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Developmental Biology

배아의 형광 라벨의 DNA 특정 얼룩 메틸 녹색의 응용 프로그램

doi: 10.3791/52769 Published: May 2, 2015

Protocol

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염료 1. 정제

  1. 증류수 10ml에 얼룩 분말 0.4 g을 용해시켜 메틸 녹색의 4 % 수용액을 준비합니다. 완전히 용해 될 때까지 잘 섞는다.
  2. 흄 후드에서 클로로포름 중 적어도 2 부분으로 섞는다. 그것은 튜브 클로로포름 내성 여부를 사전에 확인하는 것이 중요합니다.
  3. 철저하게 믹스와 상 분리를 가속화하기 위해 2,000 XG에서 1 분 동안 원심 분리.
  4. 원심 분리 후, 메틸 녹색 상부 수 성상을 클로로포름으로 하부 유기상과 일반적인 오염물 크리스탈 바이올렛이 얻어진다.
  5. 위의 위상을 복구하고 낮은 단계는 크리스탈 바이올렛의 완전히없는 나타날 때까지이 단계를 반복합니다.
  6. 마지막에, 상부 상을 회수하고, 2 % 메틸 그린의 최종 농도로 물에 희석 하였다. 이 원액 개월 작업대에 안정하고 빛으로부터 보호 될 필요가 없다.

  1. 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 (파라 포름 알데히드)에서 하룻밤에 4 % 포름 알데히드 배아를 수정.
    참고 :이 몇 시간 걸릴 수 있습니다 하룻밤 배아의 두께에 따라합니다. 예를 들어, 우리는 밤새 48 시간 후 수정 (HPF) 제브라 피쉬 배아를 고정.
  2. 5 분 동안 PBS-T (PBS에 1 % 트리톤 X-100)에 배아를 세 번 씻으십시오. 세제의 상승 된 농도는 표피를 permeabilizes.
  3. 5,000-1 : PBS-T (2 %의 원액)에서 메틸 녹색 10,000 용액 1을 준비합니다. 배양시 세제의 존재는 제브라 피쉬 배아 및 유충 두꺼운 시편에 유용합니다.
  4. 부드럽게 흔들와, 4 ° C에서 적어도 6 시간 동안 용액에서 배아를 인큐베이션. 또, 배아의 두께는 배양 길이 교정 파라미터이다.
  5. 배아 3 팀을 씻으십시오30 분 동안 PBS로 ES는 세제 초과를 제거합니다. DNA에 결합시 메틸 녹색 형광 만 명백하고, 결합되지 않은 분자로부터 따라서 백그라운드는 무시할 수있다.
  6. 발굴 슬라이드 또는 설치 솔루션을 만든 실에 산 (75 % 글리세롤, 0.1 M 트리스 · 염산의 pH 8).
    참고 : 핵 염색이 immunolabeling 이후에 수행 될 경우, 메틸 녹색이 그것을 씻어 할 필요없이, 작업 농도 장착 솔루션에 통합 할 수 있습니다.
  7. 스토어 냉장 또는 즉시 영상을 시작합니다. 650-750 nm의 녹색의 발광은 677 nm에서 최대가 상기 메틸 고려에 등록 설정 및 633 nm의 방출 필터와 함께 여기에 레이저 스캐닝 공 초점 (또는 다른 형광) 현미경으로 촬영을 수행한다.
    주 : 우리는 메틸 녹색 발광 프로파일의 측정 데이터, 보충 자료로서 수집 소프트웨어에로드 될을 제공한다.

3. 형광 핵 세인트메틸 녹색을 사용하여 항목의 병아리 태아의 aining

  1. 관심의 단계로 수정 된 암탉이 알을 품어. 4 ℃에서 하룻밤 PBS에서 (파라 포름 알데히드)에서 4 % 포름 알데히드의 배아를 수정. 2 시간 동안 PBS-T에서 배아 3 회 반복한다.
  2. 5,000-1 : PBS-T (2 %의 원액)에서 메틸 녹색 10,000 용액 1을 준비합니다. 밤새 4 ℃에서 염색 액에 배아를 품어. 배아에게 PBS 3 회, 1 시간 각을 씻으십시오. 75 % 글리세롤, 0.1 M 트리스, pH가 8 실의 산.

4. 이미지 찬란는 전체 마운트 배아에서 핵을 레이블

  1. 조심스럽게 현미경 슬라이드를 통해 전기 테이프의 여러 층을 고집에 의해 영상 실 준비는 내 배아를 배치 메스로에 구멍을 잘라. 이 영상 중에 분쇄에서 배아를 방지 할 수 있습니다.
  2. 조심스럽게 75 % 글리세롤, 0.1 M 트리스 -HCl, pH가 8 위로 챔버 촬상 챔버 배아를 전송하고 채우기무효 거품 형성.
  3. # 0 커버 슬립은 피하거나 매체 넘치는 제거와 커버. 매니큐어와 인감.
  4. 여기 필터 (633) 또는 레이저 라인을 구비 한 형광 현미경에서 시료의 이미지를 수집.
    참고 : 배출 필터는 메틸 녹색의 677 방출 최대를 포함해야한다.

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Representative Results

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두꺼운 시편의 핵 염색. 여기에 설명 된 프로토콜은 전체 배아 깊은 구조의 균일 한 염색의 달성을 허용한다. 개발 렌즈 핵 양식 (48) HPF 제브라 피쉬 배아 균일 (그림 1) 표시되어 있습니다.

메틸 녹색 DNA 염색은 유사 분열 또는 세포 사멸 핵 (그림 2A)의 식별로 세포주기에 의존 형태 학적 차이의 차별을 할 수 있습니다. 제브라 피쉬 배아 (그림 2B)의 표피 핵에 대한 그림과 같이 높은 해상도에서 Subnuclear 구조도 분명 있습니다.

메틸 녹색이 장시간 고휘도로 조사시 photobleaching에 강하다. 동일한 강도로 633 nm의 레이저 광을 조사 할 때 또 다른 특정 DNA 염색 공유 유사한 스펙트럼 특성의 경우는 TO-PRO-3이므로, 메틸 녹색 핵 염색 아웃 표백하지4. 전체 장착 지브라 피쉬 배아 망막의 촛점 평면이 선택된 높은 조사를 달성하기 63X 1.4NA 목적으로 확대 하였다. 축소 할 때, 표본 염색 TO-PRO-3 보였다 메틸 녹색으로 염색 표본이 동일한 조건에서도 120 초 photobleaching에의 눈에 보이는 증거가 없었다 동안, 연속 조사 (그림 3, 상단 패널) 60 초 이내에 표백 (그림 3, 낮은 패널). 피지 오픈 소스 소프트웨어 (http://fiji.sc/)를 사용하여 LASAF 소프트웨어에서 획득 된 영상 추가 (최대 강도 투사; 3 차원 복원 밝기 / 명암 ​​대비)를 처리 하였다.

그림 1
그림 1 :. 메틸 녹색 깊은 구조의 균일 핵 염색 Z 프로젝션 O를 메틸 그린 (MG)로 염색 48 HPF 제브라 피쉬 배아의 렌즈 개발20 공 초점면 (F). 배아는 TRITC - 복합 팔로이 딘 (스 팔)와 F - 굴지에 대한 대조되었다. 스케일 바 : 15 μm의.

그림 2
그림 2 : 핵 형태와 메틸 녹색 염색) 48 HPF 제브라 피쉬 배아의 표피에서 다른 핵 형태학와 subnuclear 해상도.. MG, 메틸 녹색. 시편은 TRITC-팔로이 딘과 F - 굴지에 대한 대조되었다. 화살촉 : 유사 분열 세포. 10 공 초점 평면의 최대 강도 투사. 유사 분열 세포 (화살촉)와 pyknotic 핵 (화살표)를 표시 같은 방식으로 표시 B) 병아리 배아 신경 판. 단일 공 초점면. C) subnuclear 해상도의 고도를 나타내는 고배율에서 지브라 피쉬 배아 표피 핵의 3 개의 단일 촛점 평면. 스케일 바 : 15 μm의; (B), 5 μm의; C, 1 ㎛.


그림 3 :. 48 HPF 제브라 피쉬 망막의 연속 여기에서 메틸 녹색의 광 안정성 TO-PRO-3-스테인드 핵은 633 nm의 (상단 패널)에서 연속 여자의 60 초에 표백했다. 노출 시간 (하단 패널)을 복제하는 경우에도 동일한 조건으로, 메틸 그린 염색 배아 (MG)는, 지각 표백을 나타내지 않았다. 표백 및 인수는 8,000 Hz에서, 30 %의 레이저 파워 라인 (X2) 및 프레임 (4 개) 평균에, 하나의 평면에 스캔에 의해 만들어졌다. 스케일 바 : 30 μm의.

파장 (㎚) 퍼센트 방출
(640) 21.37
(643) 27.5
(646) 36.69
44.47
(652) 53.92
(655) 61.82
(658) 67.86
(661) 83.2
(664) 85.22
667 89.45
(670) 87.33
(673) 92.3
(676) (100)
679 97.41
(682) 90.34
685 83.32
78.37
691 76.09
694 73.95
697 67.36
(700) 64.4
(703) 61.26
(706) 56.39
(709) 55.06
(712) 49.56
(715) 46.​​12
(718) 41.4
(721) 38.8
(724) 35.97
33.27
(730) 30.95
(733) 28.78
(736) 26.28
(739) 24.96
(742) 23.3
(745) 21.12
748 19.86
(751) 17.47
(754) 16.14
757 14.21
(760) 12.45
763 11.49
9.97
769 7.55
(772) 7.75
(775) 6.46
(778) 5.76
(781) 4.38
(784) 2.6
787 2.75
(790) 2.27
793 1.52
796 0

보충 자료 1 : 633 nm의 여기에서 메틸 녹색 핵 염색의 발광 스펙트럼.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Methyl green Dr. G. Grübler Also tested Sigma-Aldrich 323829, which is crystal violet-free
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Laser scanning confocal microscopy Leica TCS-SP5 Leica Microsystems
Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma-Aldrich
P1951 
chloroform Sigma-Aldrich 372978
Centrifuge 5810 R eppendorf 5811 000.010  
microscope slides Deltalab D100004
cover slips Esco optics R525025

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References

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Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769, doi:10.3791/52769 (2015).More

Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769, doi:10.3791/52769 (2015).

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