Abstract
High-grade serøs æggestokkræft (HGSC), årsagen til udbredte peritoneale metastaser, fortsætter med at have en yderst dårlig prognose; færre end 30% af kvinderne er i live 5 år efter diagnosen. Omentum er en foretrukken stedet for HGSC metastasedannelse. På trods af den kliniske betydning af dette mikromiljø, bidrag oment fedtvæv til ovariecancer progression forbliver dublerede. Oment fedtvæv er usædvanlig, idet den indeholder strukturer kendt som matte pletter, der består af B, T, og NK-celler, makrofager og progenitorceller omgivende tætte reder af vaskulatur. Matte pletter spiller en central rolle i de fysiologiske funktioner af omentum, som er nødvendige for peritoneal homeostase. Vi har vist, at matte pletter også fremme æggestokkene metastatisk kolonisering af peritoneal fedt, et vigtigt skridt i udviklingen af peritoneale metastaser. Her beskriver vi fremgangsmåder udviklede vi at evaluere og kvantificere matte pletter i pritoneal adipøse væv og undersøge deres funktionelle bidrag til ovariecancercelle metastatisk kolonisering af oment væv både in vivo og ex vivo. Disse metoder er generaliseres til yderligere musemodeller og cellelinjer, hvilket muliggør studiet af ovariecancer metastasedannelse fra den indledende lokalisering af celler til mælkeagtige spot strukturer til udvikling af udbredte peritoneale metastaser.
Introduction
I modsætning til de fleste faste tumorer, er metastaser fra høj kvalitet serøs ovariecancer (HGSC) begrænset til bughulen 1. Således kunne effektive peritoneale behandlingsformer potentielt kontrollere eller udrydde HGSC. I øjeblikket, en standard terapeutisk tilgang er kirurgisk cytoreduktion kombineret med kemoterapi 1-3. Desværre langt de fleste patienter oplever og bukke under for komplikationer af recidiv. Disse dystre statistikker viser behovet for bedre forståelse af metastatisk kolonisering, den proces, hvorved cancerceller lokalisere til, udnytte, og formere sig inden værtsvæv at danne metastaser 2.
Omentum er et foretrukket sted for tidligt HGSC metastaser 4-7. I modsætning til andre peritoneal fedt, oment fedtvæv indeholder usædvanlige immune strukturer kendt som mælkeagtige pletter, der indeholder B, T og NK-celler og makrofager, som spiller vigtige roller i peritoneale homeosTASIS 8,9. Ud over deres fysiologiske funktioner, fandt vi, at matte pletter spille en aktiv rolle i æggestokkræft metastatisk kolonisering 4. I eksperimentelle metastase assays, SKOV3ip.1, CaOV3 og HeyA8 (human) og ID8 (murine; C57BL / 6) ovariecancerceller hurtigt hjem til mælkeagtige pletter, hvilket tyder på, at cellerne bevæger sig i retning af et udskilt kemotaktisk faktor. Interessant, behøver kræftceller ikke kolonisere peritoneal fedt mangler mælkeagtige pletter (dvs. gonadale og uterin fedt) 4.
For at identificere mekanismer, der regulerer mælkeagtig spot kolonisering, har vi optimeret xenograftmodeller der muliggør afhøringen af cellulære og molekylære begivenheder over tidsforløbet af metastatisk kolonisering 4. En særlig fordel af de tilgange, der er beskrevet heri, er dens vægt på væv arkitektur og funktion, som giver brugerne mulighed for at afprøve hypoteser i fuldt integreret in vivo og ex vivo-modeller af metastatic kolonisering 4,10. Ved at sammenligne kræftcellen lokalisering og vækst i peritoneale fedtdepoter, som enten indeholder eller mangler matte pletter, kan efterforskerne teste relative bidrag (e) af adipocytter og celler inden mælkeagtige pletter til logi og progressiv vækst ovariecancerceller i fysiologisk relevante væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus blev opstaldet, vedligeholdes og aflives efter Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) retningslinjer og under tilsyn af University of Chicago Animal Resource Center.
1. Forberedelse dyr til forsøg Studies
- Tillad dyr at akklimatisere sig til nye boliger og miljø, til at komme sig fra potentielle fysiologiske virkninger af transport og håndtering.
Bemærk: Følgende teknik er gældende for alle kommercielt tilgængelige stammer af mus. Antallet af dyr, der skal anvendes til et eksperiment er afhængig af undersøgelsen design og skal gøres med høring fra en statistiker.
2. Identifikation og isolering af Peritoneale fedtdepoter.
- Aflive dyr via CO 2 overdosis og en sekundær fysisk metode til at bekræfte døden.
- Som høst peritoneale fedtdepoter udgør fjernelse indre organ (sekundær metode), make en midtlinieincision tæt på lyskelymfeknuder papiller gennem bugvæggen for at blotlægge de indre organer (figur 1A).
- På oment fedt (OM), udsætte oment / pancreas kompleks ved at udvide milten fra bughulen med en pincet (figur 1C). Slip omentum fra bugspytkirtlen og milt ved nøje at trimme alle vævsforbindelser. Sikre, at enhver tilbageværende pancreas væv er fjernet 4.
- For gonade Fat (GF), skal du bruge pincet til at løfte gonade fedt omkring æggestokkene og punktafgifter ved at skære væv forbindelser (figur 1A øverste mennesk t) 4.
- For livmoderen Fat (UF), skal du bruge pincet til at løfte uterin fedt omgiver uterine horn og punktafgifter ved at skære vævsforbindelser (figur 1A nederste højre) 4.
- På Mesenterial Fat (MF), sender forbindelsen mellem tyndtarmen og pylorus. Brug pincet til fast greb den frie ende aftyndtarmen, og langsomt "skræl" den væk fra mesenteriske fedt. Slip mesenterial fedt fra mesenterial rod ved hjælp af dissekere saks (figur 1A nederst til venstre) 4.
- På Splenoportal Fat (SF), løfte den distale ende af milten med pincet for at blotlægge den tynde fedtholdige bånd af væv forbinder hilum af milten til pancreas. Udskære splenoportal fedt ved først at frigive det fra bugspytkirtlen og derefter forsigtigt at dele det fra milten (Figur 1B) 4.
3. Milky Spot Identifikation Brug Giemsa Farvning
- Excise omenta (se trin 2.3) fra C57BL / 6-mus, og fastgør 5% neutral bufret formalin ved 4 ° C i 16 timer (O / N).
- For paraffin indlejring af fikseret væv, vælge en form, der er passende for størrelsen af vævet. Hæld smeltet paraffin fra paraffin reservoiret til at fylde formen. Åbn kassetten og bruge varmt forrørhatte, overføre vævet ind i formen.
- Orientere omhyggeligt væv under indlejring i paraffin til at producere langsgående sektioner. Placer mærkede væv kassette over støbning og tryk fast på plads. Lad formen til afkøling i mindst 30 minutter.
- Skær serielle snit (4 um tykke) fra formalinfikseret paraffinindlejret (FFPE) vævsblok. Placer en afrenset dias under afsnittene som bånd af væv kommer ud paraffinblokken.
- Serielt afsnittet hele omentum; indsamle og plette hver tredje sektion for Giemsa farve (se 3.6). Tillad objektglasset med afsnittene lufttørre, fortrinsvis O / N ved stuetemperatur. Tørrede dias er klar til fiksering. Farv den første sektion for hæmatoxylin og eosin til sammenligninger til Giemsa farvede objektglas.
- Afparaffiniser lysbilleder af to sekventielle 5 min inkuberinger i xylener. Rehydrere slides ved to sekventielle inkubationer i det følgende: 100% ethanol, 95% ethanol, og endelig trykke water.
- Træffe passende forholdsregler for at undgå dias fra tørring. Udfør alle trin på RT.
- Fordybe objektglassene i en Coplin-skål indeholdende 5% Giemsa-opløsning (w / v fremstillet i ledningsvand) og inkuberes i 4 minutter ved stuetemperatur. Skyl dias i postevand til 60 sek, lufttørre og montere med dækglas hjælp montering medier.
- Billede de farvede dias ved hjælp af en hel Slide Scanner og proces med producenten software. Kvantificere mælkeagtig stedet volumen i Giemsa-farvede oment sektioner ved hjælp ImageJ software 4.
4. Formering og Udarbejdelse af ovariecancerceller til in vivo og ex vivo studier
- Pre-varme 15 ml cellevækstmedium til 37 ° C i et varmebad. En hensigtsmæssigt dimensioneret vævskulturkolbe (f.eks 75 cm2 overfladeareal) Fremstilles ved mærkning med navn cellelinie, passage nummer, dato og person, der forberedte frossen stamme, og datoenperson, der optøning / udpladning af cellerne.
Bemærk: I studier af metastase sådanne detaljerede oplysninger er afgørende, da datoen for fryse ned og passage nummer kan påvirke den metastatiske fænotype. - Brug af sterilt miljø for den biologiske sikkerhed hætte, pipette 10 ml medium i T-75 dyrkningskolbe. Fjern et hætteglas med celler fra den flydende nitrogen, og tjekke etiketten for at bekræfte celletype. Optø kun ét hætteglas med celler ad gangen ved opvarmning i 37 ° C varmebad.
- Anvendelse af steril teknik, pipette 1x10 6 optøet celler i kulturen kolben. Kolben anbringes i kuvøsen for at tillade celler at vedhæfte. Ryst forsigtigt kolben frem og tilbage til dannelse af en ensartet cellesuspension.
- Placer kolbe i vævskultur inkubator og holdes ved 37 ° C i 5% CO 2 miljøet. Tillad celler til at klæbe O / N.
- Aspirer medier, og erstat med frisk forvarmet vækstmedier. Kolben anbringes i inkubatoren, og alleOW celler at vokse. Overvåge cellevækst dagligt ved visuel inspektion hver 2-3 dage ved hjælp af et omvendt mikroskop. Brug standard celledyrkningsteknikker passage celler efter at have nået 70-80% sammenløb.
Bemærk: eksperimentelle analyser høste cellerne ved 70% sammenløb for at sikre, at celler aktivt prolifererende. - Aspirer dyrkningsmediet og skyl med 10 ml sterilt phosphatbufret saltvand (PBS). Aspirer PBS og tilføj 0,25% trypsin / EDTA (2 til 3 ml til en 75 cm2 overfladeareal) og inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C. Visuelt bekræfte, at cellerne er fritliggende og tilføj en lige så stort volumen vækstmedium og forsigtigt pipettere cellerne op og ned til opnåelse af en enkelt cellesuspension.
Bemærk: Det er vigtigt, at vækstmediet indeholde serum som det inaktiverer trypsin. Fremstilles mindst 2 til 4 gange flere celler end det antal der kræves for en given eksperiment for at kompensere for tab af celler under efterfølgende trin - Bestemme procentdelen af levedygtige celler isuspension via trypanblåteksklusion under anvendelse af et hæmacytometer eller en automatiseret celletæller.
Bemærk: Her kun bruge cellepræparater hvor ≥ 96% af cellerne er levedygtige. - Overfør cellesuspensionen fra kolben til et 50 ml konisk rør. Pellet celler ved centrifugering i 5 minutter ved 1.100 xg ved 4 ° C.
- Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i PBS til en koncentration på 2x10 6 celler pr ml.
5. intraperitoneal injektion af celler
Bemærk: I vores eksperimenter, mus håndteres i en laminar luftstrøm eller biosikkerhed skab inden for vores barriere facilitet med henblik på at begrænse risikoen for patogen eksponering For at demonstrere denne teknik klart, procedurerne i den medfølgende video blev udført i et laboratorium, der er godkendt til dyr arbejde. Denne særlige teknik kræver ikke, at dyrene under anæstesi. Under godkendte protokoller, udføre denne Technique på levende dyr. Anvende passende stammer af mus til denne undersøgelse. For eksempel: Brug immunkompromitterede, atymiske nøgne mus for studiet af menneskets ovariecancer celle (SKOV3ip.1, og HeyA8) kolonisering; bruge immunkompetente C57BL / 6 mus til undersøgelse af mus ovariecancerceller (ID8) kolonisering.
- Belastning 500 pi den enkelt celle suspension ind i sprøjten og sætte i den sterile udjævnede 25 G nål. Dette reducerer celle klipning før injektion.
- Pick musen op ved nakkeskindet og hold halen ved hjælp af håndfladen og pegefinger og fastgør venstre bagben mellem ringen og lillefingeren (når musen tilbageholdende med venstre hånd).
Bemærk: For at undgå traumatiserende abdominale organer, begrænse musen godt, så den ikke kan bevæge sig under injektionen. - Forestil dig en linje på tværs maven lige over knæene, og find et punkt på dyrets højre side og tæt på midterlinjen. Indgangsstedet er kraniel til og lidt medialeaf sidste brystvorten.
Bemærk: Indsættelse af nålen på musens højre undgår coecum og reducerer risikoen for punktering tarmene 11. - Stik nålen ved den nedre laterale område af musenes maven til en dybde på ca. 0,5 cm. Træk tilbage i stemplet for at bekræfte, at nålen ikke er trængt et blodkar eller andre peritoneale organer.
- Hvis nogen væske opsuges kassere sprøjten (og prøve) 11. En grøn-brun eller gul aspirat indikerer nål indtrængen i tarmene eller blæren, hhv.
- Indsprøjtning af prøve ved hjælp af langsom, stabil pres. Træk kanylen og returnere musen til sit bur. Må ikke rekapitulere sprøjte inden bortskaffelse i beholder til skarpe genstande.
- Sacrifice mus via CO 2 kvælning og vital fjernelse af organer på bestemte tidspunkter efter injektion.
6. Milky spot kolonisering in vivo
- Quantitàning af kræftcelle lokalisering til matte pletter ved hjælp af flowcytometri
- Isoler peritoneale fedtdepoter fra mus (som beskrevet i trin 2.3 - 2.7) injiceret med fluorescens mærkede cancerceller og umiddelbare sted væv i iskold PBS.
- For denne særlige teknik, vægt-match alle fedt fedtvæv til omentum. Overfør væv til at adskille 5 ml rør indeholdende 1,5 ml serumfrit DMEM og 0,1% (w / v) bovint serumalbumin. Pool væv høstet fra tre uafhængige mus for at sikre et tilstrækkeligt udbytte af celler til flowcytometri.
- Hakkekød væv under anvendelse kirurgiske sakse og tilføje 1,5 ml serumfrit DMEM indeholdende 0,4% (w / v) collagenase I. inkuberes vævet suspension ved 37 ° C i 30 minutter med roterende blanding.
- Som et valgfrit trin, yderligere adskille væv ved tygning. I dette tilfælde, overføre vævet-collagenase suspensionen til en microstomacher pose, tygge i 10 minutter på lav, roterer retningenaf poserne efter 5 min.
- Filter prøver gennem et nylonnet filter (60 pm pore) til at fjerne større vragrester. Indsamle celler via centrifugering ved 250 xg i 5 minutter ved 4 ° C og smid supernatantfraktionen.
- Resuspender cellepelleten i 100 pi PBS kombineret med 900 pi ACK-lysepuffer og inkuberes ved stuetemperatur i 1 min. Centrifuger cellerne ved 250 x g i 5 minutter og Supernatanten kasseres.
- Resuspender cellepelleten i 250 pi iskold PBS. Filtrere prøver gennem en 60 um pore nylonnet for at sikre enkelt cellesuspension. Filteret skylles med 250 pi iskold PBS.
- Kvantificere antallet af fluorescerende mærkede celler i populationen ved hjælp af et flowcytometer udstyret med en 561-nm gul-grøn laser og en 585 nm / 15 nm båndpasfilter. Indstil gate for tdTomato-positive celler baseret på analyser af forældrenes celler og / eller passende negative kontroller 4.
- Kvantificering af mikroskopiske og makroskopiske metastaser
- Ved det ønskede eksperimentelle endpoint (r), isolere og straks placere væv i passende fiksering medier. Fix større prøver, såsom intakt gonadal, livmoder og mesenteriske fedtdepoter i 10% neutral bufret formalin i 48 timer ved 4 ° C. Fix mindre prøver (oment og splenoportal fedt, samt vævsækvivalenter af uterus og mesenteriske fedt) i 5% neutral bufret formalin ved 4 ° C i 2-16 timer.
- Alternativt snap fryse væv ved at placere dem i en frysemedium såsom OLT slip i en passende mængde af flydende nitrogen.
- Transfer faste væv til 70% ethanol og opbevares ved 4 ° C indtil indlejring i paraffin. Integrer og proces væv, som beskrevet i 3.2 og 3.3.
- Brug H & E farvet sektion til at evaluere væv for tilstedeværelse eller fravær af mikroskopiske metastaser (dvs. klynger af 50 celler). Bekræft than tilstedeværelsen af mikroskopiske metastaser ved en sekundær metode såsom en IHC pletten for cytokeratin 8/18 at opdage kræft i æggestokkene celler.
- Ved det ønskede eksperimentelle endpoint (r), isolere og straks placere væv i passende fiksering medier. Fix større prøver, såsom intakt gonadal, livmoder og mesenteriske fedtdepoter i 10% neutral bufret formalin i 48 timer ved 4 ° C. Fix mindre prøver (oment og splenoportal fedt, samt vævsækvivalenter af uterus og mesenteriske fedt) i 5% neutral bufret formalin ved 4 ° C i 2-16 timer.
7. Milky Spot Colonization Ex Vivo
- Etablering af grundlæggende ex vivo dyrkningsbetingelser oment orgel
- Placer hver omentum i en enkelt dyrkningsplade insert og inden en brønd af en tolv-brønds vævskulturplade indeholdende 500 pi DME / F12-medium indeholdende 20% FCS. Oprethold organkulturer ved 37 ° C i en 5% CO 2 miljøet i 24 til 48 timer og / eller yderligere tidspunkter. Brug tre uafhængige omenta (tredobbelte prøver) for hver tilstand (f.eks, medietype / tidspunkt).
- For at bekræfte integriteten af væv på de eksperimentelle endpoints, fix og behandle prøver som beskrevet i Trin 3. Counting sund versus nekrotiske adipocytter på H & E sektioner kan vurdere væv integritet. En minimum af ~ 120 celler fra5 biologiske prøver er forpligtet til at formulere en procentdel af levende væv til stede 10.
- For at måle vævsfunktion, sted omenta (n = 3) i separate brønde i en plade med 24 brønde indeholdende 500 pi DME / F12-medium med 20% FCS. Tillad omenta at konditionere mediet ved 37 ° C i en 5% CO 2 miljøet i 24 timer, og derefter fjerne 250 pi til anvendelse i et IL-6-ELISA-assay 10.
- Ex vivo samdyrkning af muse omentum med SKOV3ip.1-GFP-celler
- Vokse og forberede fluorescens mærkede celler som beskrevet i afsnit 4, og resuspender i en koncentration på 2 × 10 6 celler pr.
- Anvend ~ 6 pi vævklæbemidlet til membranen af kulturen indsatsen og lad det lufttørre. Vask membranen to gange med sterilt vand for at fjerne enhver overdreven klæbemiddel. Lufttørre membranerne under en laminar hood.
- Udskære forsigtigt omenta og fastgør den til den klæbende overtrukket membRane anvendelse af sterile pincetter. Tillad vævet til at klæbe til membranen i 1 minut før tilsætning medier. Der tilsættes 500 pi af cellesuspensionen oven på hver omentum i hver kultur insert. Fyld området omkring transwell kammer med 2,5 ml DME / F-12 10.
- Inkuber omenta med cellesuspension i 6 timer ved 37 ° C i en 5% CO 2 miljøet. Fjern forsigtigt og vask omenta med ~ 10 ml PBS. Visualisere fluorescerende cancercelle foci anvendelse af et passende fluorescerende imaging system 10.
- Isoler peritoneale fedtdepoter fra mus (som beskrevet i trin 2.3 - 2.7) injiceret med fluorescens mærkede cancerceller og umiddelbare sted væv i iskold PBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Identifikation og histologisk undersøgelse af Peritoneale fedtdepoter
Gross anatomisk dissektion muliggør identifikation af fire af de fem primære kilder til peritoneal fedt (figur 1A). Flytning uret fra øverst i midten er: omentum (OM; skitseret) placeret over maven og milt, den gonadale fedt (GF), der omgiver venstre æggestok (ov), uterin fedt (UF) fastgjort til livmoderhornene (uh) og mesenterium (MY) fastgjort til tyndtarmen (si). Æggestokken (ov), livmoderhorn (uh), og tyndtarmen (SI) er angivet som referencepunkter. Den splenoportal fedtstof (SP) omgiver milt arterie og forbinder hilum af milten til cøliaki arterie (figur 1B). Endelig er omentum fastgjort til maven og pancreas (figur 1C). Brutto struktur og relative størrelse af disse væv er vist i figur 1D. Histologisk undersøgelse af the væv viser, at splenoportal og oment fedt indeholder mælkeagtig spot [MS] strukturer på vævet periferi, omgivet af adipocytter [A]; livmoder, gonade, og mesenterisk fedt ikke (figur 1E).
Milky spot identifikation ved hjælp af Giemsa farvning
For at muliggøre sammenligning af den samlede mælkeagtig indhold spot mellem forskellige musestammer, mælkeagtig spot volumen og areal til stede i de enkelte omenta blev kvantificeret ved anvendelse af en ny metode. Som beskrevet i Methods blev en "digital hel mount" af omenta konstrueret ved farvning hver tredje del af vævet i en 5% Giemsa-opløsning og at tage billeder af de farvede væv (figur 2A). Matte pletter vises som regioner farves mørkeblå (figur 2B). Identiteten af disse regioner som matte pletter blev bekræftet i serielle sektioner med både H & E farvning og IHC for celler positive for CD45, et fælles lymfocyt markør (
Kvantitativ og kvalitativ vurdering af kræft kolonisering af omentum
En flowcytometri-baserede metode er udviklet med henblik på at kvantificere antallet af cancerceller er til stede i fedt- depoter efter intraperitoneal injektion. Denne protokol er især nyttig til at studere tidlige kolonisering trin i den metastatiske proces. For eksempel i figur 3A, ID8-tdTomato celler blev fremstillet og injiceret intraperitonealt i C57BL / 6-mus. 7 dage efter injektion (dpi), blev adipose organer høstet og dissocieret til en enkelt-cellesuspension som beskrevet i metodeafsnittet. Antallet af tdTomato ceLLS blev kvantificeret ved anvendelse af flowcytometri (figur 3A, venstre). Omentum viste en ca. 12-fold stigning i antallet af tdTomato-positive begivenheder, i forhold til PBS injiceret kontrol (figur 3A, højre), men der var ingen signifikant stigning i cellepræparater fra gonadale fedt, uterin fedt eller mesenteriet . En supplerende kvalitative IHC tilgang viste også, at 7 dage efter ip injektion af SKOV3ip.1 celler blev sammenlignelige cancercellelinier læsioner observeret i både oment og splenoportal fedt (figur 3B). IHC til human pan-cytokeratin (pan-CK) bekræfter tilstedeværelsen af kræftceller inden for de matte pletter. Specificiteten af IHC farvning blev bekræftet ved hjælp af en IgG kontrol for den pan-cytokeratin antistof (figur 3B). ID8 ovariecancer kolonisering af peritoneale fedtdepoter blev vurderet ved anvendelse C57BL / 6-mus ved 7 dpi. Store kræft celle læsioner i de mælkeagtige pletter af både omentum og splenoportal fedt er udeforet. Små klynger af kræftceller blev lejlighedsvist set i andre fedtdepoter, som illustreret i panelet indsatte. Således kan man få adgang til både det relative antal og placering af celler i en givet væv.
Ex vivo-assay til at undersøge ovariecancer kolonisering af matte pletter
For at tage fat begrænsningerne i in vivo-betingelser samtidig bevare væv sammensætning og arkitektur, optimerede vi en ex vivo-metode til at studere i æggestokkene kræftcelle kolonisering af oment væv. Hele oment væv udskåret fra mus med succes dyrkes ex vivo for at undersøge æggestokkene interaktion kræft med matte pletter. SKOV3ip.1-GFP-celler podedes på ex vivo dyrkede oment væv og holdt ved 37 ° C i en periode på 6 timer. GFP-positive fluorescerende celler var synlige i diskret foci i både ex vivo og in vivo (figur 4A). Under begge betingelser, histologisk bekræfte ved hjælp af H & E farvning bekræftede cancercelle lokalisering til matte pletter (figur 4B). Bekræftende pletten med cytokeratin pletten for kræftceller viste tilstedeværelsen af kræftcellen foci indenfor de matte pletter (figur 4C). Disse data viser muligheden for at benytte ex vivo metoder til mekanisme-baserede undersøgelser for at supplere in vivo resultater.
Figur 1. De relative placeringer og strukturer til de vigtigste peritoneale adipose depoter. (A) Gross anatomisk dissektion viser den relative placering af fire af de fem primære kilder til peritoneal fedt. Omentum (OM; skitseret), gonadal fedtstof (GF), uterin fedtstof (UF), mesenterium(MY), ovarie (OV), er livmoderhornene (UH), og tyndtarmen (SI) vist (B) Splenoportal fedtstof (SP; skitseret). Eksponeres ved at løfte milten med en pincet (C) Musen omentum vist dissekeret. fri fra bugspytkirtlen til at forbedre visualisering D:. Relative størrelser og strukturer af udskårne peritoneal fedt; mesenterium vises fastgjort til mesenterial rod. E. Histologisk evaluering af peritoneal fedt for tilstedeværelsen af matte pletter (A) adipocytter, (MS) mælkeagtig plet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Giemsa tilgang til kvantificering matte pletter i oment væv. (A); Billede af sektion af hele omentum farvet med Giemsa. Serielle sektioner af oment væv evalueret af: (B) Giemsa farvning; matte pletter er angivet med sorte pile (C) H & E farvning.; og (D) IHC under anvendelse af anti-CD45-antistof til at identificere lymfocytter inden den mælkede stedet struktur. Skalaen bar er den samme for BD og betegner 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. æggestokkene cancerceller fortrinsvis kolonisere peritoneal fedt, der indeholder matte pletter. Flowcytometrisk analyser af omentum (OM), livmoder fedt (UF), gonadal fedt (GF), og mesenterium (MY) høstes fra mus ved 7 dpi af ID8- tdTomato celler (venstre). Data er præsenteretsom fold-ændring stigning i tdTomato-postive celler i PBS-injicerede mus (til højre). Fejlsøjler indikerer standardafvigelser på middelværdien. ** Angiver p <0,01 sammenlignet med PBS-kontroller. (B) Undersøgelse af væv af både standard histologi og IHC viser sammenlignelig kolonisering af mælkeagtige pletter i både omentum og splenoportal fedt (efter injektion af 1x10 6 SKOV3ip.1 celler i nøgne mus). Snit blev evalueret af H & E farvning. Tilstedeværelsen af epitel (cancer) celler i læsionerne blev bekræftet ved IHC påvisning af cytokeratin anvendelse af en pan-cytokeratin (pan-CK) antistof. IHC hjælp et IgG isotype antistof til pan-cytokeratin blev anvendt som en kontrol for farvning specificitet. Skalaen bar er den samme for alle billeder og betegner 100 um. (C) Evaluering af ID8 æggestokkræft kolonisering af peritoneale fedtdepoter i C57BL / 6 mus ved 7 dpi. Klikher for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Ex vivo kolonisering af ovariecancerceller at omentum. Søjlerne repræsenterer en sammenligning af de tre forsøgsbetingelser viser naive omenta (venstre), omenta fra mus 6 timer efter ip injektion af 1 x 10 6 celler SKOV3ip.1 (i midten) og omenta med SKOV3ip.1-GFP koloniseret under ex vivo betingelser (til højre). Naïve omenta (Blank), omenta koloniseret af SKOV3ip.1-GFP fra in vivo-assay (vedhæftet fil i vivo) eller omenta koloniseret af SKOV3ip.1-GFP i ex vivo dyrkningsbetingelser (vedhæftet ex vivo). Fluorescens billeddannelse af hele omenta for GFP viser tilsvarende kolonisering mønster for både in vivo og ex vivo assays (A). H & E farvning af serielle sektioner afDen omenta fra panel A bekræfter tilstedeværelsen af kræftceller lokaliseret til matte pletter (B). Cytokeratin for ovariecancerceller validerer H & E farvning (C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Udvikling af behandlinger til at målrette disseminerede celler kræver en mekanistisk forståelse af metastatisk kolonisering, det kritiske første skridt i udviklingen af peritoneal sygdom. For at løse disse problemer, vi rapporterer tilgange, der kan bruges til at skelne, hvordan omentum unikke væv sammensætning og arkitektur fremmer ovariecancer metastatisk kolonisering. Særlige kendetegn ved vores tilgang er: 1) fokus på tidlige begivenheder i koloniseringen processen; 2) sammenligning af mælkeagtige spot-holdige og mangelfuld adipose depoter; 3) tilgængeligheden af en reproducerbar teknik til at kvantificere mælkeagtig spot volumen i væv; 4) tilgængeligheden af komplementær in vivo og ex vivo metoder til at evaluere æggestokkene kræftcelle kolonisering af mælkeagtige spot strukturer.
Ved udførelse af disse undersøgelser kom vi til at indse, at efterforskerne ofte er uvidende om placeringen af musen omentum og eksistensen af splenoportal fedt band, der tjener som en anden kilde til mælkeagtigt spot-holdige peritoneal fedt. Selvom de heri beskrevne teknikker gør det muligt studier af trinene i metastatisk kolonisering, de kun tilbyder "snapshots" af disse processer, og ikke vurdering af kolonisering i realtid. Hvis fulgt korrekt, bør protokollerne som beskrevet give reproducerbare resultater til en række efterforskere. Afgørende for succes af disse teknikker er: 1) Identifikation og dissekere specifikke peritoneale fedtvæv som forurening af andre vævstyper vil skævt kvantitative data fra flowcytometri; og 2) Gennemførelse passende stammer af transgene mus til pågældende undersøgelse. Det skal bemærkes, at tidsforløbet undersøgelser skal bestemmes for de enkelte cellelinjer. Empirisk da det afhænger af en række faktorer, herunder proliferation, tid til tumoroptagelse og metastatisk potentiale.
Udover at dissekere det interaKTIONER af veletablerede æggestokkene cancercellelinier og deres oment mikromiljø, der er vigtige for metastase-dannelse, kan teknikken beskrevet heri, også anvendes til at vurdere den maligne potentiale klinisk afledte cellelinier, rekapitule- tidlige molekylære ændringer i serøse æggelederne intraepithelial carcinomer i fimbriae af æggelederne 12-17. Selv om en vej for den molekylære progression af disse læsioner er ved at opstå, er in vivo-undersøgelser er nødvendige for at bestemme den biologiske betydning af specifikke ændringer. Komplementære in vivo og ex vivo assays kan anvendes til at vurdere konkrete skridt i metastatisk kolonisering af oment væv ved sådanne model forløber cellelinjer oplysninger og erfaringer fra undersøgelser kan være nøglen til generering af terapeutiske hypoteser og udformningen af yderligere prækliniske undersøgelser.
Identifikation mekanismer, der styrer metastatisk kolonisering kan muliggøre forebyggelseeller styring af metastaser formation. For eksempel kvinder, der er en øget risiko for at udvikle kræft i æggestokkene 18-22 (dvs. BRCA1 eller BRCA2 genet mutationsbærere) ofte gennemgår profylaktisk salpingo-ooforektomi at reducere risikoen for at udvikle peritoneal sygdom 23,24. Desværre patienterne ofte stadig udvikle HGSC grund af udvækst af ovariecancerceller stede i omentum og andre metastatiske steder ved operationstidspunktet. Identifikation af stoffer, der forstyrrer oment væv mikromiljø kunne forebygge kræft celle lokalisering og / eller vækst inden for omentum. Dermed kunne potentielt anvendes i kombination med terapeutiske midler, der er målrettet ovariecancerceller for at forhindre metastasedannelse eller undertrykke cancer genvækst (efter kirurgisk debulking).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | NA | |
| Geimsa | Fluka/Sigma Aldrich | 48900 | |
| 5% Formalin | Sigma | HT501320 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | Without calcium and Magnesium |
| 26 gauge needle | BD | 329652 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| Stomacher | Seward Labsystems | Stomacher 80 Biomaster | |
| Microstomacher bag | Stomacher Lab Systems | BA6040/Micro | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Millicell culture plate insert | Millipore | PICM01250 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 |
References
- Bast, R. C., Hennessy, B., Mills, G. B. The biology of ovarian cancer: new opportunities for translation. Nature Reviews Cancer. 9 (6), 415-428 (2009).
- Bowtell, D. D. L. The genesis and evolution of high-grade serous ovarian cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (11), 803-808 (2010).
- Colgan, T. J., Chang, M. C. Chapter 18 Familial Cancer and Prophylactic Surgery. Diagnostic Pathology of Ovarian Tumors. , 277-288 (2011).
- Clark, R., et al. Milky Spots Promote Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Peritoneal Adipose in Experimental Models. The American Journal of Pathology. 183 (2), 576-591 (2013).
- Platell, C., Cooper, D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C.
- Hagiwara, A., et al. Milky spots as the implantation site for malignant cells in peritoneal dissemination in mice. Cancer Research. 53 (3), 687-692 (1993).
- Gerber, S. A., et al. Preferential Attachment of Peritoneal Tumor Metastases to Omental Immune Aggregates and Possible Role of a Unique Vascular Microenvironment in Metastatic Survival and Growth. The American Journal of Pathology. 169 (5), 1739-1752 (2010).
- Liebermann-Meffert, D. The greater omentum. Anatomy, embryology, and surgical applications. The Surgical Clinics of North America. 80 (1), 275-293 (2000).
- Collins, D., Hogan, A. M., O’Shea, D., Winter, D. C. The Omentum: Anatomical, Metabolic, and Surgical Aspects. Journal of Gastrointestinal Surgery. 13 (6), 1138-1146 (2009).
- Khan, S. M., et al. In vitro metastatic colonization of human ovarian cancer cells to the omentum. Clinical, & Experimental Metastasis. 27 (3), 185-196 (2010).
- Shimizu, S. Routes of Administration. The Laboratory Mouse. Hans, H. , Academic Press. 527-542 (2004).
- Vang, R., Shih, I. -M., Kurman, R. J. Fallopian tube precursors of ovarian low- and high-grade serous neoplasms. Histopathology. 62 (1), 44-58 (2012).
- Folkins, A. K., Jarboe, E. A., Roh, M. H., Crum, C. P. Precursors to pelvic serous carcinoma and their clinical implications. Gynecologic Oncology. 113 (3), 391-396 (2009).
- Li, J., Fadare, O., Xiang, L., Kong, B., Zheng, W. Ovarian serous carcinoma: recent concepts on its origin and carcinogenesis. Journal of Hematology, & Oncology. 5 (1), 8 (2012).
- Kurman, R. J., Shih, I. -M. The origin and pathogenesis of epithelial ovarian cancer: a proposed unifying theory. The American Journal Of Surgical Pathology. 34 (3), 433-443 (2010).
- Crum, C. P., et al. The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis. Current Opinion In Obstetrics, & Gynecology. 19 (1), 3-9 (2007).
- Crum, C. P., et al. Lessons from BRCA: The Tubal Fimbria Emerges as an Origin for Pelvic Serous Cancer. Clinical Medicine, & Research. 5 (1), 35-44 (2007).
- Foulkes, W. D., Narod, S. A. Ovarian cancer risk and family history. The Lancet. 349, 878 (1997).
- Antoniou, A., et al. Average Risks of Breast and Ovarian Cancer Associated with BRCA1 or BRCA2 Mutations Detected in Case Series Unselected for Family History: A Combined Analysis of 22 Studies. The American Journal of Human Genetics. 72 (5), 1117-1130 (2003).
- King, M. -C., Marks, J. H., Mandell, J. B. New York Breast Cancer Study Group Breast and ovarian cancer risks due to inherited mutations in BRCA1 and BRCA2. Science. 302 (5645), 643-646 (2003).
- Kjær Krüger, S., Gayther, S. Ovarian cancer and genetic susceptibility in relation to the BRCA1 and BRCA2 genes. Occurrence, clinical importance and intervention. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 85 (1), 93-105 (2006).
- Easton, D. F., Ford, D., Bishop, D. T. Breast and ovarian cancer incidence in BRCA1-mutation carriers. Breast Cancer Linkage Consortium. American Journal of Human Genetics. 56 (1), 265-271 (1995).
- Rebbeck, T. R., et al. Prophylactic Oophorectomy in Carriers of BRCA1or BRCA2Mutations. New England Journal of Medicine. 346 (21), 1616-1622 (2002).
- Olivier, R. I., et al. Clinical outcome of prophylactic oophorectomy in BRCA1/BRCA2 mutation carriers and events during follow-up. British Journal Of Cancer. 90 (8), 1492-1497 (2004).
