不同年龄小鼠胸腺移植物的分离与移植

摘要

本报告详细描述了将不同年龄供体小鼠的胸腺移植到免疫缺陷型受体小鼠肾包膜下的操作方法。该技术旨在模拟T细胞发育及胸腺选择过程。 在体.

摘要

调控胸腺选择效率的机制仍不明确。本文所述方法可实现 体内 针对自身和外来抗原特异性T细胞发育与选择的分析。该方法包括将来自不同年龄小鼠的胸腺移植物植入免疫缺陷小鼠体内 scid 受者。在相对较短的时间内，受者体内会完全重建来源于移植胸腺移植物的T细胞。只有在分离时已定植于胸腺的胸腺细胞才会经历选择并发育为成熟的T细胞。因此，可借此评估移植物中T细胞的特性与特异性随年龄相关胸腺事件变化的情况。尽管胸腺移植需要较高的技术操作水平，但该方法为研究提供了独特的策略 体内 多种由于或源于胸腺功能异常和/或稳态失衡的病理状态。

引言

胸腺是T细胞发育过程中关键事件发生的器官¹。定居的胸腺细胞在T细胞受体（TCR）α和β基因重排后，会与胸腺皮质和髓质区域中的淋巴基质细胞及抗原呈递细胞（APC）发生一系列相互作用²。胸腺阳性选择由皮质胸腺上皮细胞（TEC）介导，产生能够识别在宿主主要组织相容性复合物（MHC）I类和II类分子背景下呈递的抗原肽的胸腺细胞^2-3。随后的胸腺阴性选择则通过与髓质TEC或树突状细胞（DC）相互作用，清除自身反应性胸腺细胞，这些细胞呈递由MHC I类和II类分子结合的自身蛋白来源的肽段³。这些过程的最终结果是形成一群成熟的CD4⁺和CD8⁺ T细胞，能够对广泛的外来抗原产生应答，同时对自身蛋白的反应性极低⁴。

胸腺选择事件的效率受到多种因素的影响，包括胸腺成熟度、髓质和皮质胸腺上皮细胞（TEC）的频率、胸腺树突状细胞（DC）的亚群组成以及胸腺前体细胞的来源³。值得注意的是，异常的胸腺选择可导致自身免疫性疾病⁵或免疫缺陷性疾病，分别源于阴性选择或阳性选择的受损。然而，调控胸腺选择的分子机制目前仍不清楚。体外方法如重组胸腺类器官培养（RTOC）⁶已被证明可用于分析与胸腺选择相关的基本事件，但无法完全重现持续进行的体内事件的动态过程。因此，建立了基于胸腺移植的方法，以更有效地在体内研究胸腺细胞的选择过程⁷。

本方案描述了将新生期和成年供体小鼠的胸腺移植到免疫缺陷型scid受体小鼠中的方法。该技术可用于研究调控胸腺阳性与阴性选择的机制，以及在个体发育过程中不同T细胞亚群的胸腺输出情况。最近，该方法已被用于证明小鼠出生后早期胸腺选择效率受限，导致自身反应性T细胞的生成增加，以及针对外来抗原的T细胞受体库多样性降低⁷。

方案

小鼠实验已获得北卡罗来纳大学教堂山分校机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准，所有动物护理均遵循IACUC指南。

1. 新生儿与成年胸腺的制备

1. 在处死供体小鼠之前，准备好所有试剂和设备。
2. 通过高压灭菌或其他适当方法对手术器械进行灭菌。所有手术操作必须在层流罩内进行，以维持无菌条件并避免污染。准备从供体小鼠中取出胸腺所需的工具。
3. 在层流罩内，将一个60 mm培养皿装满无菌1×PBS（pH 7.4），并置于冰上。该培养皿用于在移植前短暂存放从供体小鼠中切除的胸腺。
4. 根据伦理指南，通过断头法处死新生供体小鼠，通过CO₂窒息法处死成年供体小鼠，随后进行颈椎脱位。
5. 切除胸腺时：将小鼠仰卧置于无菌吸水纸巾上，并在切口前喷洒70%乙醇。
6. 沿中线切开皮肤，暴露腹腔和胸腔。将皮肤向胸部和前肢方向翻折，以暴露胸腔。
7. 在膈肌和肋骨上做两个侧向切口，暴露上纵隔和前胸腔。胸腺应可见为位于心脏上方及邻近区域的两个白色叶状结构。
8. 用精细镊子轻轻分离胸腺周围的结缔组织，注意不要破坏包膜。用镊子将肋骨撑开的同时，使用另一把镊子将弯头镊置于器官下方，垂直向上提起，从而取出两个胸腺叶。此操作可借助解剖显微镜完成，尤其适用于从新生小鼠中取出胸腺。
9. 将取出的胸腺放入盛有无菌1×PBS（pH 7.4）的60 mm培养皿中，并置于冰上。通过切断连接两叶的结缔组织峡部，将胸腺叶分开。清除胸腺叶上的任何碎屑，注意不要损伤包膜，并将胸腺切成适合移植的若干片段。
10. 不要对从新生小鼠获得的胸腺进行进一步分割。
    注：最多用于两只受体小鼠（每只受体使用一个叶）。
11. 将从成年小鼠获得的胸腺移植给最多4至6只受体小鼠。用镊子小心夹住一个成年胸腺叶（如图1所示），使用手术剪将其均分为三个相等的部分。
12. 对每只供体小鼠重复步骤1.3–1.4。为尽量减少胸腺暴露时间，每次仅处理一只供体小鼠的胸腺。

2. 肾包膜下胸腺移植

1. 组装表1中列出的预灭菌设备。在整个操作过程中应采用正确的无菌技术，以防止将移植受体暴露于受污染的器械或试剂中。
2. 移植前，称重并标记每只受体小鼠。
3. 在超净工作台内设置解剖显微镜和麻醉装置。
4. 使用电动剃刀剃除受体小鼠左侧的毛发，并确保切口区域周围无残留毛发。
5. 打开异氟烷蒸发器，使用1-2%的剂量对小鼠进行麻醉。在开始手术前，通过夹捏脚趾检查是否无反射，以确认麻醉效果充分。
6. 小鼠充分麻醉后，在其眼睛上涂抹兽用眼膏以防止干燥，并按以下步骤准备小鼠进行移植：
7. 将小鼠置于解剖显微镜下，呈右侧卧位，使剃毛侧朝上。从手术区域中心开始，使用一次性移液管以环形方式滴加70%乙醇，随后使用聚维酮碘（碘伏）。在切开前，重复乙醇/碘伏处理3次。
8. 使用解剖剪在肾脏正上方做一道1-2 cm的侧腹切口。
9. 用中号镊子夹住肾脏附近的结缔组织，轻轻提起肾脏，使其位于肌肉组织上方。为保持肾脏暴露并固定在肌肉组织上，将中号镊子的一臂插入肾脏下方，特别注意不要破坏肾蒂。
10. 为防止组织干燥，在操作肾脏及肾包膜的每一步骤中均需用无菌1×PBS（pH 7.4）冲洗肾脏，直至操作完成。
11. 使用精细镊子夹住靠近肾上腺远端的肾包膜边缘，轻轻提起并分离包膜与肾脏。
12. 使用18号针头切开一个足够大的切口，以便插入准备好的供体胸腺组织（图2A）。务必使包膜切口尽可能小，以防止移植物随时间发生移位。
13. 在保持包膜与肾脏分离的同时，使用第二把精细镊子将移植物插入包膜下方，并将胸腺尽可能向前推离包膜切口（图2B）。
14. 将镊子从肾脏下方取出，轻柔地将肾脏通过切口复位。
15. 缝合腹膜壁以关闭肌肉层，缝合后涂抹碘伏。缝合完成后，使用伤口夹关闭皮肤，并在周围区域涂抹碘伏。
16. 将小鼠放回已用加热灯预热的笼子中。
17. 监测每只术后小鼠，直至其完全恢复意识和活动能力；未从麻醉中恢复的小鼠不得与其他动物同笼饲养。
18. 根据需要给予小鼠术后镇痛药物。可通过饮水提供术后镇痛剂，如对乙酰氨基酚，浓度为1.6 mg/ml。
19. 对每只受体小鼠重复步骤2.3-2.9。
20. 确保小鼠在术后1小时内恢复正常活动。监测每只小鼠的术后体重、运动能力以及饮水和进食情况，以判断是否出现并发症。
    注：与术前体重相比，术后体重下降，以及活动能力改变或拒食拒水，可能提示出现并发症。
21. 通过尾尖采血并使用Lympholyte细胞分离液按制造商说明分离淋巴细胞，监测外周血中T细胞重建情况。使用 荧光标记的特异性抗体对淋巴细胞进行染色，靶向 T细胞标志物CD3、CD4和CD8，同时使用活/死细胞鉴别染料（如荧光活化琥珀酰亚胺酯）⁸。如图3所示，可通过圈选单细胞、活细胞及CD3阳性细胞进行分析。

结果

该手术的成功取决于尽量减少手术创伤以及将移植物准确地置于肾包膜下。应切割胸腺移植物，以确保获得适合后续移植的适当大小的胸腺组织片段，如图1所示。根据图1的示意图，可使用新生或成年小鼠的胸腺进行成功的包膜下移植，并获得稳定且可重复的T细胞植入效果。如前所述，将移植物恰当地定位在肾包膜下对于维持移植物的长期存活、功能及血管化至关重要。如图2所示，胸腺移植物应放置在肾脏表面，靠近肾上腺（肾脏前部），并与包膜切口位置相对（肾脏后部）。在合适的造血环境下，成功的胸腺移植可维持超过30周的持续功能⁷。

移植后，通过流式细胞术分析外周血中获得的T细胞来评估植入情况。图3和表2展示了移植受体在移植后6周时，各器官及外周血中典型的T细胞植入水平。利用该技术，我们课题组此前已报道过新生和成年胸腺移植受体中外周血CD4⁺和CD8⁺ T细胞重建的动力学过程。简言之，术后一周...

讨论

调控胸腺选择的事件目前尚不明确。近期研究表明，胸腺选择效率在个体发育过程中会发生变化。将这一方法与不同的转基因供体和受体小鼠胸腺相结合，将有助于进一步研究并鉴定调控胸腺选择的相关事件和参数。值得注意的是，胸腺移植已被用于治疗和管理T细胞及胸腺相关疾病，例如缺乏功能性T细胞的无胸腺婴儿以及患有DiGeorge综合征的患者，后者表现为胸腺发育不全或胸腺缺如^9-10。与其他大多数器官移植一样，胸腺移植也存在并发症，主要与移植物耐受相关的并发症¹²以及自身免疫性病理的发生有关¹¹。这些问题，加上对胸腺细胞耐受诱导机制进行更深入理解与表征的需求，促使了本方法的建立。本文所述方案可实验性地模拟胸腺移植过程，并证明受体小鼠能够实现有效的T细胞重建。

在该实验方案中有几个关键点需要注意。在进行移植手术之前，操作者必须熟练掌握外科手术技术和无菌操作技术。严格遵守这些要求有助于最大限度地减少创伤、小鼠麻醉时间以及恢复时间，从而能够轻松实现术后100%的存活率。在准备供体胸腺时，必须将器官置于湿冰上，以尽量减少细胞死亡。此外，胸腺叶需被切...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙醇	Decon Laboratories	2705HC
PBS	GIBCO	14190-144	pH 7.4
贝塔碘溶液	Purdue Products	67618-150-17
18号针头	BD	305195
缝合线（1.0 公制）	Ethicon	J493G	18" (45cm)
AUTOCLIP 伤口夹（9 mm）	Clay Adams® 品牌	427631
移液管	Fisher Scientific	13-711-20	无菌，一次性使用
小鼠抗 CD3 抗体	eBioscience	11-0031-85	克隆株：1452C11
小鼠抗 CD4 抗体	eBioscience	48-0042-82	克隆株：RM4-5
小鼠抗 CD8 抗体	eBioscience	25-0081-82	克隆株：53-6.7
采血针	Medipoint	Goldenrod 4mm
太平洋橙琥珀酰亚胺酯，三乙基铵盐	Invitrogen	P30253
96孔圆底聚丙烯板	Corning	3365
1.2 ml 聚丙烯簇管	Corning	4401
5 ml 聚丙烯圆底管	BD	352002
40 µm 尼龙细胞筛	Falcon	352340
16% 电镜级甲醛溶液	Electron Microscopy Services	15710	危险品
Puralube 眼科软膏	Fisher Scientific	NC0138063
淋巴细胞分离液	Cedarlane	CL5030
60 mm 细胞培养皿	Corning	430196	60 mm × 15 mm，无菌