Protocol
डाई के 1. शुद्धीकरण
- आसुत जल 10 मिलीलीटर में दाग पाउडर का 0.4 जी भंग करके मिथाइल हरे रंग की एक 4% जलीय घोल तैयार करें। यह पूरी तरह से भंग जब तक अच्छी तरह से मिलाएं।
- एक धूआं हुड के तहत, क्लोरोफॉर्म के कम से कम 2 भागों के साथ मिश्रण। यह ट्यूब क्लोरोफॉर्म प्रतिरोधी रहे हैं कि क्या पहले से जाँच करने के लिए महत्वपूर्ण है।
- अच्छी तरह मिक्स और चरण जुदाई में तेजी लाने के लिए 2,000 XG पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
- बाद centrifugation, मिथाइल हरे रंग के साथ एक ऊपरी जलीय चरण और क्लोरोफॉर्म के साथ एक कम जैविक चरण और हमेशा की तरह दूषित क्रिस्टल बैंगनी प्राप्त कर रहे हैं।
- ऊपरी चरण में स्वस्थ और कम चरण क्रिस्टल वायलेट का पूरी तरह से रहित दिखाई देता है जब तक इस चरण को दोहराएँ।
- अंत में, ऊपरी चरण बरामद किया है और 2% मिथाइल हरे रंग की एक अंतिम एकाग्रता के लिए पानी में पतला। इस शेयर समाधान महीनों के लिए कार्यक्षेत्र पर स्थिर है और प्रकाश से संरक्षित करने की आवश्यकता नहीं है।
- फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में (paraformaldehyde) से रात भर में 4% formaldehyde के भ्रूण को ठीक करें।
नोट: यह कुछ घंटे लग सकते हैं रातोंरात भ्रूण की मोटाई के आधार पर करने के लिए। उदाहरण में, हम रातोंरात 48 घंटा बाद निषेचन (HPF) zebrafish भ्रूण तय की। - 5 मिनट के लिए पीबीएस टी (पीबीएस में 1% ट्राइटन X-100) में भ्रूण तीन बार धोएं। डिटर्जेंट का ऊंचा एकाग्रता छल्ली permeabilizes।
- 5,000-1: पीबीएस टी में (2% शेयर समाधान से) मिथाइल हरे रंग के 10,000 समाधान के लिए एक 1 तैयार करें। ऊष्मायन के दौरान डिटर्जेंट की मौजूदगी में इस तरह के zebrafish भ्रूण और लार्वा के रूप में मोटी नमूनों के लिए उपयोगी है।
- कोमल कमाल के साथ, 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 6 घंटे के लिए समाधान में भ्रूण सेते हैं। फिर, भ्रूण की मोटाई ऊष्मायन की लंबाई के लिए औजार पैरामीटर है।
- भ्रूण 3 टिम धो लें30 मिनट के लिए पीबीएस के साथ तों डिटर्जेंट अतिरिक्त हटाने के लिए। डीएनए के लिए बाध्य जब मिथाइल हरी प्रतिदीप्ति ही स्पष्ट है, अनबाउंड अणु से इसलिए पृष्ठभूमि नगण्य है।
- एक खुदाई की स्लाइड या बढ़ते समाधान के साथ एक घर का बना कक्ष पर माउंट (75% ग्लिसरॉल, 0.1 एम Tris · एचसीएल पीएच 8)।
नोट: परमाणु धुंधला immunolabeling के बाद किया जा रहा है, मिथाइल हरे इसे दूर धोने के लिए कोई ज़रूरत नहीं है, के साथ काम कर रहे एकाग्रता में बढ़ते समाधान करने के लिए शामिल किया जा सकता है। - स्टोर प्रशीतित या तुरंत इमेजिंग शुरू करते हैं। 650-750 एनएम हरी उत्सर्जन 677 एनएम पर इसकी अधिकतम तक पहुँच जाता है मिथाइल कि खाते में ले पर रजिस्टर करने के लिए सेट 633 एनएम और उत्सर्जन फिल्टर पर उत्तेजना के साथ एक लेजर स्कैनिंग confocal (या अन्य प्रतिदीप्ति) खुर्दबीन के साथ इमेजिंग प्रदर्शन करते हैं।
नोट: हम मिथाइल हरी उत्सर्जन प्रोफाइल की मापा डेटा, अनुपूरक सामग्री के रूप में, अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में लोड करने की प्रदान करते हैं।
3. फ्लोरोसेंट परमाणु सेंटमिथाइल ग्रीन का उपयोग करते हुए पूरे लड़की भ्रूण की aining
- ब्याज की चरण के लिए निषेचित मुर्गी अंडे सेते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात पीबीएस में (paraformaldehyde से) 4% formaldehyde में भ्रूण को ठीक करें। 2 घंटे के लिए पीबीएस टी में भ्रूण 3 बार धोएं।
- 5,000-1: पीबीएस टी में (2% शेयर समाधान से) मिथाइल हरे रंग के 10,000 समाधान के लिए एक 1 तैयार करें। रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर धुंधला समाधान में भ्रूण सेते हैं। भ्रूण पीबीएस में 3 बार, 1 घंटा प्रत्येक धो लें। 75% ग्लिसरॉल, 0.1 एम Tris, पीएच 8 के साथ कक्ष में माउंट।
4. इमेजिंग Fluorescently पूरे घुड़सवार भ्रूण में नाभिक लेबल
- ध्यान से एक खुर्दबीन स्लाइड पर बिजली के टेप की कई परतों चिपके हुए हैं और से एक इमेजिंग कक्ष तैयार भीतर भ्रूण स्थान के लिए एक स्केलपेल के साथ इसे में एक छेद में कटौती। इस इमेजिंग के दौरान कुचल से भ्रूण को रोकने जाएगा।
- ध्यान से एक 75% ग्लिसरॉल, 0.1 एम Tris-एचसीएल, पीएच = 8 के साथ शीर्ष पर चैम्बर इमेजिंग कक्ष भ्रूण हस्तांतरण और भरनेशून्य बुलबुला गठन।
- एक # 0 coverslip से बचने या मध्यम ढेर को नष्ट करने के साथ कवर। नेल पॉलिश के साथ यह सील।
- एक 633 उत्तेजना फिल्टर या लेजर लाइन के साथ सुसज्जित एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर नमूना की छवियों मोल।
नोट: उत्सर्जन फिल्टर मिथाइल हरे रंग के 677 उत्सर्जन अधिकतम कवर किया जाना चाहिए।
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Representative Results
मोटी नमूनों की परमाणु धुंधला हो जाना। इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल पूरे भ्रूण में गहरी संरचनाओं के सजातीय धुंधला की उपलब्धि के लिए अनुमति देता है। विकास लेंस नाभिक फार्म 48 HPF zebrafish भ्रूण homogeneously (चित्रा 1) लेबल रहे हैं।
मिथाइल हरे डीएनए धुंधला ऐसे mitotic आंकड़े या apoptotic नाभिक (2A चित्रा) की पहचान के रूप में सेल चक्र निर्भर रूपात्मक मतभेद की भेदभाव की अनुमति देता है। Zebrafish भ्रूण (चित्रा 2 बी) के एपिडर्मल नाभिक के लिए दिखाया गया के रूप में उच्च संकल्प पर subnuclear संरचनाओं को भी स्पष्ट कर रहे हैं।
मिथाइल हरे समय की लंबी अवधि के लिए उच्च तीव्रता के विकिरण के तहत photobleaching के लिए प्रतिरोधी है। एक ही तीव्रता पर 633 एनएम लेजर प्रकाश के साथ विकिरणित जब यह एक और डीएनए विशिष्ट दाग बांटने के समान वर्णक्रमीय विशेषताओं के मामले को प्रो-3, के रूप में है, मिथाइल हरे परमाणु धुंधला बाहर ब्लीच नहीं करता4। एक पूरी मुहिम शुरू की zebrafish भ्रूण की रेटिना की एक confocal विमान चयनित और उच्च विकिरण प्राप्त करने के लिए एक 63x 1.4NA उद्देश्य के साथ में उछाल रहा था। बाहर तेजी से बढ़ी है, जब नमूनों के साथ दाग को प्रो-3 से पता चला मिथाइल हरे रंग के साथ दाग नमूनों ही स्थितियों में भी 120 सेकंड photobleaching का कोई स्पष्ट सबूत से पता चला है, जबकि निरंतर विकिरण (चित्रा 3, ऊपरी पैनल) के 60 सेकंड के भीतर विरंजन (चित्रा 3, कम पैनल)। फिजी खुला स्रोत सॉफ्टवेयर (http://fiji.sc/) का उपयोग LASAF सॉफ्टवेयर में अधिग्रहीत छवियों आगे (अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण; 3D पुनर्निर्माण चमक / विपरीत) प्रोसेस किया गया।
चित्रा 1:। मिथाइल हरे रंग के साथ गहरे संरचनाओं के सजातीय परमाणु धुंधला A से Z-प्रक्षेपण ओ में मिथाइल हरे (एमजी) के साथ दाग एक 48 HPF zebrafish भ्रूण के लेंस के विकास20 कोंफोकल विमानों एफ। भ्रूण TRITC संयुग्मित phalloidin (फल) के साथ एफ actin के लिए counterstained थे। स्केल बार: 15 माइक्रोन।
चित्रा 2: परमाणु आकृति विज्ञान और मिथाइल हरे रंग धुंधला ए) एक 48 HPF zebrafish भ्रूण की एपिडर्मिस में विभिन्न परमाणु morphologies के साथ subnuclear संकल्प।। एमजी, मिथाइल हरे। नमूने TRITC-phalloidin साथ एफ actin के लिए counterstained थे। Arrowhead: mitotic सेल। 10 कोंफोकल विमानों की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण। Mitotic कोशिकाओं (तीर) और pyknotic नाभिक (तीर) प्रदर्शित करने के लिए एक ही रास्ता में लेबल बी) लड़की भ्रूण तंत्रिका प्लेट,। एकल कोंफोकल विमान। सी) subnuclear संकल्प के एक उच्च स्तर दिखा उच्च वृद्धि पर एक zebrafish भ्रूण एपिडर्मल नाभिक, के तीन एकल कोंफोकल विमानों। स्केल सलाखों: ए, 15 माइक्रोन; बी, 5 माइक्रोन; सी, 1 माइक्रोन।
चित्रा 3:। एक 48 HPF zebrafish रेटिना के निरंतर उत्तेजना के तहत मिथाइल हरे रंग की photostability को प्रो-3-दाग नाभिक 633 एनएम (ऊपरी पैनल) पर निरंतर उत्तेजना के 60 सेकंड पर प्रक्षालित किया गया था। जोखिम समय (कम पैनल) duplicating भी जब एक ही परिस्थितियों में, एक मिथाइल हरे रंग से सना हुआ भ्रूण (एमजी), प्रत्यक्ष विरंजन नहीं दिखा था। विरंजन और अधिग्रहण 8000 हर्ट्ज, 30% लेजर शक्ति और रेखा (X2) और फ्रेम (X4) औसत पर, एकल विमानों में स्कैनिंग द्वारा किया गया था। स्केल बार: 30 माइक्रोन।
| वेवलेंथ (एनएम) | प्रतिशत उत्सर्जन |
| 640 | 21.37 |
| 643 | 27.5 |
| 646 | 36.69 |
| 44.47 | |
| 652 | 53.92 |
| 655 | 61.82 |
| 658 | 67.86 |
| 661 | 83.2 |
| 664 | 85.22 |
| 667 | 89.45 |
| 670 | 87.33 |
| 673 | 92.3 |
| 676 | 100 |
| 679 | 97.41 |
| 682 | 90.34 |
| 685 | 83.32 |
| 78.37 | |
| 691 | 76.09 |
| 694 | 73.95 |
| 697 | 67.36 |
| 700 | 64.4 |
| 703 | 61.26 |
| 706 | 56.39 |
| 709 | 55.06 |
| 712 | 49.56 |
| 715 | 46.12 |
| 718 | 41.4 |
| 721 | 38.8 |
| 724 | 35.97 |
| 33.27 | |
| 730 | 30.95 |
| 733 | 28.78 |
| 736 | 26.28 |
| 739 | 24.96 |
| 742 | 23.3 |
| 745 | 21.12 |
| 748 | 19.86 |
| 751 | 17.47 |
| 754 | 16.14 |
| 757 | 14.21 |
| 760 | 12.45 |
| 763 | 11.49 |
| 9.97 | |
| 769 | 7.55 |
| 772 | 7.75 |
| 775 | 6.46 |
| 778 | 5.76 |
| 781 | 4.38 |
| 784 | 2.6 |
| 787 | 2.75 |
| 790 | 2.27 |
| 793 | 1.52 |
| 796 | 0 |
पूरक सामग्री: 1 633 एनएम उत्तेजना के तहत मिथाइल हरे परमाणु धुंधला के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Methyl green | Dr. G. Grübler | Also tested Sigma-Aldrich 323829, which is crystal violet-free | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Laser scanning confocal microscopy Leica TCS-SP5 | Leica Microsystems | ||
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 |
|
| chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 5811 000.010 | |
| microscope slides | Deltalab | D100004 | |
| cover slips | Esco optics | R525025 |
References
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