Abstract
ハイグレード漿液性卵巣癌（HGSC）、広範な腹膜転移の原因は、非常に予後不良を持ち続けています。女性の30％未満では診断後5年生存しています。大網はHGSCの転移形成の好ましい部位です。この微小環境の臨床的重要性にもかかわらず、卵巣癌の進行への大網脂肪組織の寄与はunderstudiedまま。それは血管系の高密度の巣の周囲の乳白色B、TおよびNK細胞で構成されているスポット、マクロファージ、および前駆細胞として知られている構造が含まれているという点で、大網脂肪は珍しいです。ミルキースポットが腹膜ホメオスタシスのために必要とされる大網の生理学的機能に重要な役割を果たしています。私たちは、乳白色のスポットはまた腹膜脂肪の卵巣癌転移植民地化、腹膜転移の発生における重要なステップを促進することが示されています。ここでは、我々が当たりで乳白色スポットを評価し、定量化するために開発されたアプローチを説明itoneal脂肪およびin vivoおよびex vivoの両方大網組織の卵巣癌細胞の転移性のコロニー形成への機能的貢献を研究しています。これらのアプローチは、このように広範な腹膜転移の開発に乳白色のスポット構造への細胞の初期の局在から卵巣癌の転移形成の研究を可能にする、追加のマウスモデルおよび細胞株に一般化しています。
Introduction
ほとんどの固形腫瘍とは異なり、高品位漿液性卵巣癌（HGSC）からの転移は、腹膜腔1に制限されています。このように、効果的な腹膜療法は、潜在的に制御またはHGSCを根絶可能性があります。現在、標準的な治療アプローチは、化学療法1-3と組み合わせる外科的細胞減少です。残念ながら、患者の大多数は経験し、疾患再発の合併症に屈します。これらの憂鬱な統計は、転移性コロニー形成の改善された理解の必要性を示し、プロセスは、それによって癌細胞を利用する、および転移2を形成するために、宿主組織内で増殖する局在化。
大網はHGSC転移4-7の好ましい初期のサイトです。他の腹膜脂肪とは異なり、大網脂肪組織は、腹膜homeosにおいて重要な役割を果たしB、TおよびNK細胞およびマクロファージを含む乳白色のスポットとして知られる異常な免疫構造を含みますtasis 8,9。その生理学的機能に加えて、我々は、乳白色スポットが卵巣がん、転移性植民4において積極的な役割を果たしていることがわかりました。実験的転移アッセイにおいて、SKOV3ip.1、CaOV3、及びHeyA8（ヒト）およびID8（マウス、C57BL / 6）迅速にホーム乳白色スポットへ卵巣癌細胞、細胞が分泌走化性因子に向かって移動していることを示唆しています。興味深いことに、癌細胞は乳白色スポット（ すなわち、生殖腺および子宮脂肪）4を欠く腹膜脂肪を植民地化しません。
乳白色スポットコロニー形成を調節する機構を同定するために、我々は、転移性コロニー形成の4時間にわたって細胞および分子事象の尋問を可能にする異種移植片モデルを最適化しました。本明細書中に記載の方法の具体的な利点は、完全に生体内で統合されており、M の ex vivoモデルで、ユーザーが仮説をテストすることができ、組織構造と機能を重視、ですetastatic植民地化4,10。乳白色スポットを含むか、または欠けているいずれかの腹膜脂肪デポで癌細胞の局在化と成長を比較することにより、研究者は、宿泊施設と、生理学的に関連する組織における卵巣癌細胞の進行性の成長に乳白色の斑内の脂肪細胞と細胞の相対的な寄与（複数可）をテストすることができます。
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Protocol
全てのマウスは、制度動物実験委員会（IACUC）のガイドラインに、シカゴ動物資源センターの大学の監督の下で応じて、収容され維持し、安楽死させました。
実験的研究のための準備1.動物
- 動物が輸送及び取扱いの潜在的な生理学的影響から回復するために、新しい住宅や環境に順応できるようにします。
注意：以下のような手法は、マウスのすべての市販の株にも適用可能です。実験に使用する動物の数は、試験デザインに依存しており、統計学者からの相談に行ってください。
2.同定および腹膜脂肪デポの単離。
- 死を確認するために、CO 2過剰摂取と二物理的方法を介して、動物を安楽死させます。
- 収穫腹膜脂肪デポとして内部臓器摘出（二法）、MAを構成しますKE内臓（ 図1A）を露出するために腹膜壁を通して鼠径乳頭に近い正中切開。
- 大網脂肪（OM）は、鉗子（ 図1C）で腹腔から脾臓を拡張することで、大網/膵臓複合体を公開します。密接にすべての組織の接続をトリミングすることによって膵臓と脾臓から大網を解除してください。残りの膵臓組織は、4を切除していることを確認します。
- 生殖腺脂肪（GF）の場合は、組織の接続（ 図1Aの上部RIGHトン）4を切断することにより、卵巣と消費税を取り巻く生殖腺脂肪を持ち上げるために鉗子を使用しています。
- 子宮脂肪（UF）は、組織の接続を切断することによって子宮角と消費税を取り巻く子宮脂肪持ち上げるために鉗子を使用します（ 図1Aを右下）4。
- 腸間膜脂肪（MF）は、小腸と幽門との間の接合部をカット。の自由端をしっかりとグリップに鉗子を使用してください小腸、およびそれ離れ腸間膜脂肪からゆっくりと「皮」。 （ 左下図1A）解剖ハサミを使用して、腸間膜根から腸間膜脂肪をリリース4。
- Splenoportalファット（SF）は、膵臓に脾臓の門を接続する組織の薄い脂肪バンドを公開するために鉗子を使用して、脾臓の遠位端を持ち上げます。最初の膵臓からそれを解放した後、慎重に脾臓（ 図1B）4からそれを解剖することによって消費税splenoportal脂肪を。
ギムザ染色を使用3.ミルキースポットの同定
- 消費税のomentumの複数形は、C57BL / 6マウスから16時間（O / N）のために4℃で5％中性緩衝ホルマリンで固定し（2.3ステップを参照してください）。
- 固定組織をパラフィン包埋のために、組織の大きさに適した金型を選択します。金型を埋めるためにパラフィン容器から溶融パラフィンを注ぎます。カセットを開き、温かい使用してCEPS、金型内に組織を移します。
- 慎重縦断面を生成するためにパラフィン包埋中の組織を向けます。しっかりと所定の位置に成形、プレスの上にラベルされた組織カセットを置きます。金型は、少なくとも30分間冷却してください。
- ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織ブロックから（厚さ4μm）連続切片をカットします。組織のリボンがパラフィンブロックから離れるようセクションの下で予備洗浄スライドを置きます。
- シリアルセクション全体大網。収集し、ギムザ染色（3.6を参照）ごとに第3の部分を染色します。 RTでO / N好ましくは、空気乾燥するセクションで、スライドガラスを許可します。乾燥したスライドは固定のために準備ができています。ギムザ染色スライドとの比較のためにヘマトキシリンおよびエオシンのための最初のセクションを染色。
- キシレンで2つの連続した5分間のインキュベーションによってスライドを脱パラフィン。以下に2つの連続インキュベーションによってスライドを再水和：100％エタノール、95％エタノール、そして最後にWAをタップター。
- 乾燥からスライドを避けるために適切な予防措置を講じてください。 RTですべての手順を実行します。
- 完全に5％ギムザ溶液を含むコプリンジャーにスライドを浸漬し、室温で4分間インキュベートする（水道水で調製したW / V）。空気乾燥、60秒間スライドを水道水ですすぎ、取り付けメディアを使用してカバーガラスでマウントします。
- イメージメーカーのソフトウェアを使用して全スライドスキャナとプロセスを用いて染色したスライド。 ImageJソフトウェア4を使用して、ギムザ染色した大網のセクションで乳白色のスポット量を定量化します。
インビボおよびエクスビボ研究のための卵巣癌細胞の4伝播と準備
- 熱浴で37℃に細胞成長培地のプレウォーム15 mlです。凍結ストックを調製した細胞ライン、通路番号、日付と人の名前、および日付で標識することにより、適切なサイズの組織培養フラスコ（例えば、75cm 2の表面積）を準備そして、細胞をプレーティング/融解している人。
注意：ダウン凍結および継代数の日は、転移性の表現型に影響を与えることができるように転移の研究では、このような詳細な情報は、非常に重要です。 - 生物学的安全フード、ピペットT-75培養フラスコに培地10mlの無菌環境を使用して。液体窒素システムからの細胞のバイアルを取り外し、電池の種類を確認するために、ラベルを確認してください。 37℃の加熱浴中で加温することにより、一度にセルの一つのバイアルを解凍します。
- 無菌技術を用いて、ピペット1×10 6の培養フラスコに細胞を解凍しました。細胞が付着できるようにするためにインキュベーターにフラスコを置きます。静かに均一な細胞懸濁液を形成するために、前後にフラスコを揺すります。
- 場所の組織培養インキュベーター中でフラスコを5％CO 2環境において37℃で維持します。細胞は、O / Nを接着することを許可します。
- 吸引するメディアは、新鮮な予熱した増殖培地と交換してください。インキュベーターにフラスコを置き、すべてのOW細胞が成長します。倒立顕微鏡を用いて2〜3日おきに目視検査により毎日細胞増殖を監視します。 70〜80％コンフルエンスに達したときに継代細胞への標準的な細胞培養技術を使用してください。
注意：実験的なアッセイは、細胞が活発に増殖していることを確認するために、70％コンフルエンスで細胞を回収するために。 - 培地を吸引除去し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）10mlですすいでください。吸引し、PBSおよび0.25％トリプシン/ EDTA（75cm 2の表面積のために2〜3 ml）を追加し、37ºCで5分間インキュベートします。視覚細胞が切り離されていることを確認し、単一細胞懸濁液を得るために、上下同じ成長培地の体積、ゆっくりピペットセルを追加。
注：それは、トリプシンを不活性化するように増殖培地は、血清を含有することが重要です。後続のステップの間に細胞の損失を補うために所定の実験のために必要な数よりも4倍以上のセルに少なくとも2-準備 - 中の生存細胞の割合を決定します血球計または自動細胞カウンターを用いて、トリパンブルー排除アッセイを介したサスペンション。
注：ここでは、細胞のみの≥96％が生存している細胞調製物を使用しています。 - 50mlコニカルチューブにフラスコから細胞懸濁液を転送します。 4 O℃で、1100×gで5分間遠心分離することにより細胞をペレット化
- 上清を吸引除去し、1ml当たり2×10 6細胞の濃度になるようにPBSで細胞ペレットを再懸濁します。
細胞の5腹腔内注射
注：我々の実験では、マウスを病原体暴露のリスクを制限するために、私たちのバリア施設内の層流や安全キャビネット内で処理され、明らかにこの技術を実証するために、付属のビデオの手順は、承認された実験室で実施しました動物の仕事のため。この特定の技術は、麻酔下に動物を必要としません。承認されたプロトコルの下では、このtechniqを行います生きた動物のUE。この研究のために、マウスの適切な菌株を使用してください。たとえば、次のようにヒト卵巣癌細胞（SKOV3ip.1、およびHeyA8）コロニー形成の研究のために、免疫不全、無胸腺ヌードマウスを使用します。マウス卵巣癌細胞の研究のための免疫担当C57BL / 6マウス（ID8）コロニー形成を使用しています。
- 滅菌キャップした25 G針を入れたシリンジにロードし、単一細胞懸濁液の500μlのをと。これは、注射の前に、細胞せん断を低減します。
- 首筋によってマウスをピックアップし、手のひらと人差し指を使用して尾を保持し、リングと（マウスを左手で拘束されている）小指の間に左後肢を修正。
注意：トラウマ腹部臓器を回避するために、それは注入中に動かないようによくマウスを抑えます。 - ちょうど膝の上の腹部全体のラインを想像して、動物の右側のポイントを見つけて、正中線に近接しています。エントリのポイントは、頭蓋へとわずかに内側であります最後の乳首の。
注：マウスの右側に針を挿入すると盲腸を回避し、腸11を穿刺のリスクを低減します。 - 約0.5センチメートルの深さに、マウスの腹部の下側方の領域に針を挿入します。針が血管または他の腹膜器官に浸透していないことを確認するために、プランジャーを後方に引いて。
- 任意の流体を吸引されている場合は、シリンジ（サンプル）11を捨てます 。 - 緑がかった茶色や黄色の吸引は、それぞれ、腸や膀胱に針貫通を示します。
- 遅い、安定した圧力を使用してサンプルを注入します。針を撤回し、そのケージにマウスを返します。シャープコンテナで処分する前に注射器をおさらいしないでください。
- 特定の時間にポイントが注射後、CO 2窒息と重要な臓器摘出を経由してマウスを生け贄に捧げます。
生体6.ミルキースポット植民地化
- Quantitaフローサイトメトリーを使用して乳白色のスポットへの癌細胞の局在化
- マウスから腹膜脂肪デポを分離する（ステップ2.3で説明したように - 2.7）蛍光氷冷PBS中の癌細胞と即時場所の組織をタグ付けで注入しました。
- この特定の技術については、重量試合大網へのすべての脂肪、脂肪組織。転写組織を無血清DMEM 1.5mlの0.1％（w / v）のウシ血清アルブミンを含有する5 mlチューブを分離します。プール組織は、フローサイトメトリーのための細胞の十分な収率を確保するために、3つの独立したマウスから採取しました。
- 外科用ハサミを使用して追加ミンチ組織（w / v）のコラゲナーゼIで回転混合しながら30分間37℃で組織懸濁液をインキュベートし、0.4％を含有する無血清DMEM 1.5mlの。
- オプションのステップとして、さらに咀嚼することによって、組織の関連付けを解除します。この場合、向きを回転させ、低オン10分間咀嚼、microstomacherバッグに組織コラゲナーゼサスペンションを転送5分後に袋の。
- ナイロンメッシュフィルター（60ミクロンの孔）を介して、フィルタのサンプルが大きな破片を除去します。 4℃で5分間、250×gの遠心分離により細胞を回収し、上清画分を捨てます。
- ACK溶解緩衝液900μLと混合し、1分間室温でインキュベートし、100μlのPBSで細胞ペレットを再懸濁します。 250×gで遠心し、細胞を5分間、上清を捨てます。
- 氷冷PBS250μlの中で細胞ペレットを再懸濁します。単一細胞懸濁液を確実にするために、60ミクロンの孔のナイロンメッシュを通してサンプルをフィルタリングします。氷冷PBSの250μlのフィルターを洗浄します。
- 561 nmの黄緑色レーザーおよび585 nmの/ 15nmのバンドパスフィルターを備えたフローサイトメーターを使用して集団内の蛍光タグ付けされた細胞の数を定量します。親細胞および/ または適切なネガティブコントロール4の分析に基づいてtdTomato陽性細胞のためのゲートを設定します。
- 微視的および巨視的な転移の定量
- 希望の実験の終点（s）で、分離し、直ちに適切な固定メディアで組織を置きます。無傷性腺、子宮、および4℃で48時間、10％中性緩衝ホルマリンで腸間膜脂肪デポなどのより大きなサンプルを修正しました。 2-16時間4℃で5％中性緩衝ホルマリン中で小さいサンプル（大網とsplenoportal脂肪だけでなく、子宮及び腸間膜脂肪の組織相当）を修正しました。
- また、スナップ10月などの凍結培地でそれらを配置することによって、組織を凍結し、液体窒素の適切な量にドロップします。
- パラフィンに包埋するまで4℃で70％エタノールおよびストアに固定された組織を転送します。埋め込みと3.2と3.3で説明したようにプロセス組織。
- 微視的転移の有無について組織を評価するために、H＆E染色切片を使用する（ すなわち 、50個の細胞のクラスター）。トンを確認彼このようなサイトケラチン8/18のためのIHC染色などの二次法による微細な転移の存在は、卵巣癌細胞を検出することができます。
- 希望の実験の終点（s）で、分離し、直ちに適切な固定メディアで組織を置きます。無傷性腺、子宮、および4℃で48時間、10％中性緩衝ホルマリンで腸間膜脂肪デポなどのより大きなサンプルを修正しました。 2-16時間4℃で5％中性緩衝ホルマリン中で小さいサンプル（大網とsplenoportal脂肪だけでなく、子宮及び腸間膜脂肪の組織相当）を修正しました。
7.ミルキースポット植民エクスビボ
- 基本的なex vivoで大網器官培養条件の確立
- 20％FCSを含むDME / F12培地の500μLを含む12ウェル組織培養プレートの1つのウェル内の単一培養プレートインサートと所定の位置にそれぞれ大網を置きます。 24〜48時間、および/ または追加の時点で5％CO 2環境下で37℃での器官培養を維持します。各条件（例えば、メディアタイプ/時点）のための3つの独立したomentumの複数形（三重サンプル）を使用します。
- 組織の完全性を評価することができるH＆E切片に壊死した脂肪細胞に対する健康カウントステップ3に記載のように修正し、プロセスサンプル、実験的なエンドポイントでの組織の整合性を確認するために。から〜120セルの最小5生物学的サンプルは、10現在生きている組織の割合を策定する必要があります。
- 20％FCSをDME / F12培地を500μlを含む24ウェルプレートの別々のウェルにおける組織機能、場所omentumの複数形（N = 3）を測定しました。 omentumの複数形は、24時間、5％CO 2環境において37℃で培地を調整し、その後、IL-6 ELISAアッセイ10で使用するための250μLを除去することを可能にします。
- SKOV3ip.1-GFP細胞とマウスの大網の ex vivo共培養
- 成長し、1ml当たり2×10 6細胞の濃度でセクション4および再懸濁で説明したように、蛍光タグ付けされた細胞を調製。
- 組織接着剤の〜6μlを培養インサートの膜に適用し、空気乾燥にそれを可能にします。余分な接着剤を除去するために、滅菌水で2回膜を洗ってください。空気が層流フードの下で膜を乾燥させます。
- 慎重omentumの複数形を切除し、接着剤を塗布したMEMBに添付滅菌ピンセットを使用してRANE。組織は、従来のメディアを追加する1分間膜に付着することを許可します。各培養インサート内の各大網の上に細胞懸濁液を500μlを追加します。 DME / F-12 10 2.5 mlのトランスウェルチャンバーの周りの領域を埋めます。
- 5％CO 2環境において37℃で6時間、細胞懸濁液をインキュベートomentumの複数形。慎重に除去し、PBSの〜10mlでomentumの複数形を洗います。適切な蛍光イメージングシステム 10を用いた蛍光癌細胞の病巣を可視化します。
- マウスから腹膜脂肪デポを分離する（ステップ2.3で説明したように - 2.7）蛍光氷冷PBS中の癌細胞と即時場所の組織をタグ付けで注入しました。
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Representative Results
腹膜脂肪デポの同定と組織学的検査
総解剖学的解剖は、腹膜脂肪（ 図1A）の5つの主要な情報源の4の同定を可能にします。上部中央から時計回りに移動すると、次のとおりです。大網（OM;概説）子宮角に取り付けられて胃と脾臓の上に位置して、左卵巣を囲む生殖腺脂肪（GF）（OV）、子宮脂肪（UF）（UH）そして、腸間膜（MY）は、小腸（SI）に接続されています。卵巣（OV）、子宮角（UH）、小腸（SI）は、基準点として示されています。 splenoportal脂肪（SP）は脾動脈を囲み、腹腔動脈（ 図1B）に脾臓の門を接続しています。最後に、網は、胃および膵臓（ 図1C）に取り付けられています。これらの組織の全体構造と相対的な大きさは、 図1Dに示されている。目の組織学的検査をE組織はsplenoportalと大網脂肪が脂肪細胞[A]に囲まれた組織周辺でミルキースポット[MS]構造を含んでいることを示しています。子宮、性腺、および腸間膜脂肪はない（ 図1E）。
ギムザ染色を使用したミルキースポット識別
異なるマウス系統、乳白色スポット量と個々のomentumの複数形に存在する領域との間の全体的な乳白色スポットコンテンツの比較を可能にする新規な方法を用いて定量しました。方法に記載したように、omentumの複数形の「デジタルホールマウントを「5％ギムザ溶液に組織のすべての第3のセクションを染色し、染色された組織（ 図2A）の画像を捕捉することによって構築しました。ミルキースポットはダークブルー（ 図2B）を染色領域として表示されます。乳白色のスポットとして、これらの領域の同一性は（CD45、共通のリンパ球マーカー陽性の細胞のためのH＆E染色およびIHCの両方で連続切片で確認されました
大網の癌植民地化の定量的および定性的評価
フローサイトメトリーに基づく方法は、腹腔内注射後の脂肪デポ中に存在する癌細胞の数を定量するために開発されました。このプロトコルは、転移プロセスの初期の植民地化の手順を研究するのに特に有用です。例えば、 図3Aに 、ID8-tdTomato細胞を調製し、C57BL / 6マウスに腹腔内注射しました。方法に記載のように7日間注射後（DPI）で、脂肪器官を回収し、単細胞懸濁液に解離。 tdTomato CEの数LLSは、フローサイトメトリー（左図3A）を用いて定量しました。大網はtdTomato陽性事象の数は約12倍の増加を示し、PBS-への相対は、コントロール（ 右図3Aを ）注入したが、生殖腺脂肪、子宮脂肪、または腸間膜の細胞調製物の有意な増加はなかったです。補完的な定性的なIHCベースのアプローチでは、7日SKOV3ip.1細胞の腹腔内注射した後、同程度の癌細胞の病変は大網とsplenoportal脂肪（ 図3B）の両方で観察されたことを示しました。 IHCは、人間のパン - サイトケラチン（パン-CK）のために乳白色の斑内の癌細胞の存在を確認します。 IHC染色の特異性は、汎サイトケラチン抗体（ 図3B）のためのIgG対照を用いて確認しました。腹膜脂肪デポのID8卵巣癌のコロニー形成は7 dpiでC57BL / 6マウスを用いて評価しました。大網とsplenoportal脂肪の両方の乳白色の斑の大きな癌細胞病変が出ています並んでいました。パネルの挿入図に示されるように、癌細胞の小さなクラスターは時折、他の脂肪デポで見られました。従って、一方は所定の組織内の細胞の相対数及び位置の両方にアクセスすることができます。
ミルキースポットの卵巣癌のコロニー形成を研究するためのex vivoアッセイ
組織組成とアーキテクチャを維持しながら、 インビボの条件の制限に対処するために、我々は、大網組織の卵巣癌細胞のコロニー形成を研究するためにex vivoでのアプローチを最適化します。マウスから摘出した全大網組織が 正常に乳白色のスポットと卵巣癌と の相互作用を研究するためにex vivoで培養されます。 SKOV3ip.1-GFP細胞をex vivoで培養された大網組織上に播種し、6時間にわたり37℃で維持しました。 GFP陽性蛍光細胞は、両方のex vivoおよび in vivoで控えめな病巣に見えました図4A）の6時間後に注射を収穫しました。両方の条件の下では、H＆E染色を用いた組織学的検証乳白色スポット（ 図4B）への癌細胞の局在を確認しました。癌細胞のためのサイトケラチン染色を用いて確認染色は乳白色スポット（ 図4C）内の癌細胞巣の存在を示しました。これらのデータは、ex vivoで使用する可能性がin vivoでの調査結果を補完するためのメカニズムベースの研究のためのアプローチを示しています。
図1.メイン腹膜脂肪デポの相対的な位置や構造。 （A）腹膜脂肪の5つの主要な情報源の4の相対的な位置を示す総解剖学的解剖。大網（OM;概説）、生殖腺脂肪（GF）、子宮脂肪（UF）、腸間膜。（MY）、（OV）、子宮角（ええと）卵巣および小腸（SI）が示されている（B）Splenoportal脂肪（SP;概説）。ピンセットで脾臓を持ち上げて露出した（C）解剖示すマウス大網可視化を改善するために膵臓からの自由D：相対的なサイズおよび切除した腹膜脂肪の構造;腸間膜が腸間膜根に取り付けられて示されている。乳白色スポット（A）脂肪細胞の存在について、腹腔脂肪のE.組織学的評価を、（MS）ミルキースポット。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
大網組織で乳白色スポットを定量化するための2ギムザベースのアプローチを図。 （A）;ギムザで染色した全体大網のセクションのイメージ。評価さ大網組織の連続切片（B）ギムザ染色。乳白色のスポットは黒矢印で示されている（C）H＆E染色。そして、乳白色スポット構造内リンパ球を同定するための抗CD45抗体を用いた（D）IHC。スケールバーは、BD用と同じで、100ミクロンを示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.卵巣癌細胞は、優先的に乳白色のスポットが含まれている腹膜脂肪を植民地化する。フローサイトメトリーは、ID8-の7 dpiで大網（OM）マウスから採取し、子宮脂肪（UF）、生殖腺脂肪（GF）、および腸間膜（MY）の分析tdTomato細胞（ 左 ）。データが提示されていますPBSを注射したマウス（ 右）オーバーtdTomato-ポジティブ細胞の倍数変化の増加など。エラーバーは平均の標準誤差を示します。 **両方の標準的な組織学によって、組織の（B）審査。PBS対照に比べてp <0.01を示し、IHCは、大網および（ヌードマウスに1×10 6 SKOV3ip.1細胞の注射後）splenoportal脂肪の両方で乳白色スポットの同等のコロニー形成を示しています。切片をH＆E染色により評価しました。病変内の上皮（癌）細胞の存在は、パン - サイトケラチン（汎CK）抗体を用いたサイトケラチンのIHC検出によって確認しました。汎サイトケラチンのためにIgGアイソタイプの抗体を用いたIHC染色は、特異性の対照として使用しました。スケールバーは、すべての画像に対して同じであるとは100μmを示す。7 dpiでC57BL / 6マウスにおける腹膜脂肪デポのID8卵巣癌植民地化の（C）の評価。 クリックしてくださいここで、この図の拡大版を表示します。
図4.大網に卵巣癌細胞の ex vivo植民地化。列は、1×10 6 SKOV3ip.1細胞（中央）のマウス6時間後の腹腔内注射からomentumの複数形をナイーブomentumの複数形を示す3つの実験条件（左）との比較を表していますそして、SKOV3ip.1-GFPとomentumの複数形は 、ex vivoでの条件（右）の下に植民地化。ナイーブomentumの複数形（ブランク）、omentumの複数形は、in vivoアッセイ（in vivoでの添付ファイル）からSKOV3ip.1-GFPの植民地または ex vivo培養条件（添付ファイルのex vivo）でSKOV3ip.1-GFPによって植民地化omentumの複数形。 GFPのための全体omentumの複数形の蛍光イメージングは、（A）in vivoおよびex vivoのアッセイの両方のための同様のコロニー形成パターンを示しています。の連続切片のH＆E染色パネルAからomentumの複数形は、乳白色スポット（B）に局在癌細胞の存在を確認します。卵巣癌細胞のためのサイトケラチンは、H＆E染色（C）を検証します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
播種細胞を標的とする治療法の開発は、腹膜疾患の発症に重要な最初のステップは 、転移性コロニー形成のメカニズムの理解が必要です。我々は、大網の固有の組織組成とアーキテクチャは、卵巣癌、転移性コロニー形成を促進する方法を識別するために使用することができるアプローチを報告し、これらの問題に対処します。我々のアプローチの特徴的な機能は以下のとおりです。植民地化過程における初期の事象の1）に注力しています。ミルキースポット含有および欠乏脂肪デポの2）の比較。 3）再生可能な技術の利用可能性は、組織中の乳白色のスポット量を定量します。 4）in vivoでの相補性の可用性およびex vivoでは乳白色のスポット構造の卵巣癌細胞コロニー形成を評価するために近づきます。
これらの研究を行う際に、私たちは研究者が頻繁にマウス大網の場所とSPの存在に気づいていないことを認識するようになりましたミルキースポット含有腹膜脂肪のセカンドソースとして機能lenoportal脂肪バンド、。本明細書に記載の技術は、転移性のコロニー形成のステップの研究を可能にするが、それらは唯一リアルタイムで植民地化の評価これらのプロセスの「スナップショット」を提供し、ではありません。適切に続いている場合、記載されているようなプロトコルは、研究者の範囲に再現性のある結果が得られるはずです。これらの技術の成功に不可欠である：1）特定し、フローサイトメトリーから得られた定量的なデータを歪曲します他の組織型による汚染などの特定の腹膜脂肪組織を解剖します。 2）問題の研究のためのトランスジェニックマウスの適切な系統を実装します。これは、経時的研究は、個々の細胞株について決定されるべきであることに留意すべきです。経験的には、増殖速度、腫瘍テイクや転移能の時間を含む様々な要因に依存します。
interaを解剖することに加えて転移形成に重要である十分に確立された卵巣癌細胞株およびそれらの大網微小環境のctionsは、本明細書に記載された技術はまた、漿液性卵管上皮内癌の早期分子変化を再現臨床由来細胞株の悪性度を評価するために使用することができ卵管12-17の線毛。これらの病変の進行の分子経路が出現しているが、in vivoでの研究は、特定の変異の生物学的意義を決定するために必要とされます。 インビボにおける相補的な元のアッセイは、研究から集め、モデル前駆細胞株情報により大網組織の転移性コロニー形成における特定のステップを評価するために使用することができる治療仮説を生成し、さらに前臨床研究の設計に重要であり得ます。
転移性コロニー形成を制御するメカニズムを識別することは予防を可能にすることができますまたは転移形成の制御。例えば、18〜22（ すなわち、BRCA1またはBRCA2遺伝子の突然変異キャリア）卵巣癌を発症するリスクが高い女性は、多くの場合、腹膜疾患23,24の発症リスクを低減するために予防的卵管卵巣摘除術を受けます。残念ながら、患者はしばしば、依然としてによる手術時の網と他の転移部位内に存在する卵巣癌細胞の増殖にHGSCを開発します。大網組織微小環境を破壊する薬剤の同定は、大網内癌細胞局在化および/または増殖を防ぐことができます。このようなアプローチは、潜在的に転移形成を防止または（外科的減量した後）は、癌の再成長を抑制するために、卵巣癌細胞を標的とする治療薬と組み合わせて使用することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | NA | |
| Geimsa | Fluka/Sigma Aldrich | 48900 | |
| 5% Formalin | Sigma | HT501320 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | Without calcium and Magnesium |
| 26 gauge needle | BD | 329652 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| Stomacher | Seward Labsystems | Stomacher 80 Biomaster | |
| Microstomacher bag | Stomacher Lab Systems | BA6040/Micro | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Millicell culture plate insert | Millipore | PICM01250 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 |
References
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