Abstract
Hochwertige seröse Ovarialkarzinom (HGSC), die Ursache der weit verbreiteten Peritonealmetastasen, weiterhin eine extrem schlechte Prognose haben; weniger als 30% der Frauen am Leben sind 5 Jahre nach der Diagnose. Das Netz ist ein bevorzugter Ort der HGSC Metastasenbildung. Trotz der klinischen Bedeutung dieser Mikroumgebung, bleibt der Beitrag der omentalis Fettgewebe an Eierstockkrebs Progression under. Omentalis Fettgewebe ist ungewöhnlich, dass es als milchige Flecken, die aus B, T enthalten sind, und NK-Zellen, Makrophagen und Vorläuferzellen umgebende dichte Nester von Gefäß bekannten Strukturen enthält. Milchige Flecken spielen eine Schlüsselrolle in den physiologischen Funktionen des Netzes, die für die Peritonealdialyse Homöostase erforderlich sind. Wir haben gezeigt, dass milchige Flecken auch Eierstockkrebs metastasierendem Kolonisierung der Bauchfett, einen wichtigen Schritt in der Entwicklung der Peritonealmetastasen zu fördern. Die Ansätze, die wir entwickelt, um zu bewerten und zu quantifizieren, milchige Flecken in je Hier beschreiben wiritoneal Fett- und studieren ihre funktionellen Beitrag zur Eierstockkrebszell metastasierendem Kolonisierung omentalis Geweben in vivo und ex vivo. Diese Ansätze sind verallgemeinerbar zu zusätzlichen Mausmodellen und Zelllinien, so dass die Studie von Eierstockkrebs Metastasenbildung von der anfänglichen Lokalisierung von Zellen bis milchig Punktstrukturen für die Entwicklung der weit verbreiteten Peritonealmetastasen.
Introduction
Anders als die meisten soliden Tumoren, Metastasen sind aus hochwertigem seröse Ovarialkarzinom (HGSC) in die Bauchhöhle 1 beschränkt. So könnte wirksame Peritonealdialyse Therapien potenziell Bekämpfung oder Tilgung HGSC. Derzeit ist ein Standard-Therapieansatz chirurgische Zytoreduktion in Kombination mit Chemotherapie 1-3. Leider ist die überwiegende Mehrheit der Patienten und erliegen Komplikationen der Krankheit Wiederholung. Diese düsteren Statistiken zeigen die Notwendigkeit für ein besseres Verständnis von metastasierendem Kolonisierung, durch den der Prozess Krebszellen zu lokalisieren, um, zu nutzen, und vermehren sich im Wirtsgewebe Metastasen 2 zu bilden.
Das Netz ist ein bevorzugter Ort der frühen Metastasierung HGSC 4-7. Im Gegensatz zu anderen Bauch Fettgewebe enthält omentalis Fettgewebe ungewöhnlich wie milchige Flecken, die B, T und NK-Zellen und Makrophagen enthalten, die eine Schlüsselrolle in Bauch HomeOS spielen bekannten ImmunstrukturenTASIS 8,9. Zusätzlich zu ihren physiologischen Funktionen haben wir festgestellt, dass milchige Flecken, eine aktive Rolle bei Eierstockkrebs metastasierendem Kolonisierung 4 zu spielen. In experimentellen Metastasierung Assays SKOV3ip.1, Caov3 und HeyA8 (human) und ID8 (murine; C57BL / 6) Eierstockkrebszellen schnell Heimat milchige Flecken, was darauf hindeutet, daß die Zellen in Richtung auf ein sezerniertes chemotaktischen Faktor bewegt. Interessanterweise haben die Krebszellen nicht kolonisieren Bauch Fettgewebe fehlt milchige Flecken (dh Gonaden und Gebärmutter Fett) 4.
Um Regulierungsmechanismen milchig Stelle Kolonisations zu identifizieren, haben wir Xenograft-Modellen, die die Vernehmung von zellulären und molekularen Ereignisse über den Zeitverlauf von metastasierendem Kolonisierung 4 ermöglichen optimiert. Ein besonderer Vorteil der hier beschriebenen Vorgehensweisen ist die Betonung der Gewebearchitektur und Funktion, der Benutzer zum Testen von Hypothesen in voll in vivo integriert und ex vivo Modellen von m ermöglichtetastatic Kolonisierung 4,10. Durch den Vergleich von Krebszellen Lokalisierung und Wachstum in Bauchfettdepots, die entweder enthalten oder fehlen milchige Flecken, können die Ermittler den relativen Beitrag (n) der Fettzellen und Zellen innerhalb milchige Flecken an den Unterkünften und progressive Wachstum von Eierstockkrebszellen in physiologisch relevanten Geweben zu testen.
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Protocol
Alle Mäuse wurden untergebracht, gepflegt und eingeschläfert nach Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Richtlinien und unter der Leitung von der University of Chicago Tier Resource Center.
1. Vorbereitung für Versuche Studies
- Damit die Tiere auf neue Gehäuse und Umgebung zu akklimatisieren, um möglichen physiologischen Auswirkungen von Transport und Handhabung zu erholen.
Anmerkung: Die folgenden Verfahren ist anwendbar auf alle kommerziell erhältlichen Stämme von Mäusen. Die Anzahl von Tieren, die in einem Experiment verwendet wird, hängt von der Studiendesign und sollte mit Beratung von einem statistician erfolgen.
2. Identifizierung und Isolierung von Peritoneal Fettdepots.
- Euthanize Tieren über CO 2 Überdosierung und einer sekundären physikalischen Verfahren zum Tode zu bestätigen.
- Als Erntebauchfettdepots eine inländische Organentnahme (sekundäre Methode), make ein Mittellinienschnitt in der Nähe des Leisten Papillen durch die Bauchwand, um die inneren Organe (Abbildung 1A) aussetzen.
- Für die Netzadhäsionen Fat (OM), setzen die omentalis / Pankreas-Komplex durch die Erweiterung der Milz aus der Bauchhöhle mit einer Pinzette (Abbildung 1c). Lassen Netz aus der Bauchspeicheldrüse und Milz durch alle Gewebeverbindungen eng Trimmen. Stellen Sie sicher, dass alle verbleibenden Pankreasgewebe wird ausgeschnitten 4.
- Für die Keimdrüsen Fat (GF), verwenden Sie Pinzette, um die Gonaden Fett rund um die Eierstöcke und die Verbrauch durch Schneiden von Gewebe-Verbindungen (1A oberen righ t) 4 zu heben.
- Für die Uterus Fat (UF), verwenden Sie Pinzette, um die Gebärmutter Fett rund um die Gebärmutterhörner und Verbrauch durch Schneiden von Gewebe-Verbindungen heben (Abbildung 1A unten rechts) 4.
- Für die mesenterialen Fettgewebe (MF), schneiden Sie den Übergang zwischen dem Dünndarm und dem Pylorus. Verwenden einer Pinzette fest zu ergreifen das freie Endeder Dünndarm, und langsam "peel" es von der mesenterialen Fett. Lassen Sie die mesenterialen Fett aus dem Mesenterialwurzel Verwendung Präparierscheren (1A unten links) 4.
- Für die Splenoportal Fat (SF), heben Sie das distale Ende der Milz mit einer Pinzette, um die dünne Fettgewebeband Anschluss des Milzhilus der Bauchspeicheldrüse freizulegen. Auszuschneiden die splenoportal Fett durch zuerst Lösen aus der Bauchspeicheldrüse, und dann sorgfältig seziert es aus der Milz (1B) 4.
3. Milch Spot-Identification Mit Giemsa
- Verbrauch Omenta (siehe Schritt 2.3) von C57BL / 6 Mäusen und fixieren in 5% neutral gepuffertem Formalin bei 4 ° C für 16 Stunden (O / N).
- Für Paraffin Einbetten des festen Gewebes, wählen Sie eine Form, die für die Größe des Gewebes geeignet ist. Gießen geschmolzenes Paraffin aus dem Paraffinvorratsbehälter, um die Form zu füllen. Öffnen Sie die Kassette und mit warmSteinpilzen, übertragen das Gewebe in die Form.
- Sorgfältig orientieren das Gewebe während der Paraffineinbettung zu Längsschnitten zu erzeugen. Setzen Sie die markierten Gewebekassette über das Formteil und drücken Sie fest an seinem Platz. Erlaube der Gießform für mindestens 30 min abkühlen.
- Schneiden Sie Serienschnitte (4 & mgr; m dick) aus der Formalin-fixierten Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebeblock. Legen Sie eine vorgereinigte Objektträger unter den Abschnitten, wie das Band von Gewebe löst sich der Paraffinblock.
- Seriell Abschnitt das ganze Netz; zu sammeln und zu färben jeden dritten Abschnitt Giemsa-Färbung (siehe 3.6). Lassen Sie die Objektträger mit den Abschnitten an der Luft trocknen, vorzugsweise O / N bei RT. Getrocknete Folien sind bereit für die Fixierung. Beflecken den ersten Abschnitt für die Hämatoxylin und Eosin für Vergleiche mit Giemsa gefärbten Objektträger.
- Entparaffinieren Rutschen durch zwei aufeinanderfolgende 5 min Inkubation in Xylol. Rehydrieren gleitet durch zwei aufeinanderfolgende Inkubationen in folgendem: 100% Ethanol, 95% Ethanol, und schließlich tippen water.
- Treffen Sie geeignete Vorsichtsmaßnahmen, um die Folien vor dem Austrocknen zu vermeiden. Führen Sie alle Schritte bei RT.
- Vollständig einzutauchen, die Folien in einer Coplin-Gefäß, das 5% Giemsa-Lösung (w / v in Leitungswasser) und Inkubation für 4 min bei RT. Spülen Sie gleitet in Leitungswasser für 60 Sekunden, an der Luft trocknen und eindecken mit Deckglas mit Montage Medien.
- Bild der gefärbten Objektträger unter Verwendung eines Whole Slide Scanner und Prozess mit Herstellersoftware. Quantifizierung der milchigen Ort Volumen in den Giemsa-gefärbten omentalis Abschnitte mit ImageJ Software 4.
4. Vermehrung und Herstellung von Eierstockkrebszellen für in vivo und ex vivo-Studien
- Vorwärmen 15 ml Zellwachstumsmedium auf 37 ° C in einem Wärmebad. Einem passenden Gewebekulturflasche (zB 75 cm 2 Fläche) Bereiten Sie durch Markierung mit Namen der Zelllinie, Durchgang Nummer, Datum und Person, die die gefrorenen Lager vorbereitet, und das Datumund Person, die das Auftauen / Ausplattieren der Zellen.
Hinweis: In Studien der Metastasierung solcher Informationen ist entscheidend, da das Datum der Gefriert nach unten und Passage-Nummer können die metastatischen Phänotyp beeinflussen. - Unter Verwendung der sterilen Umgebung der biologischen Schutzhaube, Pipette 10 ml Medium in die T-75-Kulturflasche. Entfernen Sie ein Fläschchen mit Zellen aus dem flüssigen Stickstoff Systems und überprüfen Sie das Etikett, um den Zelltyp zu bestätigen. Tauen nur eine Ampulle von Zellen zu einem Zeitpunkt durch Erwärmen in 37 ° C Wärmebad.
- Unter Einhaltung steriler Techniken Pipetten 1x10 6 aufgetauten Zellen in die Kulturflasche. Der Kolben wird in den Inkubator, damit Zellen zu befestigen. Der Kolben schaukeln hin und her, um eine einheitliche Zellsuspension zu bilden.
- Danach wird der Kolben in Gewebekultur-Inkubator und zu halten, bei 37 ° C in 5% CO 2 Umgebung. Erlauben Zellen O / N entsprechen.
- Absaugen Medien, und ersetzen Sie mit frischem vorgewärmten Wachstumsmedien. Der Kolben wird in den Inkubator und alleow Zellen wachsen. Überwachung des Zellwachstums täglich durch visuelle Inspektion alle 2-3 Tage unter Verwendung eines Umkehrmikroskops. Verwenden Sie Standard-Zellkulturtechniken, um Durchgang-Zellen bei Erreichen 70-80% Zusammenfluss.
Hinweis: Für die experimentellen Untersuchungen Ernte der Zellen bei 70% Konfluenz, um sicherzustellen, dass die Zellen aktiv vermehren. - Absaugen Kulturmedium und spüle mit 10 ml steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Absaugen PBS und fügen Sie 0,25% Trypsin / EDTA (2 bis 3 ml für eine 75 cm 2 Oberfläche) und inkubieren Sie 5 Minuten bei 37 ºC. Visuell zu bestätigen, dass die Zellen abgelöst und dasselbe Volumen des Wachstumsmediums, und sanft Pipette Zellen nach oben und unten, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
Anmerkung: Es ist wichtig, dass das Wachstumsmedium Serum enthält, wie es inaktiviert Trypsin. Werden mindestens 2 bis 4-fach mehr Zellen als die Zahl für ein gegebenes Experiment erforderlich, um den Verlust an Zellen während der nachfolgenden Schritte zu kompensieren - Den Prozentsatz der lebensfähigen Zellen in derSuspension über Trypanblau-Ausschluss-Assay unter Verwendung eines Hämacytometers oder eine automatische Zellzähler.
Hinweis: Hier werden nur verwenden Zellpräparate, in denen ≥ 96% der Zellen lebensfähig sind. - Übertragen der Zellsuspension aus dem Kolben in ein 50 ml konischen Röhrchen. Pellet-Zellen durch Zentrifugieren 5 Minuten bei 1100 × g bei 4 ° C.
- Saugt den Überstand und Zellpellet in PBS auf eine Konzentration von 2x10 6 Zellen pro ml.
5. Intraperitoneale Injektion von Zellen
Hinweis: In unseren Experimenten werden die Mäuse in einem laminaren Luftstrom oder Biosicherheitswerkbank innerhalb unseres Sperreinrichtung, um das Risiko der Krankheitserreger Exposition zu begrenzen, um diese Technik zu zeigen deutlich, behandelt, die Verfahren in der dazugehörige Video wurden in einem Laboratorium zugelassen durchgeführt Tier Arbeit. Diese besondere Technik nicht die Tiere benötigen, um unter Narkose ist. Unter genehmigten Protokollen, führen Sie diese technique an lebenden Tieren. Verwenden Sie geeignete Stämme von Mäusen für diese Studie. Zum Beispiel: verwenden immungeschwächten, athymischen Nacktmäusen für das Studium der menschlichen Eierstockkrebszell (SKOV3ip.1 und HeyA8) Kolonisierung; Verwenden immun C57BL / 6 Mäusen Untersuchung der Mauseierstockkrebszellen (ID8) Kolonisation.
- Last 500 ul der Einzelzellsuspension in die Spritze und in den steriles verschlossenes 25 G Nadel gesetzt. Dies reduziert Zell Abscheren vor der Injektion.
- Wählen Sie die Maus nach oben durch das Genick des Halses und halten Sie das Endstück mit der Handfläche und Zeigefinger und befestigen Sie den linken Hinterbein zwischen dem Ring und kleinen Finger (wenn die Maus mit der linken Hand zurückgehalten).
Hinweis: Um traumatisierende Bauchorgane zu vermeiden, die Maus auch zurückhalten, so dass es nicht während der Injektion zu bewegen. - Stellen Sie sich eine Linie quer Bauch knapp über den Knien, und suchen Sie einen Punkt auf der rechten Seite des Tieres und in der Nähe der Mittellinie. Der Eintrittspunkt ist kranial und leicht medialder letzten Brustwarze.
Hinweis: Einsetzen der Nadel auf der Maus über die rechte Seite vermeidet den Blinddarm und reduziert das Risiko der Punktion der Darm 11. - Führen Sie die Nadel am unteren Seitenbereich der Mäuse Leib bis zu einer Tiefe von etwa 0,5 cm. Ziehen Sie am Kolben, um zu bestätigen, dass die Nadel nicht in ein Blutgefäß oder andere Bauchorgane eingedrungen.
- Ist eine Flüssigkeit abgesaugt entsorgen Sie die Spritze (und Probe) 11. Ein grünlich-braun oder gelb absaugen zeigt Nadelpenetration in den Darm oder die Blase auf.
- Injizieren Sie die Probe unter Verwendung von langsamen, stetigen Druck. Ziehen Sie die Nadel und kehren Sie die Maus auf seinem Käfig. Spritzen rekapitulieren Sie nicht vor der Entsorgung im Behälter für spitze Gegenstände.
- Sacrifice Mäusen über CO 2 Ersticken und lebenswichtigen Organentnahme zu bestimmten Zeitpunkten nach der Injektion.
6. Milch Stelle Kolonisations In-vivo-
- Quantitation von Krebszellortung, um milchige Flecken mit Hilfe der Durchflusszytometrie
- Isolieren Bauchfettdepots von Mäusen, die (wie in Schritt 2.3 - 2.7) injiziert mit fluoreszenzmarkierten Krebszellen und sofortige Ort Gewebe in eiskaltem PBS.
- Für diese spezielle Technik, Gewicht-match all Fettgewebe Fettgewebe zu Netz. Übertragungsgewebe zu 5 ml-Röhrchen mit 1,5 ml serumfreiem DMEM und 0,1% (w / v) Rinderserumalbumin zu trennen. Aus drei unabhängigen Mäusen geerntet Pool Geweben, um eine ausreichende Ausbeute an Zellen für die Flusszytometrie gewährleisten.
- Mince Gewebe mittels chirurgischer Scheren und 1,5 ml serumfreiem DMEM, das 0,4% (w / v) Kollagenase I. Die Gewebesuspension Inkubieren bei 37 ° C für 30 min mit einer Drehmisch.
- Als optionalen Schritt, weitere distanzieren Gewebe durch Kauen. In diesem Fall übertragen die gewebe Kollagenase Suspension auf eine microstomacher Beutel, kauen für 10 Minuten bei schwacher, Drehen der Orientierungder Beutel nach 5 min.
- Filterproben durch eine Nylon-Mesh-Filter (60 & mgr; m Poren), um größere Ablagerungen zu entfernen. Sammeln Zellen durch Zentrifugation bei 250 × g für 5 min bei 4 ° C und der Überstand verworfen Fraktion.
- Zellpellet in 100 ul PBS in Kombination mit 900 ul ACK-Lysepuffer und Inkubation bei Raumtemperatur für 1 min. Zentrifuge Zellen bei 250 g für 5 min und Überstand verwerfen.
- Zellpellet in 250 ul eiskaltem PBS. Filtern Sie die Proben durch ein 60 & mgr; m Poren Nylon-Mesh auf Einzelzellsuspension zu gewährleisten. Spülen Sie den Filter mit 250 ul eiskaltem PBS.
- Quantifizieren der Anzahl von fluoreszierend markierten Zellen in der Population mit einem Durchflusszytometer mit einem 561-nm gelb-grünen Laser ausgerüstet und 585 nm / 15 nm Bandpassfilter. Eingestellt das Tor für tdTomato positiven Zellen basierend auf der Analyse der elterlichen Zellen und / oder entsprechenden Negativkontrollen 4.
- Quantifizierung von mikroskopischen und makroskopischen Metastasen
- Bei dem gewünschten experimentellen Endpunkt (en), isolieren und sofort setzen Gewebe in der geeigneten Fixierungsmedien. Fix größeren Proben, wie intakt Gonaden, Uterus und mesenterischen Fettdepots in 10% neutral gepuffertem Formalin für 48 Stunden bei 4 ° C. Fix kleinere Proben (omentalis und splenoportal Fett sowie Gewebeäquivalenten von Gebärmutter und mesenterialen Fett) in 5% neutral gepuffertem Formalin bei 4 ° C für 2 bis 16 h.
- Alternativ Schnapp einfrieren Gewebe, indem sie in einem Gefriermedium wie Oktober und fallen in eine entsprechende Menge an flüssigem Stickstoff.
- Transfer fixierten Geweben um 70% Ethanol und bei 4 ° C bis zur Einbettung in Paraffin. Einbetten und Prozessgewebe wie in 3.2 und 3.3 beschrieben.
- Verwenden die H & E gefärbten Abschnitt, um Gewebe auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von mikroskopischen Metastasen auszuwerten (dh Cluster von 50 Zellen). Bestätigen ter Anwesenheit mikroskopischen Metastasen durch eine sekundäre Verfahren, wie ein IHC Färbung für Cytokeratin 8/18 auf Eierstockkrebszellen zu erkennen.
- Bei dem gewünschten experimentellen Endpunkt (en), isolieren und sofort setzen Gewebe in der geeigneten Fixierungsmedien. Fix größeren Proben, wie intakt Gonaden, Uterus und mesenterischen Fettdepots in 10% neutral gepuffertem Formalin für 48 Stunden bei 4 ° C. Fix kleinere Proben (omentalis und splenoportal Fett sowie Gewebeäquivalenten von Gebärmutter und mesenterialen Fett) in 5% neutral gepuffertem Formalin bei 4 ° C für 2 bis 16 h.
7. Milch Stelle Kolonisations Ex Vivo
- Einrichtung von Grund ex vivo omentalis Organkulturbedingungen
- Legen Sie jedes Netz in einem einzigen Kulturplatte Einsatz und innerhalb einer Vertiefung einer Zwölf-Gewebekulturplatte, die 500 & mgr; l DME / F12-Medium, das 20% FCS. Aufrechtzuerhalten Organkulturen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Umgebung für 24 bis 48 h und / oder zusätzliche Zeitpunkten. Verwenden Sie drei unabhängige Omenta (Dreifachproben) für jede Bedingung (zB Medientyp / Zeitpunkt).
- Um die Integrität der Gewebe an den experimentellen Endpunkten zu bestätigen, zu fixieren und Prozessproben, wie in Schritt 3 beschrieben Zählen gesunde gegen nekrotischen Adipozyten auf H & E Schnitte Gewebeintegrität zu bewerten. Ein Minimum von ~ 120 Zellen aus5 biologischen Proben erforderlich ist, um einen Prozentsatz von lebendem Gewebe vorhanden 10 zu formulieren.
- Um Gewebefunktion, Ort Omenta (n = 3) in getrennten Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen, die 500 & mgr; l DME / F12-Medium mit 20% FCS zu messen. Erlauben Omenta, die Medien bei 37 ° C in einem 5% CO 2-Umgebung 24 Stunden lang zu konditionieren und dann zu entfernen 250 ul zur Verwendung in einer IL-6 ELISA-Test 10.
- Ex-vivo-Co-Kultur des Maus-Netz mit SKOV3ip.1-GFP-Zellen
- Wachsen und bereiten fluoreszierend markierten Zellen, wie in Kapitel 4 und resuspendieren in einer Konzentration von 2 × 10 6 Zellen pro ml beschrieben.
- Gelten ~ 6 & mgr; l des Gewebeklebers auf die Membran des Kultureinsatzes und lassen es an der Luft trocknen. Zweimaliges Waschen der Membran mit sterilem Wasser, um eine übermäßige Kleber zu entfernen. Luft trocknen die Membranen unter einem laminaren Haube.
- Vorsichtig herauszuschneiden die Omenta und befestigen es an der klebstoffbeschichteten membrane mit einer sterilen Pinzette. Damit das Gewebe an die Membran für 1 Minute vor der Zugabe von Medium zu haften. Fügen Sie 500 ul der Zellsuspension auf der jeweils Netzes in jedem Kultureinsatzes. Füllen Sie den Bereich um den Transwell-Kammer mit 2,5 ml DME / F-12 10.
- Inkubieren Omenta mit Zellsuspension für 6 h bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Umgebung. Entfernen Sie vorsichtig und waschen Sie die Omenta mit ~ 10 ml PBS. Visualisieren Fluoreszenzkrebszellherde mit einem geeigneten Fluoreszenzbildgebungssystem 10.
- Isolieren Bauchfettdepots von Mäusen, die (wie in Schritt 2.3 - 2.7) injiziert mit fluoreszenzmarkierten Krebszellen und sofortige Ort Gewebe in eiskaltem PBS.
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Representative Results
Identifizierung und histologische Untersuchung von Peritoneal Fettdepots
Grobe anatomische Präparation ermöglicht die Identifizierung von vier der fünf primären Quellen von peritonealen Fett (1A). Im Uhrzeigersinn von oben in der Mitte sind: das Netz (OM; beschrieben) liegt über dem Magen und Milz, die Gonaden Fett (GF), die den linken Eierstock (OV), die uterine Fett (UF) auf die Uterushörner angebracht (uh) und das Mesenterium (MY) an den Dünndarm (si) befestigt ist. Der Eierstock (OV), Uterushorn (uh) und Dünndarm (si) werden als Bezugspunkte angezeigt. Die splenoportal Fett (SP) umgibt die A. lienalis und verbindet den Hilus der Milz auf die Zöliakie Arterie (1B). Schließlich wird das Netz in den Magen und Pankreas (1C) befestigt ist. Die Brutto-Struktur und die relative Größe dieser Gewebe ist in 1D gezeigt. Die histologische Untersuchung von the Geweben zeigt, dass splenoportal und omentalis Fett enthalten milchig spot [MS] Strukturen an der Geweberand, von Adipozyten [A], umgeben; Gebärmutter-, Gonaden und mesenterialen Fett nicht (1E).
Milky Spot Identifikation mittels Giemsa
Um den Vergleich der Gesamtmilchfleck Inhalte zwischen verschiedenen Mausstämmen, milchig Spot Volumen und in einzelnen Omenta vorliegenden Bereich zu ermöglichen wurde mit Hilfe eines neuartigen Verfahrens quantifiziert. Wie in Methoden beschrieben ist, wurde eine "digitale whole mount" der Omenta durch Anfärben jedes dritte Abschnitt von Gewebe in einem 5% Giemsa-Lösung und die Aufnahme von Bildern der gefärbten Gewebe (2A) ausgebildet ist. Milchige Flecken erscheinen als Bereiche Färbung dunkelblau (2B). Die Identität dieser Regionen als milchige Flecken wurde Serienschnitte durch sowohl H & E-Färbung und IHC für Zellen positiv für CD45, einem gemeinsamen Lymphozytenmarker (bestätigte
Quantitative und qualitative Bewertung der Krebs Kolonisierung des Netzes
Eine Durchflußzytometrie-basierende Methode, um die Anzahl der Krebs in adipose Depots nach intraperitonealer Injektion vorhandenen Zellen zu quantifizieren entwickelt. Dieses Protokoll ist besonders nützlich, um frühe Besiedlung Schritte der metastatischen Prozesses zu studieren. Zum Beispiel in 3A ID8-tdTomato Zellen wurden hergestellt und intraperitoneal in C57BL / 6-Mäusen injiziert. 7 Tage nach der Injektion (dpi) wurden die Fett Organe beraubt und dissoziiert in eine Einzelzellsuspension wie in den Methoden beschrieben. Die Anzahl der tdTomato cells wurde mittels Durchflusszytometrie quantifiziert (3A, links). Omentum zeigte eine etwa 12-fache Erhöhung der Anzahl der tdTomato-positive Ereignisse, bezogen auf PBS-injizierten Kontrollen (3A, rechts), aber es gab keinen signifikanten Anstieg der Zellpräparationen von den gonadalen Fettkörper, Gebärmutter Fett oder Mesenterium . Eine komplementäre qualitative IHC-basierten Ansatz zeigte auch, dass 7 Tage nach der ip-Injektion von SKOV3ip.1 Zellen vergleichbar Krebszellläsionen wurden sowohl omental und splenoportal Fett (3B) beobachtet. IHC Menschen pan-Zytokeratin (pan-CK) bestätigt das Vorhandensein von Krebszellen innerhalb der milchige Flecken. Die Spezifität der IHC-Färbung wurde unter Verwendung eines IgG-Kontrolle für den pan-Zytokeratin-Antikörper (3B) bestätigt. ID8 Ovarialkarzinom Kolonisierung peritonealen Fettdepots wurde mit C57BL / 6-Mäuse 7 dpi ausgewertet. Große Krebszelle Läsionen in den milchige Flecken von sowohl dem Netz und splenoportal Fett sind outausgekleidet. Kleine Gruppen von Krebszellen wurden gelegentlich in anderen Fettdepots zu sehen ist, wie in der Tafel Einschub dargestellt. So kann man sowohl der relativen Anzahl und Lage der Zellen in einem gegebenen Gewebe zuzugreifen.
Ex-vivo-Test für Eierstockkrebs Kolonisierung milchige Flecken studieren
Um die Grenzen der in vivo-Bedingungen anzugehen und gleichzeitig Gewebezusammensetzung und Architektur, optimierten wir eine ex vivo Ansatz für Eierstockkrebszell Kolonisierung omentalis Geweben zu untersuchen. Whole omentalis Gewebe von Mäusen herausgeschnitten sind erfolgreich kultiviert ex vivo, um Eierstockkrebs Interaktion mit milchige Flecken zu studieren. SKOV3ip.1-GFP-Zellen wurden auf die ex vivo kultiviert omental Geweben impft und bei 37 ° C für einen Zeitraum von 6 h gehalten. GFP-positive fluoreszierende Zellen in diskreten Foci sichtbar sowohl ex vivo und in vivo (4A). Unter beiden Bedingungen, histologische Sicherung mit H & E-Färbung bestätigt Krebszelle Lokalisierung milchige Flecken (4B). Zweit Fleck mit Zytokeratin-Färbung für Krebszellen zeigte die Anwesenheit von Krebszellherde innerhalb der milchige Flecken (4C). Diese Daten zeigen die Machbarkeit der Verwendung von ex vivo Ansätze zur Mechanismus-basierte Studien in vivo Befunde ergänzen.
Abbildung 1. Die relativen Standorte und Strukturen der Hauptbauchfettdepots. (A) Brutto anatomischen Präparation, die die relative Lage von vier der fünf primären Quellen von peritonealen Fett. Das Netz (OM; beschrieben), Gonaden-Fett (GF), Gebärmutter-Fett (UF), Mesenterium(MY), der Eierstöcke (OV), Gebärmutterhörner (uh) und Dünndarm (si) angezeigt (B) Splenoportal Fett (SP; beschrieben). Durch Anheben der Milz mit einer Pinzette ausgesetzt (C) Die gezeigten Maus omentum seziert. frei von der Bauchspeicheldrüse, um die Visualisierung zu verbessern. D: Relative Größe und Struktur der herausgeschnittenen Bauchfett; das Mesenterium mit dem Mesenterialwurzel befestigt gezeigt. E. Die histologische Auswertung von Bauchfett auf das Vorhandensein von milchige Flecken (A) Adipozyten (MS) milchig Ort. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Giemsa-basierten Ansatz für die Quantifizierung milchige Flecken in omentalis Gewebe. (EIN); Bild von Abschnitt gesamten Netzes mit Giemsa gefärbt. Serienschnitte von omentalis Gewebe ausgewertet: (B) Giemsa-Färbung; milchige Flecken sind mit schwarzen Pfeilen angegeben (C) H & E-Färbung. und (D) der IHC mit anti-CD45-Antikörper an Lymphozyten innerhalb der Milchpunktstruktur identifizieren. Der Maßstab ist das gleiche für BD und bezeichnet 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Eierstockkrebszellen bevorzugt kolonisieren Bauchfett, milchige Flecken enthält. Durchflusszytometrische Analysen des Netzes (OM), Gebärmutter-Fett (UF), Gonaden-Fett (GF) und Gekröse (MY) von Mäusen geerntet bei 7 dpi von ID8- tdTomato Zellen (links). Daten werden dargestelltals fold change Anstieg von tdTomato-postive Zellen über PBS-injizierten Mäusen (rechts). Fehlerbalken zeigen Standardfehler des Mittelwerts. ** Bezeichnet p <0,01 im Vergleich zu PBS-Kontrollen. (B) Die Untersuchung von Geweben sowohl Standard-Histologie und IHC zeigt vergleichbare Kolonisierung milchige Flecken sowohl in Netz und splenoportal Fett (nach der Injektion von 1x10 6 SKOV3ip.1 Zellen in Nacktmäuse). Die Schnitte wurden von H & E-Färbung ausgewertet. Das Vorhandensein von epithelialen (Krebs-) Zellen in den Läsionen wurde von IHC Nachweis von Zytokeratin mit einem pan-Zytokeratin (pan-CK) Antikörpers bestätigt. IHC mit einem IgG-Isotyp-Antikörper für den pan-Zytokeratin wurde als Kontrolle für die Spezifität der Färbung verwendet. Der Maßstab ist das gleiche für alle Bilder und bezeichnet 100 um. (C) Bewertung der ID8 Ovarialkarzinom Kolonisierung der Bauchfettdepots in C57BL / 6 Mäusen bei 7 dpi. Bitte klickenSie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Ex vivo Besiedelung der Eierstockkrebszellen zum Netz. Die Spalten stellen einen Vergleich der drei experimentellen Bedingungen, die naiv Omenta (links), Omenta von Mäusen, 6 h nach ip-Injektion von 1 × 10 6 Zellen SKOV3ip.1 (Mitte) und Omenta mit SKOV3ip.1-GFP unter Ex-vivo-Bedingungen (rechts) besiedelt. Naive Omenta (Blank), Omenta durch SKOV3ip.1-GFP aus in vivo-Assay (Befestigung in vivo) oder Omenta durch SKOV3ip.1-GFP in Ex-vivo-Kulturbedingungen kolonisiert (Anhang ex vivo) besiedelt. Fluoreszenz-Bildgebung des gesamten Omenta für GFP zeigt ähnliche Kolonisierung Muster für in vivo und ex vivo-Assays (A). H & E-Färbung von Serienschnitten vondie Omenta von Feld A bestätigt die Anwesenheit von Krebszellen auf die milchige Flecken (B) lokalisiert. Cytokeratin für Eierstockkrebszellen bestätigt die H & E Färbung (C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Entwicklung von Therapien zu verbreiteZielZellen erfordert ein mechanistisches Verständnis von metastasierendem Kolonisierung, die kritische erste Schritt in der Entwicklung der Peritonealdialyse Krankheit. Um diese Probleme haben wir Ansätze, die verwendet werden können, zu erkennen, wie einzigartig das Netz der Gewebezusammensetzung und Architektur zu fördern Eierstockkrebs metastasierendem Kolonisierung berichten anzugehen. Unterscheidungsmerkmale unseres Ansatzes sind: 1) der Schwerpunkt auf frühe Ereignisse in der Kolonisierung; 2) Vergleich der milchigen Ort haltigen und mangelhafte Fettdepots; 3) Verfügbarkeit eines reproduzierbare Technik bis milchig Punktvolumen in Geweben zu quantifizieren; 4) die Verfügbarkeit komplementärer in vivo und ex vivo Ansätze für Eierstockkrebs Zellbesiedlung der milchigen Ort Strukturen zu bewerten.
Bei der Durchführung dieser Untersuchungen kamen wir zu erkennen, dass die Ermittler häufig sind sich der Position der Maus Netz und die Existenz des splenoportal Fettband, die als eine zweite Quelle der milchigen Ort haltigen Bauchfett dient. Obwohl die hier beschriebenen Techniken ermöglichen Studien von Schritten in metastatischen Kolonisierung, bieten sie nur "Schnappschüsse" von diesen Verfahren und der Bewertung des von Kolonisierung in Echtzeit. Wenn angemessen gefolgt, sollten die Protokolle, wie beschrieben, reproduzierbare Ergebnisse zu einer Reihe von Forschern ergeben. Entscheidend für den Erfolg dieser Techniken sind: 1) Identifizierung und Sezieren spezifische Bauch Fettgewebe als Verunreinigung durch andere Gewebetypen aus Durchflusszytometrie erhaltenen quantitativen Daten verzerren; und 2) Durchführung geeigneter Stämme von transgenen Mäusen für die Studie in Frage. Es sei darauf hingewiesen, dass die Zeitverlaufsstudien sollten für individuelle Zelllinien bestimmt werden. Empirisch, wie sie auf einer Vielzahl von Faktoren, einschließlich Proliferation, Zeit bis zur Tumor take und metastatischem Potential abhängt.
Zusätzlich zu sezieren die Interactions etablierter Eierstockkrebszelllinien und deren omental Mikroumgebung, die wichtig für die Bildung von Metastasen, kann die hier beschriebene Technik auch verwendet werden, um das maligne Potential von klinisch abgeleitete Zellinien, die früh molekularen Veränderungen in serösen Tuben intraepitheliale Karzinome im zu rekapitulieren evaluieren Fimbrien der Eileiter 12-17. Obwohl ein Weg für die Molekular Progression dieser Läsionen entsteht, werden in vivo Studien im Hinblick auf die biologische Bedeutung der spezifischen Veränderungen zu bestimmen. Komplementär in vivo und ex vivo-Assays können verwendet werden, um bestimmte Schritte in metastatischen Kolonisierung omental Gewebe durch solche Modellvorläuferzelllinien gewonnenen Informationen aus Studien können Schlüssel für die Erzeugung der therapeutischen Hypothesen und der Gestaltung der weitere präklinische Studien sein beurteilen.
Identifizierung von Mechanismen, die metastasierendem Kolonisierung steuern kann die Prävention zu ermöglichenoder Kontrolle der Metastasenbildung. Zum Beispiel Frauen, die ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung von Eierstockkrebs 18-22 sind (dh BRCA1- oder BRCA2-Gen-Mutation Träger) oft unterziehen prophylaktische Salpingoophorektomie um das Risiko der Entwicklung von Bauchkrankheit 23,24 reduzieren. Leider Patienten oft noch zu entwickeln HGSC aufgrund der Auswuchs von Eierstockkrebs im Netz und andere Metastasen zum Zeitpunkt der Operation vorhandenen Zellen. Identifikation von Mitteln, die omental Gewebemikroumgebung könnte Krebszelllokalisierung und / oder das Wachstum innerhalb des Netzes verhindern stören. Solche Ansätze könnten in Kombination mit Therapeutika, die Eierstockkrebszellen zielen, um Metastasenbildung zu verhindern oder Krebs Nachwachsen (nach chirurgischen debulking) zu unterdrücken, verwendet werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Tools | Fine Science Tools | NA | |
| Geimsa | Fluka/Sigma Aldrich | 48900 | |
| 5% Formalin | Sigma | HT501320 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | Without calcium and Magnesium |
| 26 gauge needle | BD | 329652 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| Stomacher | Seward Labsystems | Stomacher 80 Biomaster | |
| Microstomacher bag | Stomacher Lab Systems | BA6040/Micro | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Millicell culture plate insert | Millipore | PICM01250 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 |
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