Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Papir-baserede enheder til isolering og karakterisering af ekstracellulær Vesikler

doi: 10.3791/52722 Published: April 3, 2015

Summary

Denne protokol beskriver en metode til at isolere ekstracellulære vesikler (EVS), små hindeagtige partikler frigives fra cellerne, fra så lidt som 10 pi serumprøver. Denne fremgangsmåde omgår behovet for ultracentrifugering, kræver kun nogle få minutters assay tid og muliggør isolering af elbiler fra prøver af begrænsede mængder.

Abstract

Ekstracellulære vesikler (EVS), hindeagtige partikler frigivet fra forskellige typer af celler, holde et stort potentiale for kliniske anvendelser. De indeholder nukleinsyre og protein fragt og er i stigende grad anerkendt som et middel til intercellulær kommunikation anvendes af både eukaryot og prokaryote celler. Men på grund af deres lille størrelse, nuværende protokoller til isolering af EVT ofte tidskrævende, besværligt og kræver store prøvevolumener og dyrt udstyr, såsom en ultracentrifuge. For at løse disse begrænsninger har vi udviklet et papirbaseret immunoaffinitets- platform til adskillelse undergrupper af elbiler, der er let, effektiv og kræver prøvevolumener så lave som 10 pi. Biologiske prøver kan pipetteret direkte på papir testzoner, der er blevet kemisk modificeret med indfangningsmolekyler, der har høj affinitet til specifikke EV overflademarkører. Vi validere assayet ved anvendelse af scanningselektronmikroskopi (SEM), papirbaserede enzymkoblet immunosorbent assays (P-ELISA) og transkriptom analyse. Disse papirbaserede enheder vil gøre det muligt at studere elbiler i klinikken og indstillingen forskning for at hjælpe fremme vores forståelse af EV funktioner i sundhed og sygdom.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En generel diagram af operationen procedure er fastsat i figur 1. Ved hjælp af etiske praksis, vi indsamlede blodprøver fra raske forsøgspersoner, og opnåede vandige humor prøver fra patienter gennem Taichung Veterans General Hospital (TCVGH), Taichung, Taiwan under IRB godkendte protokoller ( IRB TCVGH No. CF11213-1).

1. Fremstilling af papir Devices

  1. Skær kromatografi papir i cirkler af 5 mm i diameter til at give den samme layout som en 96-brønds mikrotiterplade. Sandwich disse papir stykker med to polystyren plader med registreret gennemgående huller, og laminat.
  2. Ændre papir enheder ved hjælp af er beskrevet i de følgende trin 28 kemisk konjugation metode.
    1. Behandle papir for enheder med oxygen plasma (100 mW, 1% oxygen, 30 sek) i et plasma kammer.
      ADVARSEL: Særlig forsigtighed skal tages, når der arbejdes med 3-mercaptopropyltrimethoxysilan og N -γ-maleimidobutyryloxy succinimidester (GMBS), da de begge er fugtsensitive og giftige. Bær beskyttelseshandsker og undgå indånding eller kontakt med huden og øjnene. Hold bestanden flasken tæt lukket og lad den ligevægt til RT, inden du åbner for at undgå dannelse af kondensvand. Alternativt kan du åbne bestanden flaske inde i en nitrogen-fyldt handske taske eller kasse. Alikvot i små hætteglas for at undgå hyppig åbning af bestanden flasken.
    2. Inkuberes straks behandlet papir enheder i en 4% (v / v) opløsning af 3-mercaptopropyltrimethoxysilan i ethanol (200 proof) i 30 min.
    3. Skyl papir enheder med ethanol og inkubere dem med 0,01 umol / ml GMBS i ethanol i 15 min.
    4. Skyl med ethanol (200 proof) og inkuberes papir enheder med 10 ug / ml avidin opløsning i phosphatbufret saltvand (PBS) i 1 time ved 4 ° C. Opbevares ved 4 ° C, hvis det er nødvendigt, og anvendes inden for 4 uger.
  3. Fugt hver papir test zoner med 10 pi PBS indeholdende 1% (w / v) bovint serumalbumin (BSA) For 3 x 10 min før spotting 10 pi biotinyleret indfangningsmolekyler for 3 x 10 min. Bruge anti-CD63-antistof (20 ug / ml i PBS indeholdende 1% (w / v) BSA og 0,09% (w / v) natriumazid) eller annexin V (1:20, vol / vol i annexin V binding buffer) som indfangningsmolekyler.
  4. Skyl ubundne anti-CD63 antistof eller annexin V-molekyler ved hjælp af 10 pi svarende PBS indeholdende 1% (w / v) BSA eller annexin V binding pufferopløsninger til 3 × 1 min.

2. Serum og Vandig humor prøvetagning og Behandling

  1. Serum samling.
    1. Collect 10 ml perifert blod ved venepunktur i serumseparationsglas og vend forsigtigt røret fem gange. Sæt røret i en lodret position og vente i 30 min.
    2. Der centrifugeres ved 1.200 x g i 15 min. Overfør serum fra det øverste lag til et rent rør, og centrifugeres igen ved 3.000 x g i 30 min.
    3. Før supernatanten gennem en 0,8 um filter. Hold prøven ved -80 ° C indtil anvendelse.
  2. Vandig humor samling: indsamle vandige humor prøver fra patienter diagnosticeret med en øjenlæge direkte gennem invasive procedurer og gemme prøver ved -80 ° C indtil brug.

3. Isolering af ekstracellulær Vesikler

  1. Spot prøver på hver papir testzone med en hastighed på 5 ul / min.
  2. Skyl ubundne elbiler med 10 pi tilsvarende PBS indeholdende 1% (w / v) BSA eller annexin V binding pufferopløsninger til 3 × 1 min for papir enheder funktionaliseret med anti-CD63-antistof eller annexin V molekyler hhv. Udfør følgende downstream analyser.

4. Downstream Assay Eksempel 1: Scanning Electromicrographs

  1. Fix elbiler fanget på funktionaliseret papir test zone under anvendelse af 10 pi 0,5 × Karnovsky fiksativ i 10 min.
  2. Skyl prøverne med rigelig PBS i 2 × 5 min.
  3. Dehydrereprøver med efterfølgende 35% ethanol i 10 minutter, 50% ethanol i 2 × 10 min, 70% ethanol i 2 × 10 min, 95% ethanol i 2 × 10 min, og 100% ethanol til 4 × 10 min.
  4. Kritisk tør og sprutte pels prøverne med palladium / guld, og undersøger ved hjælp af en scanning elektronmikroskop drives ved lav elektron acceleration spænding (~ 5 kV).

5. Downstream Assay Eksempel 2: Papir-baserede ELISA

  1. Tilføj en 5 pi opløsning indeholdende anti-CD9 primært antistof ved 1: 1.000 fortynding i PBS til hver test zone indeholder tilfangetagne elbiler. Vent 1 min.
  2. Skyl prøverne med 30 ml PBS rystet ved 100 rpm i 30 sek.
  3. Tilføj en 5 pi opløsning indeholdende peberrodsperoxidase (HRP) -linked sekundært antistof ved 1: 1.000 fortynding i PBS og vent 1 min.
  4. Skyl prøverne med 30 ml PBS rystet ved 100 rpm i 30 sek.
  5. Tilføj en 5 pi kolorimetrisk substrat indeholdende 1: 1 volumenforhold af hydrogenperoxid end 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) og scanne bruger en stationær scanner.

6. Downstream Assay Eksempel 3: RNA Isolation

  1. Fordyb prøverne i 35 pi polyvinylpyrrolidon-baserede RNA isolation bistand og 265 pi lyse / bindingsbuffer at lysere elbiler tilfangetagne. Vortex kraftigt.
  2. Der tilsættes 30 pi homogenat tilvejebragt i isolation kit til lysatet. Vortex kraftigt og lagt på is i 10 min.
  3. Uddrag RNA ved anvendelse af syre phenol-chloroform separation beskrevet i de følgende trin.
    1. Tag 330 pi phenol-chloroform fra det nederste lag af flasken og tilføje til homogenatet / lysat. Vortex kraftigt.
    2. Centrifugeres ved 10.000 xg i 5 min. Den vandige (øvre) fase overføres til et rent rør og bemærk fjernet volumen.
  4. Præcipiter det totale RNA med 100% ethanol af det volumen, som er 1,25 gange volumenet af den vandige fase fjernes i det foregående trin og collect RNA'et i elueringsopløsningen forvarmet til 95 ° C.
  5. Koncentrat og yderligere at oprense RNA ved hjælp af en RNA oprydning kit ifølge fremstilling protokol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Evnen af ​​papiret anordning til at isolere undergrupper af elbiler effektivt afhængig sit følsomme og specifikke anerkendelse af EV overflademarkører. Den stabile modifikation af papirfibre med indfangningsmolekyler opnås ved anvendelse af avidin-biotin kemi som beskrevet andetsteds 28-30. Effektiviteten af ​​kemisk konjugation og af fysisorption metode vurderes ved anvendelse af fluorescens-baserede udlæsninger. Papir testzoner De fremstilles efter protokollen trin 1), undtagen capture-molekylet er erstattet med 20 ug / ml fluorophor R-phycoerythrinkonjugeret biotin molekyler (PE-biotin) i trin 1.3. Papir testzoner De bliver derefter skyllet med PBS for at fjerne ubundne PE-biotin molekyler. I modsætning hertil 10 pi 20 ug / ml PE-biotin i PBS indeholdende 1% (w / v) BSA og 0,09% (w / v) natriumazid direkte plettet på papiret test zone for 3 × 10 min, efterfulgt af PBS skyl til udførelse af fysisorption af PE-biotin farvemolekyler. Kemiskmodificerede papir-enheder ("papir + tværbinder + farvestof") sammen med uforarbejdede papir enheder ("papir"), papir-enheder modificeret med den samme protokol uden anvendelse af PE-biotin molekyler ("papir + tværbinder") og papir enheder med fysisorberet PE-biotinmolekyler ("fysisorberet-dye") scannes ved hjælp af et billede-registreringssystem sat til 540-560 nm excitation, 575 nm lange-pass emission, og dataene er gemt i form af 16-bit-filer og analyseret anvendelse ImageJ software. Som vist i figur 2A, fluorescensintensitet testzoner fremstillet ved kemisk konjugering metode er væsentligt højere i forhold til fysisk coated papir testzoner (p-værdi <0,0005, n = 5, T-test). Registrering af elbiler er også specifik som eksemplificeret i figur 2B, C, hvor få elbiler fastholdes på papiret enheden, når de indfangningsmolekyler erstattes af PBS-opløsning.

Elbiler er heterogene i siZES, specifikke indhold og biogenese ruter. For at binde dem, papir-enheder overtrukket med to forskellige EV indfangningsmolekyler, anti-CD63 antistoffer og annexin V, blev fremstillet. CD63, et medlem af tetraspanin familien (som omfatter CD9, CD63, CD81 og CD82-molekyler) er beriget på EV membran 31, og annexin V har en stærk affinitet til phosphatidylserin (PS) 32,33. Det konstateres, at elbiler frigives konstitutivt i den tidlige apoptose eller under stress betingelser, hvor proces normal celle phospholipid asymmetri er tabt, hvilket fører til øget eksponering af PS på den ydre blad af EV membran. Analyser af SEM billeder viser, at fordelingerne størrelse af CD63 + elbiler og PS + elbiler er forskellige, med gennemsnitlige diametre på 80 og 43 nm (figur 3) .Den to-tailed Students t-test anvendes til at bestemme den statistiske p-værdi (p-værdi <0,0001). Overraskende synes CD63 + elbiler rundere og større end PS + elbiler i gennemsnit, hvilket biologiskbetydning mangler at blive belyst.

RNA fra elbiler fanget på papiret enheden kan udvindes. Analyser med Bioanalyzer viste lignende overordnede profiler for total RNA udvundet fra CD63 + og PS + elbiler (figur 4A). Sammenlignet med de mængder af RNA ekstraheret under anvendelse af mikrofluide og ultracentrifugering teknikker, henholdsvis omkring dobbelt og 39 gange flere RNA'er pr volumen af serum prøve blev ekstraheret udnytte papir enhed, om end med en mindre prøvevolumen (tabel 1). P-ELISA kan udføres til påvisning af elbiler. Anti-CD9 primært antistof og HRP-konjugeret sekundært antistof anvendes i denne undersøgelse. Figur 4B viser grå værdiændringer fremstillet ved den enzymatiske reaktion af HRP til papir indretninger anvendt med 10 pi PBS, 50% serum (fortyndet med PBS) eller 100 % serum hhv. Den grå værdi stiger lineært inden for området serumprøver testes.

fx ultracentrifugering, der skal anvendes. Elbiler fra patientens vandige humor prøver isoleret med papir enheder overtrukket med anti-CD63 antistoffer kan ses i SEM billeder som vist i figur 5.

Figur 1
Figur 1. fabrikation og drift procedure af papirbaserede assays med henblik på isolering og karakterisering af ekstracellulære vesikler. (A) filtrerpapir skæres i den ønskede form og lamineret. (B) Den overflade af papiret er modificeret med en kort behandling af oxygen plasma og omsat med 3-mercaptopropyltrimethoxysilan, N </ Em> -γ-maleimidobutyryloxy succinimidester, og NeutrAvidin, i nævnte rækkefølge. Biotinylerede indfangningsmolekyler, fx antistoffer, kan derefter immobiliseres via den stærke affinitet mellem biotin og neutravidin molekyler. (C) Biosamples kan pipette på den funktionaliserede papir enhed. Ekstracellulære vesikler kan isoleres. (D) Downstream assays, såsom SEM, transkriptom, og ELISA (vist), kan udføres. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Ekstracellulære vesikler (EVS) kan indfanges på funktionaliserede papir enheder med god specificitet og følsomhed. (A) Fluorescensmærkede biotinmolekyler er stærkt immobiliseret på papirenhed via kemisk konjugation proces ("papir + tværbinder + farvestof") i modsætning til fysisk adsorption ("fysisorberet-dye"). Uforarbejdet papir ("papir") og konjugation molekyler ("papir + tværbinder") bidrager lidt til fluorescens intensitet. (B) en repræsentativ SEM-billede, der viser nogle elbiler indfanges på papiret enheden ikke-specifikt, når indfangningsmolekyler erstattes af PBS indeholdende 1% (w / v) BSA. (C) Mange elbiler tilbageholdes på papir enheder overtrukket med anti-CD63-antistoffer. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3-mercaptopropyl
Figur 3. undergrupper af Ekstracellulære vesikler (EVS) kan have forskellige distributioner størrelse. (A)og (B) er repræsentative SEM billeder af elbiler fanget på papir enheder overtrukket med anti-CD63 antistoffer og annexin V molekyler hhv. (C) CD63 + elbiler synes større end PS + elbiler under eksperimentelle betingelser, der anvendes i denne undersøgelse (p-værdi <0,0001, n = 124 og 203, T-test). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Nedstrøms transkriptom og ELISA-assays. (A) Bioanalyzer data, der viser de intensiteter (y-aksen, i arbitrære enheder) og størrelse (x-aksen, i nukleotider (nt)) fordelinger af fluorescens-mærket total RNA ekstraheret fra elbiler tilfangetagne på anti-CD63 antistof- eller annexin V-coatede filtrerpapirer. Den migrerer top ved ~ 25 nt repræsenterer en intern standard. (B) Grey værdiændringer fremstillet ved den enzymatiske reaktion af peberrodsperoxidase (HRP) i P-ELISA assay for papir indretninger anvendt med 10 prøver pi PBS, 50% serum (fortyndet med PBS) og 100% serumprøver. Klik her for et større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Ekstracellulære vesikler (EVS) i vandige humor prøver kan indfanges på funktionaliseret filterpapir uden prøve pooling. SEM billeder af isolerede CD63 + elbiler i vandige humor prøver fra patienter med (A) aldersrelateret makuladegeneration, (B) diabetisk makulært ødem, og (C) polypoidal choroidal vaskulopati hhv.load / 52722 / 52722fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

isolation metode indfangningsmolekyle serum vol. (Pi) gennemsnitlige RNA ekstraheret (ng) gennemsnitlige ekstraherede RNA / serum
(Pg / pl)
forholdet mellem gennemsnitlig RNA / serum ref
mikrovæskeanordning anti-humant CD63 400 4.14 10.4 20 20
papir-enhed anti-humant CD63 72 1,49 ± 0,08 20.7 39 22
papir-enhed annexin V 72 0.99 ± 0.26 13.8 26 22
ultracentrifugering - 2.000 1,06 ± 0,64 0,53 1
serum - 72 1,23 ± 0,58 17 32 22

Tabel 1. Samlet RNA ekstraheret fra serumprøver fra raske frivillige analyseret med et Bioanalyzer (n = 4 for alle forhold).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De mest kritiske trin for en vellykket isolering af undergrupper af ekstracellulære vesikler er: 1) et godt valg af papir; 2) stabil og høj dækning af indfangningsmolekyler på overfladen af ​​papirfibre; 3) korrekt håndtering af prøver; og 4) almen laboratorium hygiejnepraksis.

Porøse materialer er blevet anvendt i mange billige og udstyr-fri assays. De kan have afstemmelige porestørrelse, alsidig funktionalitet, lave omkostninger og høj overflade-til-volumen-forhold tillader passiv vægevirkning af væsker. Vi valgte kromatografi cellulose papirkvalitet 1 primært for dens rette porestørrelse og lav proteinadsorption. Sammenlignet med en anden almindeligt anvendte porøse materialer, nitrocellulose, cellulose papir har meget lavere uspecifik protein adsorption 34. Vi finder også lidt uspecifik indfangning af elbiler i denne undersøgelse. Desuden sin partikelretentionskonstruktion plan 11 um, er større end størrelsen af elbiler 35, giver mulighed for specifik indfangning ikontrast til den fysiske indfangning af elbiler. Her fokuserer vi på elbiler i en mindre størrelse ved at passere serumprøver gennem et 0,8 um filter, hvilket trin kan ændres når større elbiler skal undersøges.

Kemisk overflademodifikation kan være en nøgle til at opnå en stabil og høj dækning af indfangningsmolekyler på overfladen som et middel til at forbedre effektiviteten af ​​EV isolation. Surface modifikationer af cellulose er blevet revideret 36,37. Der er et stort antal hydroxyl (-OH) grupper på overfladen af ​​cellulose, og de kan reagere med silan til at give stabile kemiske Si-OC bindinger efter at være blevet aktiveret med oxygen plasma eller andre kondens proces. Den silan, der anvendes i denne undersøgelse er (3-mercaptopropyl) trimethoxysilan, (MeO) 3 Si- (CH2) 3 -SH. The thiol (-SH) gruppe kan reagere med GMBS til at give en kort space arm (0,73 nm) og en tværbindende gruppe, par med primære aminer. Indfangningsmolekyler med amingrupper kan konjugeresat GMBS direkte. I denne undersøgelse, men vi konjugeret NeutrAvidin stedet for at give en generel ordning at bøje forskellige capture molekyler, som er biotin-mærket. Imidlertid enighed om EV subtype-specifikke markører er endnu ikke nået 17. NeutrAvidin har en meget stærk affinitet til biotin, og en nær-neutral isoelektriske punkt (pH 6,3), hvilket minimerer ikke-specifikke interaktioner med negativt ladede objekter, fx overfladen af EVT. I modsætning hertil avidin med et isoelektrisk punkt på 10,5 bærer positive ladninger ved neutral pH. En højere koncentration af anti-CD63 antistof anvendes end i Chen et al. 20, hovedsagelig på grund af den lille volumen anvendes, og den større overflade-til-volumen-forholdet af papir enhed. Men mængden og sammensætninger af proteiner adsorberet på papirfibre er ikke blevet karakteriseret, som kan være prøve-afhængig. Derfor skal der udvises forsigtighed ved fortolkning af resultaterne af protein analyse.

Indsamlede bigiske prøver skal håndteres forsigtigt og behandles hurtigt for at forhindre artifactually øgede EV niveauer. Det anbefales at fjerne celler og blodplader, hvis nogen, før opbevaring ved -80 ° C. Der findes en aktuel standardisering af prøvehåndtering i EV forskning i denne anmeldelse 17.

Korrekt laboratorium hygiejnepraksis bør anvendes. Brug altid handsker og ændre handsker hyppigt for at minimere indførelsen af ​​støvpartikler og ribonukleaser. Isolation af RNA fra elbiler i cellekultur-konditionerede medier kan give mere end 70 gange større koncentrationer anvender papir enheder sammenlignet med den udvundet elbiler koncentreret ved hjælp af ultracentrifuge metode (ikke offentliggjort).

Den heri beskrevne protokollen bruger cellulose papir enheder modificeret kemisk med indfangningsmolekyler at isolere forskellige undergrupper af elbiler. Fremgangsmåden er enkel, effektiv og særligt værdifulde, når prøvevolumenet er begrænset.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet delvist af Taiwan National Science Rådet grants- NSC 99-2320-B-007-005-MY2 (CC) og NSC 101-2628-E-007-011-MY3 (CMC) og Veterans General Hospitaler og University System af Taiwan fælles forskningsprogram (CC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chromatography Paper GE Healthcare Life Sciences 3001-861 Whatman® Grade 1 cellulose paper
(3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane Sigma Aldrich 175617 This chemical reacts with water and moisture and should be applied inside a nitrogen-filled glove bag. Avoid eye and skin contact. Do not breathe fumes or inhale vapors.
Ethanol Fisher Scientific BP2818 Absolute, 200 Proof, molecular biology grade
Bovine serum albumin (BSA) BioShop Canada Inc. ALB001 Often referred to as Cohn fraction V.
N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS) Pierce Biotechnology 22309 GMBS is an amine-to-sulfhydryl crosslinker. GMBS is moisture-sensitive.
Avidin Pierce Biotechnology 31000 NeutrAvidin has 4 binding sites for biotin and its pI value is 6.3, which is more neutral than native avidin
Biotinylated mouse anti-human anti-CD63 Ancell 215-030 clone AHN16.1/46-4-5
biotinylated annexin V BD Biosciences 556418 Annxin V has a high affinity for phosphatidylserine (PS)
Primary anti-CD9 and secondary antibody System Biosciences EXOAB-CD9A-1 The secondary antibody is horseradish peroxidise-conjugated
Serum separation tubes BD Biosciences 367991 Clot activator and gel for serum separation
Annexin V binding buffer BD Biosciences 556454 10x; dilute to 1x prior to use.
TMB substrate reagent set BD Biosciences 555214 The set contains hydrogen peroxide and 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)
Name Company Catalog Number Comments
RNA isolation kit Life Technologies AM1560 MirVana RNA isolation kit
Polyvinylpyrrolidone-based RNA isolation aid Life Technologies AM9690 Plant RNA isolation aid contains polyvinylpyrrolidone (PVP) that binds to polysaccharides.
RNA cleanup kit Qiagen Inc. 74004 MinElute RNA cleanup kit is designed for purification of up to 45 μg RNA.
Plasma chamber March Instruments PX-250
Scanning electron microscope Hitachi Ltd. S-4300
Desktop scanner Hewlett-Packard Company Photosmart B110 8-bit color images were captured. Cameras and smart phones may be also used.
Image-record system J&H Technology Co GeneSys G:BOX Chemi-XX8 16-bit fluroscence images were captured. Fluroscence microscopes may be also used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).
  2. Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. J. Transl. Med. 9, 9 (2011).
  3. Raj, D. A. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81, 1263-1272 (2012).
  4. Wiggins, R. C., Glatfelter, A., Kshirsagar, B., Brukman, J. Procoagulant activity in normal human-urine associated with subcellular particles. Kidney Int. 29, 591-597 (1986).
  5. Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).
  6. Keller, S., Ridinger, J., Rupp, A. K., Janssen, J. W. G., Altevogt, P. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics. J. Transl. Med. 9, 86 (2011).
  7. Asea, A., et al. Heat shock protein-containing exosomes in mid-trimester amniotic fluids. J. Reprod. Immunol. 79, 12-17 (2008).
  8. Bard, M. P., et al. Proteomic analysis of exosomes isolated from human malignant pleural effusions. Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 31, 114-121 (2004).
  9. Perkumas, K. M., Hoffman, E. A., McKay, B. S., Allingham, R. R., Stamer, W. D. Myocilin-associated exosomes in human ocular samples. Exp. Eye Res. 84, 209-212 (2007).
  10. Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis. Lab. Invest. 90, 1549-1557 (2010).
  11. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119, 756-766 (2012).
  12. Grange, C., et al. Microvesicles released from human renal cancer stem cells stimulate angiogenesis and formation of lung premetastatic niche. Cancer Res. 71, 5346-5356 (2011).
  13. Jaiswal, R., et al. Microparticle-associated nucleic acids mediate trait dominance in cancer. Faseb. J. 26, 420-429 (2012).
  14. Thery, C., Clayton, A., Amigorena, S., Raposo, G. Current protocols in cell biology. Morgan, K. K. (UNIT 3.22), John Wiley. New York, NY. (2006).
  15. Rood, I. M., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
  16. Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110, 13-21 (2008).
  17. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J. Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).
  18. Fernandez-Llama, P., et al. Tamm-Horsfall protein and urinary exosome isolation. Kidney Int. 77, 736-742 (2010).
  19. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Ravi, R. K., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. 82, 1024-1032 (2012).
  20. Chen, C., et al. Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum microvesicles. Lab. Chip. 10, 505-511 (2010).
  21. Davies, R. T., et al. Microfluidic filtration system to isolate extracellular vesicles from blood. Lab. Chip. 12, 5202-5210 (2012).
  22. Chen, C., et al. Paper-based immunoaffinity devices for accessible isolation and characterization of extracellular vesicles. Microfluid. Nanofluid. 16, 849-856 (2014).
  23. Lamparski, H. G., et al. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells. J. Immunol. Methods. 270, 211-226 (2002).
  24. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: Purification of both vesicles from cell-free supernatants. J. Immunol. Methods. 338, 21-30 (2008).
  25. Carrilho, E., Martinez, A. W., Whitesides, G. M. Understanding wax printing: a simple micropatterning process for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 7091-7095 (2009).
  26. Dungchai, W., Chailapakul, O., Henry, C. S. Electrochemical detection for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 5821-5826 (2009).
  27. Glavan, A. C., et al. Omniphobic 'R-F paper' produced by silanization of paper with fluoroalkyltrichlorosilanes. Adv. Funct. Mater. 24, 60-70 (2014).
  28. Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y. H., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear-stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).
  29. Murthy, S. K., Sin, A., Tompkins, R. G., Toner, M. Effect of flow and surface conditions on human lymphocyte isolation using microfluidic chambers. Langmuir. 20, 11649-11655 (2004).
  30. Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization. Biosens. Bioelectron. 14, 683-688 (1999).
  31. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat. Rev. Immunol. 2, 569-579 (2002).
  32. Scanu, A., et al. Stimulated T cells generate microparticles, which mimic cellular contact activation of human monocytes: differential regulation of pro- and anti-inflammatory cytokine production by high-density lipoproteins. J. Leukocyte Biol. 83, 921-927 (2008).
  33. Inal, J. M., et al. Microvesicles in health and disease. Arch. Immunol. Ther. Ex. 60, 107-121 (2012).
  34. Fridley, G. E., Holstein, C. A., Oza, S. B., Yager, P. The evolution of nitrocellulose as a material for bioassays. Mrs Bull. 38, 326-330 (2013).
  35. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell. Mol. Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
  36. Missoum, K., Belgacem, M. N., Bras, J. Nanofibrillated cellulose surface modification: a review. Materials. 6, 1745-1766 (2013).
  37. Kalia, S., Boufi, S., Celli, A., Kango, S. Nanofibrillated cellulose: surface modification and potential applications. Colloid Polym. Sci. 292, 5-31 (2014).
Papir-baserede enheder til isolering og karakterisering af ekstracellulær Vesikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (98), e52722, doi:10.3791/52722 (2015).More

Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (98), e52722, doi:10.3791/52722 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter