Иммуноокрашивание визуализировать нервную развития системы мышиный Кишечная
Summary
The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Neural crest cells differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.
Abstract
The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must then differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. Cholinergic neurons, a major neurotransmitter phenotype in the enteric nervous system, are identified by staining for choline acetyltransferase (ChAT), the synthesizing enzyme for acetylcholine. Historical efforts to visualize cholinergic neurons have been hampered by antibodies with differing specificities to central nervous system versus peripheral nervous system ChAT. We and others have overcome this limitation by using an antibody against placental ChAT, which recognizes both central and peripheral ChAT, to successfully visualize embryonic enteric cholinergic neurons. Additionally, we have compared this antibody to genetic reporters for ChAT and shown that the antibody is more reliable during embryogenesis. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.
Introduction
Кишечная функционирует нервная система (ENS), которая контролирует моторику, всасывание питательных веществ, и местный кровоток, имеет важное значение для жизни 1. ЭНС формируется клеток нервного гребня (НКЦ), которые пролиферируют, мигрируют и колонизировать кишечник, где они дифференцироваться в ганглиев содержащих нейронов и глиальных клеток. Болезнь Гиршпрунга (HSCR, Интернет Законы Менделя в человеке), multigeneic врожденный порок с частотой 1 в 4000 живорожденных, можно считать прототипом для изучения болезни нарушенного образование ENS. В HSCR, НКК не мигрируют и колонизировать переменной длины дистального кишки 2. Кроме того, другие общие желудочно (GI) пороки развития в педиатрической популяции, такие как аноректальной пороками развития, кишечных atresias и нарушений моторики связаны с нарушениями в основных функций ENS, и, вероятно, связано с тонкими, недооцененных, анатомических изменений и функциональных изменений вENS 3-6. Таким образом, методы, которые позволяют нам понять детерминанты развития образования ENS может пролить свет на патогенез и потенциального лечения расстройств желудочно-кишечного тракта у детей.
После миграции и колонизации, НКК дифференцируется в нейроны с маркеров, специфических для их фенотипа нейромедиатора. Холинергических нейронов содержат приблизительно 60% кишечных нейронов 7, и могут быть обнаружены путем окрашивания по холинацетилтрансферазы (ХАТ), синтезирующего фермента на возбуждающий нейротрансмиттер ацетилхолин. Исторически, попытки визуализировать холинергические нейроны смешивать с различной антигенной специфичности антител, направленных против центральной нервной системы (ЦНС) ХАТ в сравнении периферической нервной системы (ПНС) ХАТ 8-10. Тем не менее, антитела, направленные против плаценты ChAT признать как центральную и периферическую Чат 11-13, и мы в последнее время описанные методы, которые позволяют visuaлизация из ENS холинергических нейронов с высокой чувствительностью ранее в развитии чем была достигнута с чатом репортер линий 14.
Здесь мы представляем технику для рассечения, фиксация и иммунное мышиного эмбрионального желудочно-кишечного тракта для визуализации выражение нейромедиатора ENS в нейронах. Для этих исследований, мы использовали мышей Чат CRE повязана с R26R: floxSTOP: tdTomato животных для производства Чат Cre; R26R: floxSTOP: tdTomato мышей (определенные как чат-Cre tdTomato всей рукописи). Эти животные были затем скрещивали с гомозиготных Чат-GFP репортер мышей, чтобы получить мышей, экспрессирующих обе флуоресцентные журналистам, что обнаружить ChAT выражение 14. Эти два репортер животные на линии C57BL / 6J фоне и коммерчески доступны (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).
Protocol
Representative Results
Discussion
В нашей лаборатории и другие показали, что кишечные дефекты HSCR не ограничивается aganglionic толстой кишки, но распространяется в проксимальном направлении, даже в тонком кишечнике узловатый 5,15,16. Эти изменения включают изменения в ENS фенотипа нейронов плотности и нейромедиаторов и м?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Байт премии американской детской хирургической ассоциации Foundation (АГ) и Национальных Институтов Здоровья K08DK098271 (АГ).
Materials
| Phosphate Buffered Saline | Oxoid | BR0014G | |
| Sucrose | Fisher | S2 | |
| Sodium Azide | Fisher | BP9221 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP1605 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| 60 mm Petri dishes | Fisher | FB0875713A | |
| Fluorescence scope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Fine forceps | Fine science tools | 11252-20 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Cover glass | VWR | 16004-330 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1 | |
| Nikon Elements | Nikon |
References
- Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J Med Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
- Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition. J Surg Res. 184 (1), 132-137 (2013).
- Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers. J Comp Neurol. 20 (3), 620-632 (2011).
- Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung’s disease. Neurogastroenterol Motil. , (2013).
- Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation. Gastroenterology. 141 (2), 588-598 (2011).
- Qu, Z. -. D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagyánszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. B. Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine. Cell Tissue Res. 334 (2), 147-161 (2008).
- Bian, X. -. C., Bornstein, J. C., Bertrand, P. P. Nicotinic transmission at functionally distinct synapses in descending reflex pathways of the rat colon. Neurogastroenterol Motil. 15 (2), 161-171 (2003).
- Johnson, C. D., Epstein, M. L. Monoclonal antibodies and polyvalent antiserum to chicken choline acetyltransferase. J Neurochem. 46 (3), 968-976 (1986).
- Tooyama, I., Kimura, H. A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers. J Chem Neuroanat. 17 (4), 217-226 (2000).
- Koga, T., Bellier, J. -. P., Kimura, H., Tooyama, I. Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis. Acta histochemica et cytochemica. 46 (2), 59-64 (2013).
- Sang, Q., Young, H. M. The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse. Anat Rec. 251 (2), 185-199 (1998).
- Lei, J., Howard, M. J. Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis. Development (Cambridge, England). 138 (21), 4789-4800 (2011).
- Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines. Neurogastroenterol Motil. 26 (6), 874-884 (2014).
- Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. The pathophysiology of Hirschsprung’s-associated enterocolitis: importance of histologic correlates. J Pediatr Surg. 24 (12), 1271-1277 (1989).
- Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. Children with Hirschsprung’s disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status. J Pediatr Surg. 32 (8), 1206-1210 (1997).
- Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction. J Clin Invest. 119 (12), 3586-3596 (2009).
