Protocol
1. טיהור של הצבע
- הכן תמיסה מימית 4% מתיל ירוק על ידי המסת 0.4 גרם של אבקת כתם ב 10 מיליליטר מים מזוקקים. מערבבים היטב עד פירוקה לחלוטין.
- תחת מכסה המנוע קטר-, לערבב אותו עם לפחות 2 חלקים של כלורופורם. חשוב לבדוק מראש אם הצינורות הם כלורופורם עמיד.
- מערבבים היטב וצנטריפוגות 1 דקות XG ב 2000 כדי להאיץ הפרדת שלב.
- לאחר צנטריפוגה, שלב מימי עליון עם מתיל ירוק ושלב אורגני נמוך עם כלורופורם וסגול גביש המזהם הרגילה מתקבלים.
- לשחזר את השלב העליון וחזור על שלב זה עד שלב תחתון מופיע נטול לחלוטין של סגול גביש.
- בסוף, בשלב העליון הוא התאושש ומדולל במים לריכוז סופי של 2% מתיל ירוק. פתרון מניות זה הוא יציב על שולחן העבודה במשך חודשים ולא צריך להיות מוגן מפני אור.
"Jove_title"> 2. פלורסנט גרעיני מכתים של כל הפריטים עוברי דג הזברה באמצעות תיל ירוק
- תקן את עוברי פורמלדהיד% הלילה ב 4 (מparaformaldehyde) בופר פוספט (PBS).
הערה: זה יכול לקחת בין כמה שעות ללילה בהתאם לעובי של העוברים. בדוגמא, אנו קבועים לאחר הפריה עוברי דג הזברה (hpf) 48 שעות לילה. - לשטוף את העוברים שלוש פעמים PBS-T (1% Triton X-100 ב PBS) במשך 5 דקות. הריכוז הגבוה של חומר ניקוי permeabilizes לציפורן.
- הכן 1: פתרון 10,000 ירוק מתיל (2% ממניות פתרון) בPBS-T: 5,000-1. הנוכחות של חומר ניקוי במהלך הדגירה היא שימושית עבור דגימות עבות, כגון עוברי דג הזברה וזחלים.
- דגירה עובר בפתרון במשך לפחות 6 שעות על 4 מעלות צלזיוס, עם נדנדה עדינה. שוב, העובי של העובר הוא פרמטר הכיול לאורכו של הדגירה.
- לשטוף את העוברים 3 times עם PBS למשך 30 דקות כדי להסיר את עודפי חומר הניקוי. הקרינה ירוקה מתיל היא רק ביטוי כאשר חייב DNA, ומכאן רקע מהמולקולה מאוגד הוא זניח.
- הר בשקופית נחפרה או קאמרי תוצרת בית עם פתרון הרכבה (גליצרול 75%, 0.1 מ 'טריס · HCl pH 8).
הערה: אם ההכתמה הגרעינית היא שיש לבצע לאחר immunolabeling, ירוק מתיל יכול להיות משולב לפתרון ההרכבה בריכוז העבודה, ללא צורך לשטוף אותו משם. - חנות בקירור או להתחיל הדמיה באופן מיידי. לבצע הדמיה עם confocal סריקת לייזר (או הקרינה אחרת) מיקרוסקופ עם עירור ב 633 ננומטר ומסנני פליטה שנקבעו לרישום ב650-750 ננומטר בהתחשב בכך שתיל פליטה ירוקה מגיעה למקסימום שלה ב677 ננומטר.
הערה: אנו מספקים נתונים שנמדדו בפרופיל הפליטה הירוק מתיל, כדי להיות טעון לתוך תוכנת הרכישה, כחומר משלים.
3. פלורסנט הגרעיני Staining של כל הפריטים צ'יק עוברים באמצעות מתיל ירוק
- דגירה ביצי תרנגולת מופרות לשלב של עניין. תקן את עוברי הלילה בפורמלין 4% (מparaformaldehyde) PBS ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף עוברים 3 פעמים ב PBS-T לשעה 2.
- הכן 1: פתרון 10,000 ירוק מתיל (2% ממניות פתרון) בPBS-T: 5,000-1. דגירה עובר בפתרון מכתים הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף את העוברים 3 פעמים ב PBS, 1 שעה כל אחד. הר בתא עם גליצרול 75%, 0.1 מ 'טריס, pH 8.
4. ההדמיה שכותרתו fluorescently גרעינים בעוברים רכוב שלמים
- הכן תא הדמיה על ידי דבק כמה שכבות של קלטת חשמל על שקופיות מיקרוסקופ ובזהירות לחתוך חור לתוכו עם אזמל למקם את העוברים בתוך. זה ימנע מעוברי הריסוק במהלך הדמיה.
- להעביר בזהירות את העוברים לחדר ההדמיה ולמלא את התא לראש עם גליצרול 75%, 0.1 מ 'טריס HCl, pH = 8 להיווצרות בועת חלל.
- מכסים בcoverslip # 0 הימנעות או ביטול עולה על גדותיו בינוניות. לאטום אותו עם לק.
- לרכוש תמונות של הדגימה במיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במסנן 633 עירור או קו לייזר.
הערה: מסנני פליטה צריכים לכסות את מקסימום 677 פליטה ירוקה מתיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הכתמה גרעינית של דגימות עבות. הפרוטוקול המתואר במסמך זה מאפשר להשגת צביעה הומוגנית של מבנים עמוקים בכל עוברים. טופס גרעיני 48 hpf עוברי דג הזברה עדשת פיתוח הומוגנית מסומנים (איור 1).
צביעת DNA ירוקה מתיל מאפשרת אפליה של הבדלים מורפולוגיים תלויים מחזור התא כגון זיהוי של דמויות mitotic או גרעינים אפופטוטיים (איור 2 א). מבני Subnuclear ברזולוציה גבוהה ניכרים גם כפי שמוצגים לגרעיני אפידרמיס של עוברי דג הזברה (איור 2).
ירוק מתיל הוא עמיד לphotobleaching תחת קרינה בעוצמה גבוהה לתקופות ממושכות של זמן. כאשר מוקרן עם אור הלייזר 633 ננומטר באותה העצמה, מכתים גרעיני ירוק מתיל לא להלבין את כפי שהוא במקרה של עוד מאפיינים דומים רפאים שיתוף כתם DNA ספציפי, TO-PRO-34. מטוס confocal של הרשתית של עובר דג הזברה רכוב כל נבחר וגדלה עם מטרה 63x 1.4NA להשיג גבוהה הקרנה. כאשר תצוגה מוקטנת, הדגימות מוכתמות בTO-PRO-3 הראו הלבנת בתוך 60 שניות של הקרנה רציפה (איור 3, לוחות העליונים), ואילו הדגימות מוכתמות בירוקים מתיל לא הראו ראיות גלויות של photobleaching אפילו ב 120 שניות באותם תנאים (איור 3, לוחות נמוכים). תמונות שנרכשו בתוכנת LASAF עובדו נוספות (בהירות / ניגודיות; שחזור 3D; הקרנת עוצמה מקסימלית) באמצעות תוכנת פיג'י קוד פתוח (http://fiji.sc/).
איור 1:. מכתים גרעיני אחידים של מבנים עמוקים עם ירוק מתיל פיתוח עדשה של 48 hpf עובר דג הזברה מוכתם בירוק מתיל (MG) בo Z-הקרנה ו 20 מטוסי confocal. עוברים היו counterstained לF- אקטין עם phalloidin TRITC מצומדות- (Phal). בר סולם: 15 מיקרומטר.
איור 2: מורפולוגיה גרעינית ורזולוציה subnuclear עם מתיל ירוק צביעה) מורפולוגיות גרעיניות שונות בעור של עובר דג הזברה 48 hpf.. MG, ירוק מתיל. דגימות היו counterstained לF- אקטין עם TRITC-phalloidin. ראש חץ: תא mitotic. הקרנה המרבית בעוצמה של 10 מטוסי confocal. B) צלחת עובר האפרוח עצבית שכותרתו באותו אופן, בו מוצגות תאי mitotic (ראשי חץ) וגרעינים pyknotic (חיצים). מטוס confocal יחיד. ג) שלושה מטוסי confocal יחידים של גרעין דג הזברה אפידרמיס העובר בהגדלה גבוהה, מראה על רמה גבוהה של הרזולוציה subnuclear. ברים סולם:, 15 מיקרומטר; B, 5 מיקרומטר; C, 1 מיקרומטר.
-page = "תמיד"> 
איור 3:. גרעיני photostability של ירוק מתיל תחת עירור מתמשך מוכתמת-TO-PRO-3 של רשתית דג הזברה 48 hpf היה מולבן על 60 שניות של עירור מתמשך ב633 ננומטר (לוחות העליונים). באותם תנאים, עובר מוכתם-ירוק מתיל (MG) לא הראה הלבנה מורגשת, גם כאשר לשכפל את זמן חשיפה (לוחות נמוכים יותר). הלבנה ורכישה נעשתה על ידי סריקה במטוסים אחת, ב 8000 הרץ, 30% כוח לייזר וקו (X2) ומסגרת מיצוע (x4). בר סולם: 30 מיקרומטר.
| אורך גל (ננומטר) | פליטת אחוזים |
| 640 | 21.37 |
| 643 | 27.5 |
| 646 | 36.69 |
| 44.47 | |
| 652 | 53.92 |
| 655 | 61.82 |
| 658 | 67.86 |
| 661 | 83.2 |
| 664 | 85.22 |
| 667 | 89.45 |
| 670 | 87.33 |
| 673 | 92.3 |
| 676 | 100 |
| 679 | 97.41 |
| 682 | 90.34 |
| 685 | 83.32 |
| 78.37 | |
| 691 | 76.09 |
| 694 | 73.95 |
| 697 | 67.36 |
| 700 | 64.4 |
| 703 | 61.26 |
| 706 | 56.39 |
| 709 | 55.06 |
| 712 | 49.56 |
| 715 | 46.12 |
| 718 | 41.4 |
| 721 | 38.8 |
| 724 | 35.97 |
| 33.27 | |
| 730 | 30.95 |
| 733 | 28.78 |
| 736 | 26.28 |
| 739 | 24.96 |
| 742 | 23.3 |
| 745 | 21.12 |
| 748 | 19.86 |
| 751 | 17.47 |
| 754 | 16.14 |
| 757 | 14.21 |
| 760 | 12.45 |
| 763 | 11.49 |
| 9.97 | |
| 769 | 7.55 |
| 772 | 7.75 |
| 775 | 6.46 |
| 778 | 5.76 |
| 781 | 4.38 |
| 784 | 2.6 |
| 787 | 2.75 |
| 790 | 2.27 |
| 793 | 1.52 |
| 796 | 0 |
חומר משלים 1: ספקטרום פליטה של מכתים גרעיני ירוק מתיל תחת עירור 633 ננומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Methyl green | Dr. G. Grübler | Also tested Sigma-Aldrich 323829, which is crystal violet-free | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Laser scanning confocal microscopy Leica TCS-SP5 | Leica Microsystems | ||
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 |
|
| chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 5811 000.010 | |
| microscope slides | Deltalab | D100004 | |
| cover slips | Esco optics | R525025 |
References
- Klonisch, T., Wark, L., Hombach-Klonisch, S., Mai, S. Nuclear imaging in three dimensions: a unique tool in cancer research. Annals of anatomy. 192 (5), 292-301 (2010).
- Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic. 70 (5), 220-233 (1995).
- Latt, S. A., Stetten, G. Spectral studies on 33258 Hoechst and related bisbenzimidazole dyes useful for fluorescent detection of deoxyribonucleic acid synthesis. The journal of histochemistry and cytochemistry. 24 (1), 24-33 (1976).
- Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: a novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).
- Beumer, T. L., Veenstra, G. J., Hage, W. J., Destrée, O. H. Whole-mount immunohistochemistry on Xenopus embryos using far-red fluorescent dyes. Trends in genetics. 11 (1), 9 (1995).
- Prieto, D., Aparicio, G., Morande, P. E., Zolessi, F. R. A fast, low cost, and highly efficient fluorescent DNA labeling method using methyl green. Histochemistry and cell biology. 142 (3), 335-345 (2014).
- Kim, S. K., Nordén, B. Methyl green. A DNA major-groove binding drug. FEBS letters. 315 (1), 61-64 (1993).
- Nordén, B., Tjerneld, F. Binding of methyl green to deoxyribonucleic acid analyzed by linear dichroism. Chemical Physics Letters. 50 (3), 508-512 (1977).
- Lyon, H., Jakobsen, P., Andersen, aP. Standardized methyl green-pyronin Y procedures using pure dyes. The Histochemical journal. 18 (2-3), 90-94 (1986).
- Amat, F., Keller, P. J. Towards comprehensive cell lineage reconstructions in complex organisms using light-sheet microscopy. Development, growth & differentiation. 55 (4), 563-578 (2013).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature methods. 10 (6), 508-5013 (2013).
- Lenz, P. Fluorescence measurement in thick tissue layers by linear or nonlinear long-wavelength excitation. Applied. 38 (16), 3662-3669 (1999).
