Abstract
调节胸腺选择的有效性的机制仍然不明确。这里介绍的方法允许在体内特异于自我和外来抗原的T细胞的发展和选择的分析。该方法需要来自各种老年小鼠免疫缺陷SCID收件人胸腺移植物的植入。在一段相对较短的时间的收件人完全重构与来自植入胸腺移植物衍生的T细胞。只有播种的胸腺细胞在胸腺在隔离的时间进行选择，并发展成为成熟的T细胞。这样，改变在移植的T细胞的年龄依赖性胸腺事件的函数的性质和特异性可以进行评估。虽然技术专长需要成功胸腺移植，这种方法提供了以研究在体内的广泛的病理是由于异常胸腺功能和/或homeostas或结果的一个独特的战略是。
Introduction
胸腺是在T细胞发育的关键事件发生1器官。驻地胸腺细胞，在T细胞受体（TCR）α和β基因的重排，进行一系列与在胸腺2的皮质和髓质区lymphostromal和抗原呈递细胞（APC）的相互作用。胸腺阳性选择由皮质胸腺上皮细胞（TEC）介导，以产生胸腺细胞识别的抗原肽在宿主主要组织相容性复合体（MHC）I类和II类分子2-3的上下文中。随后胸腺阴性选择嗣继承吹扫自身反应的胸腺细胞，通过与髓TEC或树突细胞（DC）从自身蛋白质结合的MHC I类和II类分子3推导出本发明的肽的相互作用来驱动。这些处理的最终结果是建立成熟的CD4 +和CD8 + T细胞能够对广谱响应一池外来抗原的同时表现出最小的反应性的自身蛋白质4。
胸腺选择事件的效率是由许多因素，包括胸腺成熟，髓和皮质TEC，胸腺DC亚群组成的频率，和胸腺前体3的源的影响。值得注意的是，异常胸腺选择可导致自身免疫性5或免疫缺陷的病状，从受损的阴性或阳性选择，它们分别出现。的分子事件调节胸腺选择，然而，却知之甚少。 体外方法，如reaggregate胸腺器官培养（RTOC）6，已被证明是用于分析与胸腺选择相关联的基本事件是有用的，但不能完全概括的正在进行的动态在体内的活动。这样一来，这个胸腺移植为基础的方式成立，以便更好地研究胸腺细胞评选活动在体内 7
本协议描述移栽从新生和成年供体小鼠thymi到免疫缺陷SCID受体小鼠。这种技术允许调节阳性和阴性胸腺选择，以及各种T细胞亚群的个体发育过程中胸腺输出机制的研究。最近，这种方法已被用于证明胸腺选择的效率出生的小鼠，导致自身反应性T细胞的增加发展后早期的限制，并降低T细胞剧目特异于外来抗原7。
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Protocol
鼠研究批准了北卡罗来纳教堂山大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）和所有的动物护理是按照IACUC的指导方针。
1.准备新生儿和成人Thymi的
- 准备所有安乐死供体小鼠之前，试剂和设备。
- 消毒手术器械通过高压灭菌或其他合适的方法。所有的外科手术必须在层流罩保持无菌条件和避免污染进行。组装需要从供体小鼠提取thymi的工具。
- 填充60mm培养皿用无菌的1×PBS（pH7.4）中，并放置在冰上的罩内。这将被用于简单地存储thymi从供体小鼠移植前切除。
- 按道德准则，通过CO新生儿安乐死供体小鼠斩首和成年供体小鼠2窒息颈椎脱位。
- 当r胸腺emoval：莱鼠标在背卧位在无菌吸水纸巾喷洒之前做一个切口70％的乙醇。
- 通过皮肤制备中线切口暴露腹腔和胸腔。折叠的皮肤在胸部和前肢以显示胸腔。
- 使通过隔膜和肋骨两侧切口，显露上纵隔和前胸腔。胸腺应该是可见的两个白色的凸起立即上方和相邻的心脏。
- 除了捉弄周围用细镊子胸腺结缔组织，使某些不破坏胶囊。而憋尿用钳子胸腔，使用第二对镊子通过定位弯钳器官下方，垂直提拉提取胸腺的两叶。这可以使用解剖范围为从新生小鼠提取thymi来完成。
- 放置在胸腺60毫米双含有SH在冰上并分离胸腺裂片无菌的1×PBS（pH7.4）中，通过所述连通峡部切割。从胸腺裂片使某些不损坏胶囊除去任何碎片，并切断胸腺成用于移植部分的适当数量。
- 不要操纵新生小鼠获得的thymi。
注：用于最多两个受体小鼠（每个收件人1叶）中。 - 移植从成年小鼠中得到的thymi分为最多4-6受体小鼠。使用一对镊子，小心地抓住一名成人胸腺叶， 如图1，切到胸腺用手术剪刀三个相等的部分。
- 重复步骤1.3-1.4为每个供体小鼠。为了限制thymi暴露的时间，准备1施主胸腺的时间。
2.植入胸腺肾囊下
- 装配在表1中列出的预先消毒设备，适当的无菌技术应的过程，以防止暴露移植受者对污染的工具或试剂的过程中被利用。
- 移植前，权衡和标记每个收件人鼠标。
- 设置解剖显微镜和麻醉电路在层流罩。
- 使用电动剃须刀，剃接受者小鼠的左侧，并确保没有头发仍然围绕用于使切口的区域。
- 打开异氟烷蒸发器和麻醉使用的1-2％之间的剂量鼠标。通过检查以下脚趾捏缺乏反射开始手术前确定适当的麻醉。
- 之后，鼠标正常麻醉，适用兽医药膏鼠标以防止干燥和准备鼠标移植如下的眼睛：
- 定位在解剖显微镜下鼠标在右侧卧位，使剃侧朝上。 Starti纳克在手术区的中心，使用一次性移液管的70％乙醇，随后碘伏（优碘）分配在一个圆周运动。重复乙醇/优碘治疗3次之前做一个切口。
- 使用解剖剪刀做一个1-2厘米的切口侧翼肾脏正上方。
- 使用镊子中等掌握邻近肾脏结缔组织和轻轻抬起肾使得其位于上盖的肌肉。为了保持肾脏暴露和地方在肌肉组织，插入介质镊子一只手臂肾下，要特别注意不要破坏肾髂骨。
- 为了防止组织脱水，在每个步骤中，直至肾和肾囊操纵完成灌溉用无菌的1×PBS（pH7.4）中的肾。
- 用细镊子夹住并提起肾脏最远端的肾上腺它从肾脏分离的边缘附近的胶囊。
- 使用18号针，使一个切口足够大以插入准备好的片的供体胸腺（ 图2A）。使一定保持囊切口尽可能小，以防止移植物的错位随着时间的推移。
- 而从肾脏保持胶囊拉远，使用第二对细镊子的插入胶囊下方的移植物和胸腺从囊切口尽可能（ 图2B）推远向前。
- 从肾脏下方取出钳，并通过切口轻轻返回肾脏回原位。
- 缝合腹膜壁和应用一旦关闭优碘关闭肌肉。缝合完成后，应用伤口夹关闭真皮并应用优碘到周边地区。
- 返回鼠标已使用热灯加热笼子。
- 监测每个术后鼠标，直到它恢复全部的意识和行动，也不要将鼠塔吨有没有恢复麻醉下与其他动物的笼子。
- 根据需要治疗的小鼠手术后的疼痛管理药物。提供小鼠手术后止痛药如对乙酰氨基酚在饮用水以1.6毫克/毫升的浓度。
- 重复步骤2.3-2.9为每个收件人鼠标。
- 确保小鼠恢复正常活动中1小时后的手术。监视手术后的重量，运动技能，以及各小鼠的饮用和摄食活动，以确定所产生的移植过程的结果的并发症。
注：手术后体重减轻，相比手术前的重量，以及改变流动性或没有吃或喝可以指示并发症。 - 监视外周血T细胞重建的出血的小鼠经尾缺口随后根据制造商的说明书使用Lympholyte细胞分离介质的淋巴细胞的分离。实现T细胞characteriza灰通过染色的淋巴细胞与特异于T细胞标记CD3，CD4，和CD8，以及一个活死鉴别荧光标记的抗体，例如荧光激活琥珀酰亚胺基酯8。 如图3分析可以通过选通上单峰，活细胞，和CD3阳性细胞来完成。
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Representative Results
这个过程的成功依赖于最小的手术创伤，以及肾囊下的移植物的准确定位。胸腺移植物应该被切割，以确保适当大小胸腺部分用于随后的移植， 如图1。按照图1中的示意图，从新生或成年小鼠thymi可用于成功包膜下移植具有一致和可重复的T细胞植入的结果。如所提到的，肾囊下的移植物的适当的定位是在保持长期存活的移植物，功能，和血管重要。正如在图2中，胸腺移植物应放置上盖的肾，最接近肾上腺（前肾的），从囊切口的相对端（肾的后部）。一个成功的移植胸腺，再加上适当的造血环境时，可以řemain生产超过30 周 3。
移植后，植入由流式细胞评估从外周血获得的T细胞的分析， 图3和表2展示了在器官和外周血中观察到移植接受者后6周移植T细胞植入的典型水平。使用这种技术，我们小组先前已示出的外周血CD4 +和CD8 + T细胞重建的动力学随时间在新生儿和成人thymi的移植接受者。简要地说，循环T细胞可在周可以观察到后一周手术内和CD4 +和CD8 + T细胞的数量持续增加，直到外周T细胞隔室被完全复原在5-6周后移植7。
图2：的囊切口和胸腺移植物的放置位置从供体胸腺制备的适当尺寸部分被插入由一个小切口，在肾囊肾（A）的后端产生的包膜下空间。前到肾脏，最接近肾上腺（未示），并在从囊切口的另一端，是被插入的胶囊的下方，如图（B）中的接枝的最佳位置。
图3.通过在外周血和淋巴器官的T细胞重建确定成功植入。流式细胞术数据是在一个NB的胸腺移植物的SCID收件人代表了T细胞重建观察后6周的移植。对T细胞植入水平相似外周血，脾，胰淋巴结（PLN）观察，和肠系膜淋巴结（MLN）以下胸腺移植物的移植成功。
| 精细解剖钳 |
| 中等解剖钳（2） |
| 精细解剖钳（弯尖） |
| 聚维酮碘溶液 |
| 70％乙醇 |
| 18号针头 |
| 解剖显微镜W /光源 |
| 迪sposable移液管（2） |
| 药物控制疼痛：对乙酰氨基酚 |
| 无菌湿巾 |
| 热灯 |
| 电动剃须刀 |
| 异氟醚和异氟醚蒸发 |
| 缝合线（快速吸收，肠道平原） |
| 解剖剪 |
| 9毫米不锈钢伤口夹 |
| 伤口夹清除工具 |
| 无菌1X PBS |
| 60mm培养皿 |
表1：外科胸腺移植过程中所需要的材料清单的用于植入的受体小鼠的肾囊下的胸腺必要的材料。指定材料的量被列在括号。
| 托塔CD4 + T细胞的升数 | CD8 T细胞的总数 | |
| 血 | 1,652细胞/υl | 351个细胞/υl |
| 脾 | 11546617 | 4203299 |
| PLN | 1241789 | 364918 |
| MLN | 2182266 | 532059 |
存在于外周血和淋巴胸腺移植受体器官的T细胞表2总数量。CD4 +和CD8 + T细胞从器官中回收的总数量，以及一个新生胸腺移植受体外周血6周后移植。这些数字代表的CD4 +和CD8 + T细胞细胞构成，它一般在成功新生儿和成人胸腺移植观察。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2705HC | |
| PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.4 |
| Betadine Solution | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |
| Sutures (1.0 metric) | Ethicon | J493G | 18" (45cm) |
| AUTOCLIP Wound Clips (9mm) | Clay Adams® Brand | 427631 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | Sterile, disposable |
| Mouse anti-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | Clone: 1452C11 |
| Mouse anti-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | Clone: RM4-5 |
| Mouse anti-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | Clone: 53-6.7 |
| Lancet | Medipoint | Goldenrod 4mm | |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | Invitrogen | P30253 | |
| 96-well round botton polypropylene plates | Corning | 3365 | |
| 1.2 ml polypropylene cluster tubes | Corning | 4401 | |
| 5 ml polypropylene round-bottom tubes | BD | 352002 | |
| 40uM Nylon Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Hazardous |
| Puralube Optical Ointment | Fisher Scientific | NC0138063 | |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5030 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430196 | 60 mm x 15 mm, Sterile |
References
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