Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Иммуноокрашивание визуализировать нервную развития системы мышиный Кишечная

doi: 10.3791/52716 Published: April 29, 2015

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Кишечная функционирует нервная система (ENS), которая контролирует моторику, всасывание питательных веществ, и местный кровоток, имеет важное значение для жизни 1. ЭНС формируется клеток нервного гребня (НКЦ), которые пролиферируют, мигрируют и колонизировать кишечник, где они дифференцироваться в ганглиев содержащих нейронов и глиальных клеток. Болезнь Гиршпрунга (HSCR, Интернет Законы Менделя в человеке), multigeneic врожденный порок с частотой 1 в 4000 живорожденных, можно считать прототипом для изучения болезни нарушенного образование ENS. В HSCR, НКК не мигрируют и колонизировать переменной длины дистального кишки 2. Кроме того, другие общие желудочно (GI) пороки развития в педиатрической популяции, такие как аноректальной пороками развития, кишечных atresias и нарушений моторики связаны с нарушениями в основных функций ENS, и, вероятно, связано с тонкими, недооцененных, анатомических изменений и функциональных изменений вENS 3-6. Таким образом, методы, которые позволяют нам понять детерминанты развития образования ENS может пролить свет на патогенез и потенциального лечения расстройств желудочно-кишечного тракта у детей.

После миграции и колонизации, НКК дифференцируется в нейроны с маркеров, специфических для их фенотипа нейромедиатора. Холинергических нейронов содержат приблизительно 60% кишечных нейронов 7, и могут быть обнаружены путем окрашивания по холинацетилтрансферазы (ХАТ), синтезирующего фермента на возбуждающий нейротрансмиттер ацетилхолин. Исторически, попытки визуализировать холинергические нейроны смешивать с различной антигенной специфичности антител, направленных против центральной нервной системы (ЦНС) ХАТ в сравнении периферической нервной системы (ПНС) ХАТ 8-10. Тем не менее, антитела, направленные против плаценты ChAT признать как центральную и периферическую Чат 11-13, и мы в последнее время описанные методы, которые позволяют visuaлизация из ENS холинергических нейронов с высокой чувствительностью ранее в развитии чем была достигнута с чатом репортер линий 14.

Здесь мы представляем технику для рассечения, фиксация и иммунное мышиного эмбрионального желудочно-кишечного тракта для визуализации выражение нейромедиатора ENS в нейронах. Для этих исследований, мы использовали мышей Чат CRE повязана с R26R: floxSTOP: tdTomato животных для производства Чат Cre; R26R: floxSTOP: tdTomato мышей (определенные как чат-Cre tdTomato всей рукописи). Эти животные были затем скрещивали с гомозиготных Чат-GFP репортер мышей, чтобы получить мышей, экспрессирующих обе флуоресцентные журналистам, что обнаружить ChAT выражение 14. Эти два репортер животные на линии C57BL / 6J фоне и коммерчески доступны (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Университет Висконсина уходу и использованию животных комитета утвердил все процедуры.

1. Подготовка решений

  1. Использование 1x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) в качестве буфера рассечение и промывки раствором.
  2. Подготовка 30% сахарозы путем взвешивания 30 г сахарозы и место в бутылку. Добавить 99 мл 1x PBS и добавить 1 мл 10% азид натрия. Тщательно перемешать, пока все сахарозы не растворится. Хранить при 4 ° С до использования.
  3. Подготовьте Блокирующий раствор путем смешивания 1X PBS, 3% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,1% Тритон-X-100. Тщательно перемешать и хранить в холодильнике, пока не понадобится.
  4. Подготовка 8% параформальдегида (PFA) раствор в 1x PBS путем взвешивания соответствующего количества PFA в 1x PBS, а затем инкубировали при 65 ° С до тех пор, пока полностью не растворится. Магазин в 25 мл аликвотах в -20 ° C морозильнике до использования. Развести до 4% PFA в 1x PBS на день использования.

2. Эмбрион и Гут Рассекитеион

  1. В соответствии с институциональной уходу и использованию животных комитета утвержден протоколы, усыпить приуроченный беременную мышь и перенести в матку в 60 мм чашки Петри, содержащей ледяной 1x PBS.
  2. Под микроскопом рассечение, используя острые ножницы, разрезать стенки матки открытый, чтобы выставить эмбрионов. Удалить эмбрионов из матки и место в чистой 60 мм чашки Петри, содержащей ледяной холод 1x PBS.
  3. Эвтаназии каждый эмбрион, обезглавливание в ледяной 1x PBS. Если вы используете трансгенных мышей, содержащих флуоресцентные белки, под флуоресцентной подсветкой, определить положительные трансгенные эмбрионы.
  4. Рассеките желудочно-кишечного тракта от каждого эмбриона с использованием рассечение микроскоп. Использование тонких щипцов, ориентироваться эмбрион таким образом, что левая сторона стороной вверх и правой стороне на дно чашки Петри. Снимите верхнюю стенку тела из эмбрионов, чтобы выставить внутренние органы. Вставьте тонкий пинцет между спинной стенке тела и внутренних органов. Crуги щипцы друг против друга в ножницеобразный, как режущего действия, чтобы удалить внутренние органы от эмбриона.
  5. Кроме того суб-рассекать желудочно-кишечного тракта от окружающих органов, а затем поместить каждый желудочно-кишечного тракта в 1,5 мл микроцентрифужных пробирку, содержащую ледяной 1X PBS.

3. Фиксация GI урочища

  1. Промыть каждый желудочно-кишечного тракта 3 раза охлажденным на льду PBS 1x, а затем заменить 4% PFA. Закрепите GI участки в 1,5 мл микропробирок на качающейся платформе при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Промыть желудочно-трактов 3 раза в течение 5 мин при комнатной температуре, а затем в течение 1 часа на качалке платформы. На этой стадии, сохранять GI тракт при 4 ° С в 30% сахарозы в 1x PBS, содержащим 0,1% азида натрия до тех пор, пока это необходимо.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, хранения эмбрионов в 30% сахарозы в течение до одного года без какого-либо влияния на целостность тканей. Хранение образцов в 30% сахарозы позволяет последующую обработку образцов либо для иммунным или в октябре для крио-sectioniнг. Кроме того, приступить к протоколу иммуноокрашивания подробно ниже.

4. Протокол Иммуноокрашивание

  1. Если образцы были сохранены в 30% сахарозы, промыть их 3 раза в течение 20 мин в PBS 1x на платформе-качалке.
  2. Поместите GI участки в блокировании решения на качающейся платформе в течение 1 часа при комнатной температуре.
  3. Удалить блокирующий раствор и инкубировать GI тракт с соответствующим количеством первичных антител разводят в блокирующем растворе для любой 4 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С на ротационном платформы. Использование 1: 1000 разбавление человеческого анти-антитела (Hu сыворотки, полученной от пациента), 1: 1000 разбавление куриного анти-зеленого флуоресцентного белка (GFP) антитела и 1: 100 разбавление козьего анти-ХАТ антитела.
    Примечание: Мы используем человеческого анти-Hu антитело, которое было получено локально от пациента, однако, анти-Hu антитела коммерчески доступны, например, мышиное анти-Hu, (использование при 1: 500 разбавлении).
  4. Промыть GI участки в 1x PBS3 раза в течение 5 мин и затем в течение 1 часа при комнатной температуре на ротационном платформы.
  5. Заменить 1X PBS с помощью вторичных антител, разведенных 1: 500 в блокирующем растворе на платформе-качалке для любой 4 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С. Использование осла против человеческого амина-реактивный краситель, такой как DyLight, осла против ветряной су2 и осла против козьего Cy5. При использовании мышиное анти-Ху антитела затем используют в разведении 1: 500 осла против мышиного амина-реактивный краситель 405.
    ПРИМЕЧАНИЕ: интенсивность эндогенного GFP и выражения tdTomato и ясности иммуноокрашивания увеличение с возрастом развития. Как правило, мы immunostain эмбриональных кишки индивидуально в 0,2 мл пробирки с 150 мкл окрашивающего раствора, чтобы уменьшить объем используемого антитела, а также обеспечить эффективное окрашивание ткани.
  6. Промыть GI тракт в 1X PBS 3 раза в течение 5 мин и затем в течение 1 часа при комнатной температуре на ротационном платформы.
  7. Поместите несколько капель флуоресценции монтажа среде с DAPI на предметное стекло. Погрузите GI траКТ в монтажной флуоресценции среды и добавить покровное стекло непосредственно на ткани. Флуоресценции монтажа средней -G является водорастворимым соединением, которое обеспечивает полупостоянного уплотнение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте флуоресценции монтажа носитель, например Vectashield что глицерин основе монтажа среду, предотвращающую выцветания и фотообесцвечивание антител. Оба из этих продуктов позволит ткани должны храниться в течение длительных периодов времени при 4 ° С.
  8. Захват изображения каждого из флуорофора с помощью конфокальной микроскопии. Используйте для длин волн возбуждения флуорофоров и фильтров, используемых, представленных в таблице 3.
  9. Выполнить анализ изображения с помощью компьютера, используя соответствующее программное обеспечение в зависимости от типа используемого конфокальной захвата изображений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ранее мы уже описали поколение мышей, экспрессирующих GFP оба и tdTomato флуоресцентные журналистам, что обнаружить ChAT выражение 14. Вкратце, мышей Чат-Cre были скрещены с R26R: floxSTOP: tdTomato животных для производства Чат Cre; R26R: floxSTOP: tdTomato мышей (так называемые чат-Cre tdTomato). Эти животные были затем скрещивали с гомозиготных Чат-GFP репортер мышей. Эмбрионы были выделены и ткани иссекали до того, как фиксированные и иммунологически, как указано выше, с антителами, перечисленных в таблице 1. Дистальном отделе тонкой кишки (SI) и проксимальном отделе толстой кишки были проанализированы в E11, E13.5 и E16.5

В E11, Ху-позитивных нейронов присутствуют в дистальной СИ, но НКК еще не достиг проксимального кишки (рис 1). В этот момент времени, большинство из Ху-позитивных нейронов продемонстрировать иммунореактивности АХТ а также GFP положительность. Интересно, что в этот момент времени, выражениеession в tdTomato конструкции Чат Cre не обнаруживается. По E13.5, большинство Ху-положительных нейронов и ХАТ-ИК и общение-GFP положительные, так и небольшое количество ХАТ-Cre tdTomato-положительных нейронов видел. Количество Chat-Cre tdTomato-позитивных нейронов увеличивается E16.5, но по-прежнему небольшая часть числа Чат ИК нейронов.

Фигура 1
Рисунок 1. Типичные Изображения холинергических нейронов в дистальных тонкой и толстой кишки в эмбриональный день 11. На E11, в дистальной С.И. (с надписью "СИ") и проксимальном отделе толстой кишки (помечены "Ко"), Ху-позитивных нейронов (синий) присутствуют только в SI на данном этапе. Большинство Ху-положительные нейроны совместно с иммунологически Чат ИК (белый) и чат-GFP (зеленый). Тем не менее, в этот момент времени, ни один из этих нейронов не Chat-Cre tdTomato положительный (красный). Шкалабар = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Фиг.2
Рисунок 2. Типичные изображения холинергических нейронов в дистальном отделе тонкой кишки и толстой кишки в эмбриональных дней 13,5 и 16,5. Изображение показывает холинергических нейронов в дистальном отделе тонкой кишки на E13.5 (верхние панели) и E16.5 (нижние панели). В E13.5 большинство Ху-положительных нейронов были Чат ИК и общение-GFP положительные (верхние панели). Небольшое количество этих совместно выразили Чат Cre tdTomato. По E16.5, больше ХАТ-Cre tdTomato нейроны были обнаружены в зарождающейся ганглиев (нижние панели). Масштаб бар = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

Первичные антитела
Антиген Иммуноген Разведение Поставщик & Подробнее
Ху (нейронов человеческого белка) Ху белка 1: 1000 Сыворотку от больного человека (Madison, WI)
GFP (зеленого флуоресцентного белка) GFP белок, IgY доля 1: 1000 Aves Lab, Inc. (Тигард ИЛИ), куриный поликлональные, GFP-1020
Чат (холинацетилтрансферазы) Плаценты человека фермент 1: 100 Millipore (Биллерика, Массачусетс), козьи поликлональные, AB144P
Вторичные антитела
Имя Флуорофорные Разведение Поставщик & Подробнее
Осел античеловеческие DyLight 405 1: 500 Джексон ImmunoResearch лаборатории (Западная Роща, Пенсильвания), 709-475-149
Осел анти-куриный Су2 1: 500 Джексон ImmunoResearch лаборатории (Западная Роща, Пенсильвания), 703-225-155
Осел анти-Коза Су5 1: 500 Джексон ImmunoResearch лаборатории (Западная Роща, Пенсильвания), 705-175-147

Таблица 1. Сведения о первичных и вторичных антител, используемых в исследовании. Первичные и вторичные антитела, используемые в этом исследовании, вместе с их поставщиком и разведения используемые.

Первичные антитела
Антиген Разведение Поставщик Вторичное антитело
Sox10 1:50 Santa Cruz Biotechnology, ДалласТехас Осел анти-Коза
р75 1: 250 Promega, Мэдисон Висконсин Осел анти-кролик
PGP9.5 1: 1000 Abcam, Кембридж, Массачусетс Осел анти-кролик
BFABP 1: 500 Millipore, Billerica, Массачусетс Осел анти-кролик
S-100 1: 500 ДАКО, Карпинтерия, Калифорния Осел анти-кролик
GFAP 1: 500 ДАКО, Карпинтерия, Калифорния Осел анти-кролик
ННО 1: 500-1000 Emson, Кембридж, Великобритания Осел антиовечьим
VIP (вазоактивного кишечного) 1: 500 Эпштейн и Полсен, Мэдисон, Висконсин Осел анти-кролик
Вещество Р 1: 200-400 DIASORIN, Stillwateг, М.Н. Осел антиовечьим
Вторичные антитела
Имя Разведение Поставщик & Подробнее Флуорофорные
Осел античеловеческие 1: 500-1000 Джексон ImmunoResearch лаборатории, Западная Роща, Пенсильвания DyLight 488
Осел античеловеческие 1: 1000 Джексон ImmunoResearch лаборатории, Западная Роща, Пенсильвания Су3
Осел анти-кролик 1: 500 Джексон ImmunoResearch лаборатории, Западная Роща, Пенсильвания DyLight 488
Осел анти-кролик 1: 500 Джексон ImmunoResearch лаборатории, Западная Роща, Пенсильвания Су3
Осел антиовечьим 1: 500 Джексон ImmunoResearch лаборатории, Западная Роща, Пенсильвания Су2 Осел антиовечьим 1: 1500 Джексон ImmunoResearch лаборатории, Западная Роща, Пенсильвания Су3
Осел анти-Коза 1: 500 Джексон ImmunoResearch лаборатории, Западная Роща, Пенсильвания Су3

Таблица 2. Дополнительные первичные и вторичные антитела использования в изучении развития ENS. Первичные и вторичные антитела, что мы ранее работавшие в наших исследованиях развития ENS.

Возбуждение Излучение
Лазерная линия Флуорофорные Тип Примеров Фотоумножитель Фильтры
408 нм Синий Alexa Fluor 405, Каскад Синий, кумарин 30, DAPI, Hoechst, Pacific Blue, большинство квантовых точек 1 ВР 425-475 нм
488 нм Зеленый Alexa Fluor 488, 488 ATTO, Кальцеин, Су2, EGFP, FITC, штат Орегон Зеленый, YO-PRO-1 2 ВР 500-550 нм
561 нм Красный Alexa Fluor 546, 555, 568, 594 и, Су3, DiI, DsRed, mCherry, Фикоэритрин (ПЭ), Пропидиум Йод (ПИ), ЗП, TAMRA, tdTomato, TRITC 3 ВР 570-620 нм
638 нм Далеко Красный Alexa Fluor 633 и 647, аллофикоцианин (АРС), Су5, К-PRO-3 4 ВР 663-738 нм

Таблица 3. Конфокальные Длины волн возбуждения изображения, флуорофоры и фильтры. Длины волн возбуждения, обнаруживаемые флуорофоры, и фильтры, используемые представлены. Эта информация может быть использована при выборе комбинации вторичных антител для многоцветной immunofluoresence.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В нашей лаборатории и другие показали, что кишечные дефекты HSCR не ограничивается aganglionic толстой кишки, но распространяется в проксимальном направлении, даже в тонком кишечнике узловатый 5,15,16. Эти изменения включают изменения в ENS фенотипа нейронов плотности и нейромедиаторов и может составлять моторики, которая наблюдается у пациентов с HSCR. Мы использовали выше методы в наших усилиях, чтобы понять детерминанты формирования ENS. В частности, эти методы были использованы для визуализации нейронов синтазы окиси азота (нОАС) нейроны, нейроны вазоактивные кишечные полипептидные (VIP), а также холин ацетилтрансферазы (чат) нейроны (таблица 2) 5. Ключевым преимуществом этой техники является возможность хранить образцы в 30% сахарозы для последующей обработки, либо для иммунным или для встраивания и cryosectioning.

НКК колонизация кишечника происходит опережение волнового фронта FROM E9.5 в E14.5. Иммуноокрашивание с Ху, который идентифицирует нейроны, как описано выше, в сочетании с анализом изображений автоматизированного, позволяет количественных сравнений нейронов плотности. Снижение плотности нейронов найдены участки кишечника узловатый из HSCR 5, а также в других моделях кишечной моторики 13. Мыши с условной делеции Hand2 продемонстрировать изменения в пропорциях нейронов, выражающих различные нейромедиаторы, а также уменьшенные нейронные номера. Кроме того, животные с более экспрессии Noggin или PTEN продемонстрировали повышенный нейронов плотность вдоль их кишечника 6,17.

Баланс нейромедиаторных фенотипов среди нейронов ENS жестко регулируется, в результате чего координированному сокращению стенки кишечника для перемещения содержимого в просвете, регулирование потока крови и поглощения питательных веществ. После НКК приобрести нейронов идентичность существует узкое окно времени, когдапривязки к нейромедиатора фенотипа 14. Мы недавно показали, что иммунное идентифицирует ChAT нейромедиатора фенотип на E10.5, ранее эмбриональной стадии, чем наблюдается при генетических моделей репортер (например, чат-Cre или чат-GFP) 14. Кроме того, ЧАТ иммунореактивные нейроны достигают уровней взрослых (как доля от всех нейронов ENS) в начале развития, в результате которой предполагает, что нейроны в чате может иметь роль в регулировании дальнейшее дифференцировку нейронов в ENS.

Синтаза оксид (NOS), является основным нейромедиатором релаксации найдены в ENS, и пропорционально увеличивается в ENS нейронов вдоль кишечника в HSCR 5. Кроме того, изменения в вазоактивный кишечный пептид (VIP), нейромедиатор, который также принимает участие в опосредовании расслабление мышц и регулирования расхода крови вдоль стенки кишечника, найдены в моделях HSCR 5. Эти данные позволяют предположить, что для того, чтобы понять, как компonents о ENS регулировать свою функцию, систематическое изучение различных нейромедиаторов должны быть предприняты. Методы, представленные здесь, могут быть легко адаптированы, чтобы этот тип анализа с использованием соответствующих антител.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Байт премии американской детской хирургической ассоциации Foundation (АГ) и Национальных Институтов Здоровья K08DK098271 (АГ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline Oxoid BR0014G
Sucrose Fisher S2
Sodium azide Fisher BP9221
Bovine serum albumin Fisher BP1605
Triton X-100 Sigma X100
Paraformaldehyde Sigma 158127
60 mm Petri dishes Fisher FB0875713A
Fluorescence microscope Nikon SMZ-18 stereoscope
Dissection microscope Nikon SMZ-18 stereoscope
Fine forceps Fine science tools 11252-20
1.5 ml Eppendorf tubes VWR 20170-038
Fluoromount-G SouthernBiotech, Birmingham, AL 0100-01
Glass slides Fisher 12-550-15
Cover glass VWR 16004-330
Confocal microscope Nikon Nikon A1
Nikon Elements Nikon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33, (10), 446-456 (2010).
  2. Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J Med Genet. 45, (1), 1-14 (2008).
  3. Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition. J Surg Res. 184, (1), 132-137 (2013).
  4. Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers. J Comp Neurol. 20, (3), 620-632 (2011).
  5. Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung's disease. Neurogastroenterol Motil. (2013).
  6. Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation. Gastroenterology. 141, (2), 588-598 (2011).
  7. Qu, Z. -D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagyánszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. B. Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine. Cell Tissue Res. 334, (2), 147-161 (2008).
  8. Bian, X. -C., Bornstein, J. C., Bertrand, P. P. Nicotinic transmission at functionally distinct synapses in descending reflex pathways of the rat colon. Neurogastroenterol Motil. 15, (2), 161-171 (2003).
  9. Johnson, C. D., Epstein, M. L. Monoclonal antibodies and polyvalent antiserum to chicken choline acetyltransferase. J Neurochem. 46, (3), 968-976 (1986).
  10. Tooyama, I., Kimura, H. A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers. J Chem Neuroanat. 17, (4), 217-226 (2000).
  11. Koga, T., Bellier, J. -P., Kimura, H., Tooyama, I. Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis. Acta histochemica et cytochemica. 46, (2), 59-64 (2013).
  12. Sang, Q., Young, H. M. The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse. Anat Rec. 251, (2), 185-199 (1998).
  13. Lei, J., Howard, M. J. Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis. Development (Cambridge, England). 138, (21), 4789-4800 (2011).
  14. Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines. Neurogastroenterol Motil. 26, (6), 874-884 (2014).
  15. Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. The pathophysiology of Hirschsprung's-associated enterocolitis: importance of histologic correlates. J Pediatr Surg. 24, (12), 1271-1277 (1989).
  16. Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. Children with Hirschsprung's disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status. J Pediatr Surg. 32, (8), 1206-1210 (1997).
  17. Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction. J Clin Invest. 119, (12), 3586-3596 (2009).
Иммуноокрашивание визуализировать нервную развития системы мышиный Кишечная
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barlow-Anacker, A. J., Erickson, C. S., Epstein, M. L., Gosain, A. Immunostaining to Visualize Murine Enteric Nervous System Development. J. Vis. Exp. (98), e52716, doi:10.3791/52716 (2015).More

Barlow-Anacker, A. J., Erickson, C. S., Epstein, M. L., Gosain, A. Immunostaining to Visualize Murine Enteric Nervous System Development. J. Vis. Exp. (98), e52716, doi:10.3791/52716 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter