में अंतर करने में विफल। इसके अलावा, पहले से ही tumorigenesis आया है कि कोशिकाओं लाइनों पर्यावरणीय कारकों के उपकला के भीतर सामान्य कोशिकाओं की प्रारंभिक प्रतिक्रिया के बारे में केवल सीमित जानकारी उपलब्ध करा सकता है; और इस चिकित्सकीय हस्तक्षेप के लिए संभावित उच्चतम हो सकता है जब मंच है। अंत में, पारंपरिक सेल संस्कृति प्रणालियों उपकला और mesenchymal कोशिकाओं के बीच और vivo में ऊतकों के भीतर होती है कि इन कोशिकाओं और आसपास के मैट्रिक्स के बीच संभावित महत्वपूर्ण बातचीत पर कब्जा करने में विफल।

पशु मॉडलों esophageal epitheli की प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक और अधिक यथार्थवादी माइक्रोएन्वायरमेंट प्रदानउम और गैस्ट्रो esophageal भाटा रोग 2 की कृत्रिम प्रेरण शामिल कर सकते हैं। हालांकि यह इन मॉडलों में पर्यावरण तनाव में हेरफेर करने के लिए और अधिक चुनौतीपूर्ण हो सकता है और वे पूरी तरह से मानव घेघा के भीतर प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं।

अन्य प्रयोगात्मक मानव esophageal मॉडल एक कोलेजन पर प्राथमिक कोशिकाओं, अमर कोशिकाओं या ट्यूमर सेल लाइनों का उपयोग कि विकसित की है, या कोलेजन / Matrigel, पाड़ युक्त fibroblasts 3,4 संयुक्त किया गया है। यह इस पांडुलिपि में वर्णित अकोशिकीय esophageal पाड़ की तुलना में इन मचान उत्पन्न करने के लिए कम श्रम गहन है, और इन organotypic मॉडल विशेष रूप से कोलेजन जेल में ट्यूमर सेल घुसपैठ आसानी से किया जा सकता है, जहां ट्यूमर आक्रमण 5,6, के अध्ययन में एक उपयोगी उपकरण प्रदान मनाया। हालांकि इन कोलेजन जैल गैर देशी यांत्रिक गुण होते हैं और एक विशिष्ट तहखाने झिल्ली और appropriat सहित मूल ऊतक के कुछ सुविधाओं का अभावई सतह स्थलाकृति। एक कोलेजन जेल पाड़ 7 का उपयोग करते हैं तो यह, उदाहरण के लिए, उपकला और पाड़ के बीच गरीब आसंजन में जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं के व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं। एक परिणाम के रूप में अकोशिकीय सुअर का esophageal पाड़ एक अधिक जैविक रूप से यथार्थवादी पाड़ और एक प्रयोगात्मक मंच के रूप में इस्तेमाल के लिए इस प्रकार अधिक उपयुक्त होने का लाभ के साथ, विकसित किया गया था। यह भी यह है कि इन कोशिकाओं को एक बहुस्तरीय उपकला फार्म के बाद से, इस तरह के हेट-1A के रूप में अमर esophageal उपकला कोशिका लाइनों, की तुलना में esophageal निर्माणों में प्राथमिक कोशिकाओं को शामिल लेकिन विभक्त हो जाना या 4,7,8 अंतर करने के लिए विफल करने के लिए बेहतर है कि दिखाया गया है ।

नतीजतन, इस प्रोटोकॉल पहले से ही ऊतक इंजीनियर त्वचा और मौखिक mucosa 9,10 बनाने के लिए मेकनेल प्रयोगशाला में प्रयोग में एक विधि से अनुकूलित और प्राथमिक मानव esophageal उपकला कोशिकाओं और fibroblasts के साथ संयुक्त एक डे-cellularized सुअर का esophageal पाड़ को शामिल किया गया है। थीCK4, CK14, Ki67 द्वारा और धुंधला involucrin के रूप में प्रदर्शन के प्रोटोकॉल सामान्य मानव घेघा के समान एक परिपक्व, स्तरीकृत उपकला, पैदा करता है। जिसके परिणामस्वरूप मॉडल पर्यावरण तनाव के लिए प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक प्रयोगात्मक मंच प्रदान करता है, और घटकों 11 refluxate के जवाब में esophageal उपकला में जीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन की जांच करने के लिए प्रभावी ढंग से इस्तेमाल किया गया है।

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Protocol

मानव esophageal कोशिकाओं गैस्ट्रिक या esophageal सर्जरी के दौर से गुजर रोगियों से प्राप्त कर रहे हैं। ऊतक अनुसंधान प्रयोजनों के लिए उपयोग किए जाने के लिए सूचित सहमति प्राप्त की है, और ऊतक उचित नैतिक अनुमोदन (SSREC 165/03, मानव अनुसंधान ऊतक बैंक लाइसेंस के 12,179) के तहत गुमनाम इस्तेमाल किया।

मानव इसोफेजियल उपकला कोशिकाओं के 1. अलगाव

  1. : 1 के अनुपात एक लामिना का प्रवाह टिशू कल्चर हुड में काम करने और बाँझ तकनीक का उपयोग कर, Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) और एक 3 में हाम F12 के मिश्रण से उपकला संस्कृति के माध्यम से तैयार (V: वि)। 10% जोड़ें (वी / वी) एफसीएस, 10 एनजी / एमएल epidermal वृद्धि कारक, 0.4 माइक्रोग्राम / एमएल hydrocortisone, 1.8 एक्स 10 -4 एम एडिनाइन, 5 माइक्रोग्राम / एमएल इंसुलिन, 5 माइक्रोग्राम / एमएल transferrin, 2 एक्स 10 -7 एम ट्राईआयोडोथायरोनिन, 1 एक्स 10 -10 एम हैजा विष, 2 एक्स 10 -3 एम glutamine, 100 आइयू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 0.625 माइक्रोग्राम / एमएल Amphotericin बी
  2. मानक का प्रयोगबाँझ तकनीक, एक T75 टिशू कल्चर फ्लास्क में 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन DMEM के 11 मिलीलीटर, 10% एफसीएस, 2 एक्स 10 -3 एम एल glutamine, 100 आइयू / एमएल पेनिसिलिन, और 0.625 माइक्रोग्राम / एमएल Amphotericin बी डाल दिया। एक ही माध्यम के 1 मिलीलीटर में 1 एक्स 10 6 घातक विकिरणित माउस 3T3 fibroblasts के 12 जोड़े और एक 5% सीओ 2, humidified माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं। इस उपकला कोशिकाओं के बाद संस्कृति के लिए एक फीडर परत का उत्पादन होगा।
  3. एक स्केलपेल का उपयोग करना और एक histopathologist की सिफारिशों का पालन, गैस्ट्रिक या esophageal सर्जरी के दौर से गुजर रोगियों से प्राप्त esophageal स्क्वैमस म्यूकोसा की रोग-मुक्त पृष्ठभूमि क्षेत्र से ऊतक के एक लगभग 2 सेमी 2 नमूना काटना। बाँझ परिवहन माध्यम से एक 50 मिलीलीटर कंटेनर में प्रयोगशाला के लिए परिवहन (पीबीएस 100 आइयू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन और 0.625 माइक्रोग्राम / एमएल Amphotericin बी) कमरे के तापमान पर।
  4. इस बिंदु पर, परिवहन में ऊतक की दुकान4 डिग्री सेल्सियस (रातोंरात) करने के लिए 12 घंटे के लिए मध्यम, सुविधा के लिए; वे कम सेल व्यवहार्यता में परिणाम के रूप में हालांकि अब भंडारण अवधि का उपयोग नहीं करते।
  5. एक लामिना का प्रवाह टिशू कल्चर हुड में काम करने और बाँझ तकनीक का उपयोग करते हुए, 5 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में भिगोने से एक स्केलपेल ब्लेड बाँझ। बाँझ पीबीएस में कुल्ला।
  6. एक बाँझ पेट्री डिश में ऊतक प्लेस और 0.5 सेमी स्ट्रिप्स में कटौती करने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें। 0.1% की 5 मिलीलीटर जोड़ें पेट्री डिश के लिए पीबीएस में ट्रिप्सिन (w / v), डिश पर ढक्कन जगह और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  7. ट्रिप्सिन को बाधित करने के लिए पेट्री डिश में ऊतकों को एफसीएस के 5 मिलीलीटर जोड़ें। पट्टी प्रति 1-2 मिनट के आसपास के माध्यम में उपकला कोशिकाओं को दूर करने के लिए बाँझ संदंश के साथ ऊतक की पट्टी होल्डिंग, धीरे स्केलपेल ब्लेड के साथ उपकला सतह परिमार्जन। Scraped ऊतक निकालें और अलग निर्धारित करें। सभी ऊतक स्ट्रिप्स के लिए प्रक्रिया को दोहराएं।
  8. एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में अलग उपकला कोशिकाओं से युक्त मध्यम लीजिएऔर सेंट्रीफ्यूज (5 मिनट, 200 XG)। सतह पर तैरनेवाला डालो और उपकला माध्यम के 12 एमएल में गोली resuspend (1.1 चरण में वर्णित)।
  9. बंद डालो और 1.2 चरण में तैयार T75 फ्लास्क में फीडर सेल परत से मध्यम त्यागें। एक 5% सीओ 2, humidified माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क हौसले से अलग उपकला कोशिकाओं से युक्त सेल निलंबन जोड़ने और सेते एक बाँझ पिपेट का प्रयोग करें।
  10. 24 घंटे के बाद बंद डालना और भी सेल मलबे में शामिल होंगे, जो संस्कृति के माध्यम से, त्यागने, और ताजा उपकला माध्यम के 12 एमएल के साथ बदलें। एक 5% सीओ 2, humidified माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस पर incubating जारी रखें। कालोनियों अगले 24-48 घंटे से अधिक प्रकट करने के लिए शुरू कर देंगे और एक मानक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत संस्कृति कुप्पी रखकर देखा जा सकता है। खर्च की संस्कृति के माध्यम से दूर डालो और ताजा माध्यम के एक बराबर मात्रा हर 2 से 3 दिनों के साथ बदलें।
  11. कुप्पी 80 confluency%, पारित होने की कोशिकाओं को 13 तक पहुँच गया है। सी स्प्लिट1 के अनुपात में एल: 5 मॉडल में इस्तेमाल के लिए सेल नंबर बढ़ाने के लिए। कोशिकाओं passaging करने के लिए 24 घंटे पूर्व उपकला कोशिकाओं को प्राप्त हो जाएगा कि प्रत्येक फ्लास्क में किरणित 3T3 कोशिकाओं के फीडर परतों की स्थापना के लिए 1.2 चरण का पालन करें।
    नोट: मार्ग 1 और केवल 4 के बीच में नीचे वर्णित esophageal मॉडल में उपकला कोशिकाओं का उपयोग करें।

मानव इसोफेजियल fibroblasts की 2. अलगाव

  1. एक लामिना का प्रवाह कैबिनेट में काम करने और बाँझ तकनीक का उपयोग कर, कदम 1.7 में अलग सेट ऊतक ले। एक बाँझ पेट्री डिश में रखें और एक बाँझ स्केलपेल ब्लेड से काट द्वारा सूक्ष्मता कीमा। (V / डब्ल्यू) एक समाधान collagenase और पेट्री डिश पर ढक्कन जगह और एक 5% सीओ 2, humidified माहौल में रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते 0.5% की 10 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. ध्यान से, एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र (10 मिनट, 200 XG) के लिए डाइजेस्ट स्थानांतरण बंद डालना और सतह पर तैरनेवाला त्यागें और fibroblast संस्कृति मध्यम (DMEM 10% एफसीएस के 10 एमएल में गोली resuspend, 2 एक्स 10 -3 एम एल glutamine, / एमएल पेनिसिलिन 100 आइयू, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 0.625 माइक्रोग्राम / एमएल Amphotericin बी)।
  3. एक T75 फ्लास्क में निलंबन प्लेस और एक 5% सीओ 2, humidified माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। 24 घंटे के बाद मलबे में होते हैं और ताजा तंतुप्रसू माध्यम के 12 मिलीलीटर के साथ की जगह लेगा जो मध्यम, टपकना। सेल नंबर बढ़ाने के लिए 5 अनुपात: वे एक 1 में कोशिकाओं बंटवारे, 80 confluency% 13 तक पहुँच चुके हैं एक बार संस्कृति के माध्यम से हर 2 से 3 दिन और बीतने कोशिकाओं की जगह।
    नोट: मार्ग 4 और केवल 10 के बीच में नीचे वर्णित मॉडल में fibroblast कोशिकाओं का उपयोग करें।

डी-cellularized इसोफेजियल पाड़ के 3. तैयारी

  1. खाद्य उत्पादन के लिए उपयोग किया जाता है कि हौसले बलि Landrace सूअरों से एक वधशाला पर बरकरार सुअर का घेघा प्राप्त करते हैं। एक एकल घेघा लगभग 30 अलग निर्माणों के लिए पर्याप्त मचान प्रदान करेगा।
    नोट: कारण व्यापक और समय सह करने के लिएनसबंदी प्रोटोकॉल आवश्यक nsuming, इसे प्राप्त करने के लिए और एक समय में 10 घेघा की एक न्यूनतम प्रसंस्करण सामान्य रूप से लायक है।
  2. तुरंत किसी भी दूषित माइक्रोबियल भार को कम करने के लिए 5 मिनट के लिए 10% povidone आयोडीन समाधान के लगभग 150 मिलीग्राम से युक्त एक 180 मिलीलीटर बाँझ बर्तन में हौसले से excised घेघा जगह है। / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन 200 आइयू / एमएल पेनिसिलिन, 200 माइक्रोग्राम, और 1.25 माइक्रोग्राम / एमएल Amphotericin बी युक्त बाँझ पीबीएस के लगभग 100 मिलीग्राम से युक्त एक दूसरे बर्तन में घेघा स्थानांतरण
    1. कंटेनर पर ढक्कन बदलें और कमरे के तापमान पर वापस प्रयोगशाला में घेघा परिवहन। दो या तीन घेघा उनके आकार पर निर्भर करता है, प्रत्येक कंटेनर में ले जाया जा सकता है।
  3. प्रयोगशाला में एक बार, माइक्रोबियल संदूषण को कम करने के लिए सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग कर एक लामिना का प्रवाह हुड में ऊतक संभाल। 70% इथेनॉल में 5 मिनट के लिए भिगोने, और बाँझ पीबीएस में rinsing द्वारा चिमटी, कैंची और स्केलपेल ब्लेड जीवाणुरहित।
  4. तों संभालophagus बाँझ चिमटी का उपयोग कर। कैंची का प्रयोग, अनुलंबीय घेघा खुला काटा। बाँझ पीबीएस के लगभग 100 मिलीग्राम से युक्त एक 180 मिलीलीटर बाँझ बर्तन में घेघा रखने और किसी भी मलबे को हटाने के लिए धीरे झटकों से ऊतक कुल्ला।
  5. उदारतापूर्वक के साथ 70% इथेनॉल के छिड़काव द्वारा एक काग विच्छेदन बोर्ड को साफ और शुष्क करने की अनुमति देते हैं।
  6. बोर्ड, mucosal सतह ऊपरवाला पर घेघा बाहर पिन, पीबीएस से घेघा निकालें, और बाँझ सुई के प्रयोग से। बाँझ चिमटी के साथ घेघा के एक छोर पर mucosal सतह समझ और दूर बोर्ड से खींच। यह अंतर्निहित submucosa से म्यूकोसा अलग कर देगा।
    1. फिर, विच्छेदन म्यूकोसा दूर उठाया जा करने के लिए अनुमति देने के लिए प्रगति के रूप में पिन को हटाने, लामिना propria साथ अनुलंबीय घेघा काटना एक बाँझ स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करें।
  7. विच्छेदित म्यूकोसा रखें और अंतर्निहित submucosa त्यागें।
  8. कट और टी के सबसे प्रॉक्सिमल और बाहर 2 सेमी त्यागनेक्रमश: 7 उन क्षेत्रों में submucosal ग्रंथियों की एक बड़ी संख्या है और एक मोटा लामिना propria वहाँ के रूप में वह म्यूकोसा।
  9. 5 सेमी 2 में शेष ऊतक में कटौती करने के लिए एक स्केलपेल का प्रयोग करें। बाँझ पीबीएस के लगभग 150 मिलीग्राम से युक्त एक 180 मिलीलीटर बाँझ बर्तन में सभी कट ऊतक प्लेस और ऊतक कुल्ला करने के लिए धीरे आंदोलन। एक समय में अधिक से अधिक पांच घेघा प्रसंस्करण, तो यह इस बात के लिए कई बर्तन और तीन बाद के चरणों का उपयोग करने के लिए आवश्यक हो सकता है।
  10. बाँझ चिमटी का प्रयोग, 37 डिग्री सेल्सियस पर 72 घंटे के लिए 150 बाँझ 1 एम NaCl के मिलीलीटर, 200 आइयू / एमएल पेनिसिलिन, 200 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन और 1.25 माइक्रोग्राम / एमएल Amphotericin बी सेते युक्त 180 मिलीलीटर बर्तन में कटौती ऊतक हस्तांतरण।
  11. 150 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस युक्त एक ताजा 180 मिलीलीटर बर्तन में ऊतक रखें। उपकला दिख अंतर्निहित ऊतक से अलग करने के लिए शुरू कर दिया है जाएगा। धीरे सुअर घेघा से detaching उपकला बाँझ संदंश का उपयोग और त्यागने छील।
    1. शेष टी रखेंएक ताजा 180 मिलीलीटर बर्तन में इस मुद्दे को और बाँझ पीबीएस के 150 मिलीलीटर जोड़ें। 5 मिनट धोने के लिए के लिए धीरे आंदोलन। पीबीएस डालो और ताजा पीबीएस के साथ एक और दो बार दोहराएँ।
  12. कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए बाँझ 80% की 400 मिलीलीटर (वी / वी) ग्लिसरॉल समाधान युक्त 500 मिलीलीटर कांच की बोतल में सभी ऊतक रखें। एक और 24 घंटे के लिए बाँझ 90% (वी / वी) ग्लिसरॉल समाधान के 400 मिलीलीटर के लिए स्थानांतरण।
  13. निर्जलीकरण और तहखाने झिल्ली की अखंडता बनाए रखने, जबकि ऊतक बाँझ 4 महीने की एक न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर बाँझ 100% ग्लिसरॉल समाधान के 400 मिलीलीटर में स्टोर।

संस्कृति मीडिया के 4. उत्पादन

  1. संस्कृति के माध्यम में उपयोग के लिए chelated नवजात बछड़े सीरम तैयार करें।
    1. एक गिलास 1 एल बोतल में Chelex 100 से 100 ग्राम डालो और de-ionized पानी जोड़ें। सटीक मात्रा महत्वपूर्ण नहीं है, लेकिन पर्याप्त पानी Chelex पाउडर कवर करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए। एक चुंबकीय उत्तेजक जोड़ें और वाष्पदावी (121 डिग्री सेल्सियस के लिए से जीवाणुरहित15 मिनट)।
    2. बोतल शांत करने के लिए अनुमति दें और Chelex व्यवस्थित करने के लिए। एक लामिना का प्रवाह कैबिनेट में, अतिरिक्त पानी टपकना नवजात बछड़े सीरम (NCS) के 500 मिलीलीटर जोड़ने और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात हलचल करने के लिए छोड़ दें।
    3. सरगर्मी बंद करो और Chelex इस 30 मिनट तक का समय लग सकता है, व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं। एक लामिना का प्रवाह कैबिनेट में -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिलीलीटर aliquots में Chelex, और दुकान को परेशान करने की नहीं, देखभाल करने के लिए एक बाँझ पिपेट का उपयोग chelated सीरम छानना।
  2. समर्थक प्रफलन के साथ शुरू और समर्थक differentiative योगों के साथ समाप्त, एक लामिना का प्रवाह कैबिनेट में तीन अलग-अलग मीडिया तैयार करें।
    1. 1 अनुपात (V:: वि), 4 एक्स 10 -3 एम एल glutamine, 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल hydrocortisone, 1 एक्स 10 -4 एम ओ -phosphorylethanolamine, 2 एक्स कम्पोजिट मध्यम तैयार मैं एक 3 में DMEM और hams F12 के शामिल 10 -12 एम ट्राईआयोडोथायरोनिन, 1.8 एक्स 10 -4 एम एडिनाइन, 1.88 एक्स 10 -3 एम 2 CaCl, 4 एक्स 10 -12 एम प्रोजेस्टेरोन, 10 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर मेंsulin, 10 माइक्रोग्राम / एमएल transferrin, 10 एनजी / एमएल सेलेनियम, 1 एक्स 10 -3 एम ethanolamine और 0.1% (वी / वी) chelated NCS।
    2. 0.1% (वी / वी) गैर-chelated NCS साथ chelated सीरम की जगह को छोड़कर कम्पोजिट मध्यम मैं के रूप में मिश्रित मध्यम द्वितीय तैयार करें।
    3. 2% (वी / वी) गैर-chelated NCS करने के लिए न आना प्रोजेस्टेरोन और वृद्धि सीरम छोड़कर कम्पोजिट मध्यम द्वितीय के रूप में समग्र मध्यम तृतीय तैयार करें।

मानव इसोफेजियल Mucosa मॉडल 5. उत्पादन

  1. एक बाँझ वातावरण बनाए रखने के लिए सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग कर, एक लामिना का प्रवाह हुड में सभी काम करते हैं। बाँझ पीबीएस में rinsing से पहले, 5 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में भिगोने से सभी उपकरण जीवाणुरहित।
  2. यह आवश्यक है, पहले दिन, अकोशिकीय सुअर का esophageal पाड़ rehydrate। प्रत्येक निर्माण के लिए तैयार रहना करने के लिए चबूतरा का एक टुकड़ा आवश्यक है।
    1. बाँझ पीबीएस के 100 मिलीग्राम से युक्त एक बर्तन में सुअर का पाड़ के ऊतक जगह पर्याप्त टुकड़े rehydrate करने के लिए, आंदोलन और 10 मिनट के लिए भिगो दें। Decaपीबीएस NT और ताजा पीबीएस के साथ बदलें। सभी ग्लिसरॉल निशान को हटाने के सुनिश्चित करने के लिए कपड़े धोने की प्रक्रिया पांच बार दोहराएं।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात DMEM के 100 मिलीलीटर में rehydrated ऊतक incubating द्वारा पाड़ बाँझपन का परीक्षण करें। पाड़ बाँझ माना जाता है ऊष्मायन अवधि के अंत में संस्कृति के माध्यम से रंग या मैलापन करने के लिए कोई बदलाव नहीं आया है। बाँझपन की पुष्टि की गई है, एक बार ऊपरवाला, एक 6 अच्छी तरह से थाली में submucosal ओर 5 सेमी 2 अकोशिकीय पाड़ जगह है।
  4. प्रत्येक पाड़ के केन्द्र पर एक बाँझ चिकित्सा ग्रेड स्टेनलेस स्टील की अंगूठी (आंतरिक व्यास 10 मिमी, बाहरी व्यास 20 मिमी) रखें और धीरे से ऊतक के साथ एक पर्याप्त सील सुनिश्चित करने के लिए, बाँझ संदंश का उपयोग कर नीचे दबाएँ।
  5. एक सेल निलंबन का उत्पादन करने के लिए ट्रिप्सिन-EDTA के 13 का उपयोग कर fibroblasts के हार्वेस्ट। एक रुधिरकोशिकामापी 14 का उपयोग कोशिकाओं की गणना। सेल निलंबन (10 मिनट, 200 XG) अपकेंद्रित्र। एक appropria में सेल गोली Resuspendतंतुप्रसू माध्यम की ते मात्रा प्रति मिलीलीटर 2.5 x 10 6 कोशिकाओं की एक अंतिम सेल गिनती का उत्पादन करने के लिए।
  6. प्रत्येक रिंग के भीतर, 5 एक्स 10 5 मानव esophageal fibroblasts युक्त तंतुप्रसू माध्यम की 0.2 मिलीलीटर जोड़ें। तंतुप्रसू माध्यम के लगभग 2 मिलीलीटर के साथ रिंग के बाहर चारों ओर क्षेत्र बाढ़। एक 5% सीओ 2, humidified माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  7. 24 घंटे के बाद के छल्ले और fibroblast मध्यम हटाने और पाड़ पूरी तरह से मध्यम में डूब जाता है कि यह सुनिश्चित करने, प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए नए सिरे से तंतुप्रसू माध्यम की कम से कम 5 मिलीलीटर जोड़ें। एक 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 सप्ताह के लिए संस्कृति, मध्यम हर 2 से 3 दिन की जगह humidified माहौल।
  8. 1 सप्ताह के बाद ऊपरवाला mucosal सतह रखने, एक लामिना बाढ़ हुड के लिए मचान युक्त 6 अच्छी तरह प्लेटें निकालने के मध्यम हटाने और बाँझ संदंश का उपयोग कर प्रत्येक पाड़ पलटना। इस समय बिंदु 0 दिवस के रूप में जाना जाता है।
  9. के केंद्र में mucosal सतह पर स्टील के छल्ले रखेंकदम 5.4 में के रूप में ऊतक।
  10. Trypsinization के 13 के लिए उपकला कोशिकाओं का T75 बोतल तैयार करें। पीबीएस धोने और पूर्व ट्रिप्सिन-EDTA के समाधान के अलावा करने के बाद, प्रत्येक फ्लास्क बाँझ 0.02% के 2 मिलीलीटर (डब्ल्यू / वी) EDTA समाधान जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए सेते हैं। संलग्न उपकला कोशिकाओं जा रही है जबकि चुनिंदा i3T3 फीडर परत को अलग करने के लिए धीरे कुप्पी टैप करें।
    नोट: यह आम तौर पर पहले से ही पिछले सप्ताह मॉडल में शामिल किया fibroblasts के उपकला कोशिकाओं से मेल रोगी के लिए व्यावहारिक या आवश्यक नहीं है।
  11. फीडर परत युक्त EDTA समाधान डालो और उपकला कोशिकाओं 13 फसल के लिए ट्रिप्सिन-EDTA समाधान जोड़ें। एक रुधिरकोशिकामापी 14 का उपयोग कोशिकाओं की गणना। सेल निलंबन (10 मिनट, 200 XG) अपकेंद्रित्र। मिलीलीटर प्रति 5 x 10 6 कोशिकाओं की एक अंतिम सेल गिनती का उत्पादन करने के लिए समग्र माध्यम 1 के एक उचित मात्रा में सेल गोली Resuspend।
  12. युक्त, समग्र मध्यम मैं के 0.2 मिलीलीटर जोड़ें 1 एक्स 1रिंग के भीतर 0 से 6 उपकला कोशिकाओं,। कम्पोजिट मध्यम मैं लगभग 2 मिलीलीटर के साथ रिंग के बाहर चारों ओर क्षेत्र बाढ़ और एक 5% सीओ 2, humidified माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में निर्माणों जगह है।
  13. 24 घंटा (1 दिन) के बाद के छल्ले और मध्यम हटाने और ताजा कम्पोजिट मध्यम मैं कम से कम 5 मिलीलीटर जोड़ने, scaffolds के लिए पूरी तरह से जलमग्न कर रहे हैं सुनिश्चित करने और इनक्यूबेटर में लौटने। एक और आगे 24 घंटा (2 दिन) के बाद मध्यम हटाने और फिर scaffolds के लिए पूरी तरह से जलमग्न और इनक्यूबेटर करने के लिए वापस कर रहे हैं, यह सुनिश्चित करने कम्पोजिट मध्यम द्वितीय के कम से कम 5 मिलीलीटर के साथ बदल दिया।
  14. दिवस पर 4 जगह बाँझ चिकित्सा ग्रेड स्टेनलेस स्टील जाल ग्रिड ताजा 6 अच्छी तरह प्लेटों में (2 सेमी लंबे x 0.5 सेमी उच्च चौड़ा x 2 सेमी), निर्माण में एक। स्टील ग्रिड, mucosal सतह ऊपरवाला के शीर्ष पर निर्माणों को हस्तांतरण करने की बाँझ चिमटी का प्रयोग करें।
    1. तरल समग्र के नीचे पहुँचता है, लेकिन सतह इतनी है कि पर्याप्त कम्पोजिट मध्यम तृतीय जोड़ेंहवा के संपर्क में, यह नमूना एक हवा तरल इंटरफेस पर बनाए रखा है कि यह सुनिश्चित करता है। चबूतरा, अच्छी तरह से की मात्रा और स्टेनलेस स्टील ग्रिड की सटीक ऊंचाई की मोटाई के आधार पर अलग अलग होंगे आवश्यक माध्यम की सटीक मात्रा।
  15. प्रयोग की आवश्यकताओं पर निर्भर करता है, के बीच 10 और 20 दिन (दिन 24 से 14 दिन) के लिए एक हवा तरल इंटरफेस में कंपोजिट बनाए रखें। ताजा माध्यम के साथ समग्र मध्यम तृतीय बदलें हर 2 से 3 दिन (सोमवार, बुधवार, शुक्रवार को एक उपयोगकर्ता के अनुकूल शासन है)।
    नोट: एक हवा तरल इंटरफेस (दिन 9) पर 5 दिनों के बाद निर्माणों esophageal उपकला पर पर्यावरणीय कारकों के प्रभाव के प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक पर्याप्त परिपक्व esophageal उपकला है।
  16. प्रयोग के अंत में, आगे analys के लिए उपकला से histological विश्लेषण और immunohistochemical धुंधला 7, या निकालने प्रोटीन 15 या शाही सेना 11,16 के लिए निर्माणों को ठीकहै। यदि आवश्यक हो, बाह्य संकेतन अणुओं 17 के विश्लेषण के लिए वातानुकूलित संस्कृति के माध्यम बरकरार रहती है।

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Representative Results

इस पांडुलिपि को सफलतापूर्वक मानव esophageal उपकला की संस्कृति 3 डी मॉडल के लिए, चित्रा 1 में योजनाबद्ध रूप में दिखाया आवश्यक प्रक्रिया का वर्णन करता है। एक प्रयोगात्मक मंच ऊतकीय और immunohistochemical पढ़ाई सामान्य मानव esophageal स्क्वैमस म्यूकोसा के साथ सुसंस्कृत ऊतकों की तुलना किए गए हैं के रूप में मॉडल की उपयुक्तता पुष्टि करने के लिए।

वर्णित विधि द्वारा उत्पादित उपकला के histological आकलन कोशिकाओं की पतली (5 से 10 परतों यद्यपि एक परिपक्व, बहुस्तरीय, स्तरीकृत स्क्वैमस उपकला सामान्य मानव घेघा (2A चित्रा) के साथ मनाया के बराबर है जो (चित्रा 2 बी), से पता चलता है 10 कोशिकाओं चापलूसी और वे सतह की ओर विस्थापित के रूप में अंतत: anuclear उत्तरोत्तर बनने के साथ) सामान्य घेघा के लिए 20 के साथ तुलना में।

प्रसार और डि कुंजी मार्करों के immunohistochemical लक्षण वर्णनfferentiation मॉडल उपकला के microanatomy सामान्य मानव esophageal उपकला करने के लिए इसी तरह की है कि प्रदर्शित करता है। तुलनात्मक Ki67 अभिव्यक्ति बेसल के भीतर कोशिकाओं और तुरंत suprabasal परतों (आंकड़े 3 ए और 3 बी) के एक सबसेट के लिए प्रतिबंधित धुंधला के साथ, देशी घेघा और मॉडल उपकला दोनों में मनाया जाता है। यह कोशिकाओं के कम से कम 10% आम तौर पर सामान्य से esophageal उपकला 18 में, प्रसार मार्कर की अभिव्यक्ति, Ki67 दिखाने की रिपोर्ट है कि जो पढ़ाई के अनुरूप है। CK4 सामान्य रूप से स्तरीकृत और स्तंभ epithelia में व्यक्त की है लेकिन CK14 बेसल परत 19 में केवल सकारात्मक है, जबकि आम तौर पर बेसल परतों से अनुपस्थित है। CK4 दो सबसे बेसल परतों के लिए छोड़कर उपकला भर में मनाया जाता है, जबकि सामान्य और मॉडल esophageal epithelia दोनों में, CK14 बेसल परत (आंकड़े 3 डी और 3E) में सभी कोशिकाओं में मनाया जाता है (आंकड़े 3 जी और 20 की suprabasal परतों में व्यक्त की है। फिर से सामान्य मानव esophageal ऊतक और इस (आंकड़े 3J ​​और 3K) को दर्शाता है कि मॉडल उपकला शो धुंधला दोनों।

ऐसे हेट-1A के रूप में अमर esophageal उपकला कोशिकाओं के साथ प्राथमिक esophageal उपकला कोशिकाओं को बदलने के लिए प्रयास करता है, कम सफल रहे थे और सामान्य esophageal उपकला के एक वैध मॉडल का उत्पादन नहीं किया। एक बहुस्तरीय उपकला गठन किया गया था; हालांकि proliferative मार्कर Ki67 भेदभाव के किसी भी मार्करों के लिए पता चला कि कोई अभिव्यक्ति के साथ उपकला (चित्रा -3 सी) के दौरान पता चला था (आंकड़े 3F, 3I और 3L), हेट-1A कोशिकाएं सामान्य स्तरीकरण या का कोई सबूत के साथ एक hyperproliferative उपकला उत्पादन का संकेत है कि परिपक्वता।

हालांकि, मॉडल की गई हैसफलतापूर्वक esophageal ग्रंथिकर्कटता (OE33) या स्क्वैमस कार्सिनोमा (OE21) कोशिकाओं के साथ या तो प्राथमिक उपकला कोशिकाओं के प्रतिस्थापन द्वारा ट्यूमर कोशिकाओं को शामिल करने के लिए संशोधित। यह अलग सेल लाइनों की संख्या के शामिल किए जाने के माध्यम से प्रगति के विभिन्न चरणों में esophageal विकारों की एक श्रृंखला की जांच में इसके उपयोग को सक्षम करने, मॉडल के लचीलेपन को दर्शाता है। यह इन दो सेल लाइनों से प्रतिक्रियाओं में खासा अंतर है कि वहाँ देखा जा सकता है। OE21 स्क्वैमस कार्सिनोमा कोशिकाओं बेकार कोशिका आसंजन अणुओं को प्रतिबिंबित करने की संभावना उपकला (4B चित्रा) के भीतर बड़े clefts, के साथ एक परिभाषित पीला क्षेत्र (चित्रा -4 ए) के रूप में निर्माण पर दिखाई एक उपकला पैदा करता है। हवा / तरल इंटरफेस (चित्रा 4C) में 2 सप्ताह वृद्धि के बाद पाड़ की एक thinning के रूप में आंखों से दिखाई दे पाड़ गिरावट की एक बड़ी राशि है, में मॉडल परिणामों के भीतर OE33 ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं सहित और एच + ई विश्लेषण के रूप में पुष्टि कीकोशिकाओं (चित्रा 4D) नीचे के क्षेत्र में पाड़ की मोटाई में एक स्पष्ट कमी। पाड़ अध: पतन fibroblasts (आंकड़े 4E और 4F) के अभाव में नहीं मनाया जाता है, क्योंकि यह ट्यूमर कोशिकाओं और fibroblasts के बीच एक संवाद का एक परिणाम होने के लिए एक संभावना है। हम बराबर मेलेनोमा मॉडल 21 में fibroblasts की उपस्थिति और अनुपस्थिति में ट्यूमर आक्रमण पर भी इसी तरह के प्रभावों को देखा है।

चित्र 1
चित्रा 1: esophageal म्यूकोसा मॉडल का उत्पादन दिखा योजनाबद्ध आरेख मानव esophageal fibroblasts के पाड़ की submucosal सतह पर वरीयता प्राप्त और 7 दिनों के लिए संवर्धित कर रहे हैं।। चबूतरा, उलटा है मानव esophageal उपकला कोशिकाओं को जोड़ा और सुसंस्कृत 4 दिनों के लिए जलमग्न। निर्माण दा के बीच 10 और 20 के लिए एक हवाई तरल इंटरफेस के लिए उठाया हैवाई एस। प्रयोग के अंत में निर्माण की आवश्यकता के रूप में आगे के विश्लेषण से गुजरना कर सकते हैं। आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। (ए) सामान्य मानव esophageal उपकला और मानव esophageal mucosa के मॉडल में गठित (बी) esophageal उपकला के सामान्य मानव esophageal उपकला एच + ई विश्लेषण के साथ esophageal मॉडल में उत्पादित उपकला की तुलना। स्केल बार 500 माइक्रोन है। आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
सी ए), CK14 (डी, ई), CK4 (जी, एच) और (जम्मू, कश्मीर) धुंधला involucrin विशेषता Ki67 द्वारा किया गया। स्केल बार 200 माइक्रोन है। (यह आंकड़ा 7 संशोधित किया गया है।) आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: ट्यूमर सेल लाइनों के शामिल किए जाने के भीतरesophageal मॉडल। प्राथमिक उपकला कोशिकाओं स्क्वैमस कार्सिनोमा सेल लाइन, OE21, या ग्रंथिकर्कटता सेल लाइन, OE33 द्वारा बदल दिया गया था। छवियाँ (सी) के साथ संयोजन के रूप में या (ई) fibroblasts की अनुपस्थिति में, पूर्व संस्कृति अवधि के अंत में फिक्सिंग करने के लिए या तो OE21 कोशिकाओं (ए) या ​​OE33 कोशिकाओं के साथ निर्माण दिखा। OE21 (बी) या OE33 कोशिकाओं के साथ (d) (एफ) fibroblasts के बिना सहित epithelia एच + ई धुंधला द्वारा कल्पना कर रहे हैं। स्केल बार 500 माइक्रोन है। आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस पांडुलिपि esophageal उपकला पर पर्यावरण तनाव के लिए जोखिम के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक प्रयोगात्मक मंच के रूप में उपयोग के लिए उपयुक्त एक जैविक रूप से प्रासंगिक मानव esophageal श्लैष्मिक मॉडल के उत्पादन और लक्षण वर्णन करता है।

एक मानव esophageal श्लैष्मिक मॉडल के सफल उत्पादन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: उपकला कोशिकाओं के बहुमत प्रफलन रहते हैं और पहले से ही पाड़ पर उन्हें बोने के लिए पहले अलग करने के लिए शुरू नहीं किया है कि यह सुनिश्चित करना; समग्र के लिए एक हवाई तरल इंटरफेस को बनाए रखने के उपकला का सही परिपक्वता सुनिश्चित करने के लिए; विस्तारित संस्कृति अवधि के दौरान बाँझपन बनाए रखने।

कारण सेल अलगाव के लिए उपलब्ध मानव ऊतकों की सीमित मात्रा में करने के लिए इसे सीधे पाड़ पर और फलस्वरूप एक सेल विस्तार पीएच हौसले से अलग कक्षों बीज के लिए एक एकल ऊतक के नमूने से पर्याप्त कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए आम तौर पर संभव नहीं हैकोशिकाओं मानक 2 डी सेल संस्कृति की स्थिति में बड़े हो रहे हैं, जहां एएसई की आवश्यकता है। यह कोशिकाओं को इस अवधि के दौरान प्रफलन रहने को सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह संस्कृतियों पूर्ण confluency तक पहुँचने के लिए अनुमति कभी नहीं कर रहे हैं सुनिश्चित करना है कि केवल बीतने 4 तक मॉडल में कोशिकाओं का उपयोग कर और ध्यान से सेल आकृति विज्ञान की निगरानी के द्वारा हासिल की है। इस प्रकार की कोशिकाओं को उनके विशिष्ट प्रफलन बहुभुज आकृति विज्ञान और proliferative उपकला कोशिकाओं के बजाय अंतर करने के लिए शुरू कर दिया है जो संस्कृतियों में मनाया अधिक फैलाना उपस्थिति की तंग "पत्थर" फुटपाथ उपस्थिति की तरह विशेषता बनाए रखने चाहिए। दूसरा महत्वपूर्ण कदम सेल संस्कृति के माध्यम से हवा तरल इंटरफेस, लेकिन खुद को जलमग्न नहीं है निर्माण के ऊपरवाला सतह के लिए संस्कृतियों लिफ्ट करने के लिए स्टेनलेस स्टील के इस्तेमाल ग्रिड के ऊपर की सतह को शामिल किया गया है कि सुनिश्चित करने के द्वारा नियंत्रित किया जाता है। डे-cellularized जब उत्पादन तीसरा कदम बढ़ाया नसबंदी प्रोटोकॉल का कड़ाई से पालन पर निर्भर हैसुअर का चबूतरा और इस प्रक्रिया के दौरान अच्छा बाँझ तकनीक का उपयोग करें।

हमारे परिणाम प्राथमिक मानव esophageal कोशिकाओं एक सामान्य, परिपक्व, स्तरीकृत उपकला निर्माण करने के लिए आवश्यक हैं जो दिखाते हैं। एक अमर सेल लाइन का इस्तेमाल किया गया था, तो मानव esophageal उपकला से ली गई है, यद्यपि, कोशिकाओं प्रफलन बने रहे और एक परिपक्व स्तरीकृत उपकला के लिए फार्म का अंतर करने में विफल रहा है। जिसके परिणामस्वरूप उपकला मॉडल में उपयोग के लिए अमर सेल लाइन हेट-1A के unsuitability का प्रदर्शन, सामान्य उपकला के लिए एक संतोषजनक मॉडल के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। हालांकि इस तरह के esophageal ट्यूमर या बैरेट इतरविकसन से ली गई उन के रूप में अन्य सेल लाइनों मॉडल में शामिल किया जा सकता है या तो ट्यूमर प्रगति, आक्रमण और औषधीय एजेंटों के जवाब के अध्ययन के लिए मॉडलों का उत्पादन करने के लिए या प्राथमिक उपकला कोशिकाओं के अलावा जगह में।

प्रयोगों से esophageal मॉडल एस के लिए उपयोग किया जा सकतानिगलने या भाटा के दौरान, काँपने के गुणवाला घटनाओं असतत को घेघा के जोखिम imulate। यह बार बार परीक्षण किया जा यौगिक (एस) से युक्त मध्यम संस्कृति में निर्माणों जलमग्न हो और एक हवा तरल इंटरफ़ेस करने के लिए निर्माण लौटने से पहले पीबीएस में rinsing द्वारा हासिल की है। प्रदर्शन के समय और आवृत्ति संस्कृति एक हवा तरल इंटरफेस में जारी रखने की अनुमति है, जबकि उपकला परत पर्यावरणीय कारक (एस) के संपर्क में है कि यह सुनिश्चित करने, नकली जा रहा है की प्रक्रिया को प्रतिबिंबित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। इस पद्धति का मॉडल 11 दिनों में 11 के लिए एक दिन में दो बार 10 मिनट के लिए विशिष्ट गैस्ट्रो esophageal भाटा घटकों को अवगत कराया गया था, जहां सामान्य से esophageal उपकला, पर भाटा के प्रभाव की जांच करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया गया है। वैकल्पिक रूप से निर्माणों संस्कृति के माध्यम में इन यौगिकों को शामिल करके पर्यावरण तनाव के निरंतर स्तर से अवगत कराया जा सकता है। हालांकि, उपकला के बाद से epithe के लिए एक हवाई तरल इंटरफेस से अवगत कराया जाना चाहिएlium परिपक्व और ठीक से 7 अंतर करने के लिए, यह लगातार संस्कृति के माध्यम में निर्माणों डूब करना संभव नहीं है। नतीजतन, तनाव के लिए जोखिम केवल प्राप्त परिणामों की प्रासंगिकता को सीमित कर सकता है, जो इन प्रयोगों में submucosal सतह के माध्यम से किया जाएगा।

तकनीक अपेक्षाकृत श्रम गहन है और फलस्वरूप यौगिकों के अपेक्षाकृत सीमित संख्या की स्क्रीनिंग के लिए बेहतर अनुकूल है। एक प्रयोगात्मक मंच के रूप में मॉडल का उपयोग करते समय एक परिणाम के रूप में, यह पहली बार यहां 11 में वर्णित अधिक physiologically प्रासंगिक esophageal मॉडल का उपयोग कर आगे के विश्लेषण करने से पहले की स्थिति की एक सीमित संख्या में पहचान करने के लिए पारंपरिक सेल कल्चर तकनीक का उपयोग करते हुए प्रारंभिक पढ़ाई प्रदर्शन करने के लिए उपयुक्त है। Immunohistochemical विश्लेषण करने के अलावा यह भी पर्यावरण के तनाव के लिए जोखिम निम्नलिखित उपकला जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल में परिवर्तन की जांच करने के लिए संभव हो गया है। यह मैन्युअल ई दूर अलग करना द्वारा प्राप्त किया गया थाpithelium, शाही सेना निकालने और सीडीएनए के लिए इसे परिवर्तित जीन अभिव्यक्ति 11 प्रोफाइल प्राप्त करने के लिए माइक्रोएरे द्वारा जीन व्यक्त की और विश्लेषण किया जा रहा है अलग करने के लिए। इस तरह यह एक प्रायोगिक मंच के रूप में मॉडल से उपलब्ध जानकारी को बढ़ाने के लिए संभव हो गया है। गैस्ट्रो esophageal भाटा के लिए नकली प्रदर्शन के बाद उपकला जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल के प्रारंभिक दिनों में परिवर्तन का प्रस्ताव किया गया है और इन परिणामों से नए क्षेत्रों बैरेट इतरविकसन, OAC से 11 metaplastic अग्रदूत के विकास की रोकथाम में आगे की जांच के लिए सुझाव दिया गया है। मॉडल भी इस तरह के उत्तरी धब्बा विश्लेषण 16 का उपयोग पश्चिमी धब्बा विश्लेषण 15 और जीन की अभिव्यक्ति के रूप में तरीकों का उपयोग कर प्रोटीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कोशिकी संकेतन अणुओं की इसके अलावा पढ़ाई संस्कृति के माध्यम से 17 पर किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम esophageal ऊतकों के नमूनों और हमारे काम का उनके समर्थन प्राप्त करने में उनकी मदद के लिए, श्री रोजर अक्रोयद, श्री एंड्रयू वायमैन और श्री क्रिस Stoddard, शेफील्ड शिक्षण अस्पतालों एनएचएस फाउंडेशन ट्रस्ट में कंसल्टेंट सर्जन के लिए आभारी हैं। हम मॉडल में ट्यूमर सेल लाइनों को शामिल उनकी मदद के लिए अशरफुल हक धन्यवाद। हम कृतज्ञता बर्धन रिसर्च एंड एजुकेशन ट्रस्ट (ब्रेट) और यॉर्कशायर कैंसर रिसर्च (YCR) से अनुदान द्वारा इस अध्ययन के लिए वित्तीय सहायता को स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypsin BD Biosciences 215240 Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilize. Warm in 37 °C water bath before use.
DMEM Labtech LM-D1112 Warm in 37 °C water bath before use
Ham's F12 Labtech LM-H1236 Warm in 37 °C water bath before use
Foetal Calf Serum Labtech FB-1090
Epidermal Growth Factor R+D Systems 236-EG-200 Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS
Hydorcortisone Sigma-Aldrich H0396 Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use
Adenine Sigma-Aldrich A2786 Prepare stock solution in PBS and filter sterilize before use
Insulin Sigma-Aldrich I2767 Prepare 10 mg/ml solution in 0.01 M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilize before use
Transferrin Sigma-Aldrich T2036 Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use
Triiodothyronine Sigma-Aldrich T2752 Prepare stock solution in distilled water and filter sterilize before use
Cholera toxin Sigma-Aldrich C8052 Prepare stock solution in water
L-Glutamine Sigma-Aldrich G7513
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P0781
Amphotericin B Gibco 15290-026 Brand name Fungizone
PBS Oxoid BR0014 Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilize
Collagenase A Roche 10103578001
Povidone-iodine solution Ecolab 10830E Brand name Videne
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Chelex 100 Sigma-Aldrich C7901
Newborn calf serum Gibco 26010074
Progesterone Sigma-Aldrich P8783 Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use
Ethanolamine Sigma-Aldrich E9508 Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0888 Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use use
O-phosphorylethanolamine Sigma-Aldrich P0503 Prepare stock solution in DMEM and filter sterilize before use
ITS (insulin, transferrin, selenium) Lonza 17-838Z Used for composite media preparation
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T3924 Warm in 37 °C water bath before use
EDTA 0.02% solution Sigma-Aldrich E8008 Warm in 37 °C water bath before use
T75 culture flask VWR 734-2313
50 ml centrifuge tube Fisher 11819650
15 ml universal tube SLS SLS7504
180 ml pot VWR 216-2603
Petri dish SLS 150350
6 well plate VWR 734-2323
stainless steel rings Manufactured in house - medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm
steel mesh grids Manufactured in house - sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2 cm (w) x 2 cm (d) x 0.5 cm (h)
ki67 Novocastra KI67-MM1-L-CE Clone MM1. Use at 1:100.
CK4 Abcam ab9004 Clone 6B10. Use at 1:200.
CK14 Novocastra LL002-L-CE Clone LL002. Use at 1:200.
Involucrin Novocastra INV Clone SY5. Use at 1:100.
OE21 Sigma-Aldrich 96062201
OE33 Sigma-Aldrich 96070808
Het-1A ATCC-LGC CRL-2692
Mouse 3T3 fibroblasts ATCC-LGC CRL-1658 previously growth arrested by irradiation (60 Gy)

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References

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एक 3 डी ऊतक इंजीनियर मानव इसोफेजियल mucosal मॉडल का उत्पादन, लक्षण और क्षमता का उपयोग करता
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