Protocol
1. La purification du colorant
- Préparer une solution aqueuse à 4% de vert de méthyle par dissolution de 0,4 g de poudre de colorant dans 10 ml d'eau distillée. Mélanger soigneusement jusqu'à obtention d'dissoudre.
- Sous un hottes, mélanger avec au moins 2 parties de chloroforme. Il est important de vérifier au préalable si les tubes sont résistants chloroforme.
- Mélanger soigneusement et centrifuger pendant 1 min à 2000 xg pour accélérer la séparation de phase.
- Après centrifugation, une phase supérieure aqueuse avec du vert de méthyle et une phase organique inférieure avec du chloroforme et du cristal violet de contaminant sont obtenus d'habitude.
- Récupérer la phase supérieure et répétez cette étape jusqu'à la phase inférieure apparaît totalement dépourvu de cristal violet.
- A la fin, la phase supérieure est récupérée et diluée dans de l'eau à une concentration finale de 2% de vert de méthyle. Cette solution stock est stable sur le plan de travail pour les mois et n'a pas besoin d'être protégé de la lumière.
- Fixer les embryons pendant une nuit à 4% de formaldehyde (à partir de paraformaldehyde) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
NOTE: Cela peut prendre de quelques heures à la nuit en fonction de l'épaisseur des embryons. Dans l'exemple, nous avons fixé 48 h après la fécondation (HPF) embryons de poisson zèbre nuit. - Laver les embryons trois fois dans du PBS-T (1% de Triton X-100 dans du PBS) pendant 5 min. La concentration élevée de détergent perméabilise la cuticule.
- Préparer une solution à 1: 10.000 de vert de méthyle (à partir de 2% de solution de stock) dans du PBS-T: 5,000-1. La présence d'un détergent au cours de l'incubation est utile pour les échantillons épais, tels que des embryons de poisson zèbre et les larves.
- Incuber les embryons dans la solution pendant au moins 6 heures à 4 ° C, avec des doux balancement. Encore une fois, l'épaisseur de l'embryon est le paramètre d'étalonnage de la longueur de l'incubation.
- Laver les embryons 3 times avec du PBS pendant 30 min pour éliminer l'excès de détergent. Méthyl fluorescence verte est seulement évidente quand il est lié à l'ADN, donc fond à partir de la molécule non liée est négligeable.
- Monter sur une lame de fouilles ou d'une chambre maison avec une solution de montage (75% de glycérol, 0,1 M Tris.HCl pH 8).
NOTE: Si la coloration nucléaire doit être effectué après immunomarquage, vert de méthyle peut être incorporé à la solution de montage à la concentration de travail, sans avoir besoin de le laver. - Conserver au réfrigérateur ou démarrer imagerie immédiatement. Effectuer imagerie avec un confocal à balayage laser (ou autre fluorescence) microscope avec une excitation à 633 nm et de filtres d'émission fixés à inscrire à 650-750 nm en tenant compte que le méthyl émission verte atteint son maximum à 677 nm.
NOTE: Nous fournissons les données mesurées du profil de méthyle d'émission verte, à être chargées dans le logiciel d'acquisition, comme matériel supplémentaire.
3. Fluorescent nucléaire StAining plénier embryons de poulet en utilisant vert de méthyle
- Incuber les œufs de poule fécondés au stade de l'intérêt. Fixer les embryons nuit à 4% de formaldéhyde (de paraformaldéhyde) dans du PBS à 4 ° C. Laver les embryons trois fois dans du PBS-T pendant 2 heures.
- Préparer une solution à 1: 10.000 de vert de méthyle (à partir de 2% de solution de stock) dans du PBS-T: 5,000-1. Incuber les embryons dans la solution de coloration nuit à 4 ° C. Laver les embryons 3 fois en PBS, 1 heure chacun. Mont dans la chambre avec 75% de glycerol, 0,1 M de Tris, pH 8.
4. imagerie marqué par fluorescence des noyaux dans des embryons entiers monté
- Préparer une chambre d'imagerie par collage de plusieurs couches de ruban isolant sur une lame de microscope et soigneusement découper un trou dans le avec un scalpel pour placer les embryons à l'intérieur. Cela permettra d'éviter des embryons de l'écrasement lors de l'imagerie.
- Soigneusement transférer les embryons à la chambre de l'imagerie et de remplir la chambre vers le haut avec 75% de glycérol, 0,1 M de Tris-HCl, pH = 8 à unvide la formation de bulles.
- Couvrir avec un # 0 lamelle en évitant ou en éliminant débordement moyenne. Sceller avec du vernis à ongles.
- Acquérir des images de l'échantillon sur un microscope à fluorescence équipé d'un filtre 633 ou la ligne d'excitation au laser.
REMARQUE: les filtres d'émission devraient couvrir le maximum 677 d'émission de vert de méthyle.
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Representative Results
Coloration nucléaire des échantillons épais. Le protocole décrit ici permet la réalisation de coloration homogène de structures profondes dans des embryons entiers. Lentilles développement former des noyaux 48 hpf embryons de poisson zèbre sont étiquetés de façon homogène (figure 1).
Vert de méthyle coloration de l'ADN permet la discrimination des différences morphologiques dépendants du cycle cellulaire tels que l'identification des figures de mitose ou noyaux apoptotiques (figure 2A). Subnucléaires structures à haute résolution sont également évidents comme indiqué pour les noyaux épidermiques des embryons de poisson zèbre (figure 2B).
vert de méthyle est résistant au photoblanchiment sous irradiation à haute intensité pendant des périodes de temps prolongées. Lorsqu'il est irradié avec une lumière laser de 633 nm à la même intensité, méthyle coloration nucléaire vert ne blanchir pas comme il est le cas d'un autre partage des taches spécifique de l'ADN caractéristiques spectrales similaires, TO-PRO-34. Un plan confocal de la rétine de l'ensemble monté sur un embryon de poisson zèbre a été sélectionné et agrandie avec un objectif 63x 1.4NA pour atteindre la haute irradiation. Lorsque vous zoomez sur, les spécimens colorés avec TO-PRO-3 a montré blanchiment dans les 60 secondes d'irradiation continue (figure 3, panneaux supérieurs), tandis que les spécimens colorés de vert de méthyle montré aucun signe visible de photoblanchiment même à 120 secondes dans les mêmes conditions (Figure 3, panneaux inférieurs). Les images acquises dans le logiciel Lassaf ont été traitées ultérieurement (luminosité / contraste, la reconstruction 3D; projection d'intensité maximale) en utilisant Fidji logiciels open source (http://fiji.sc/).
Figure 1:. Coloration nucléaire homogène de structures profondes de vert de méthyle Le développement d'une 48 lentille HPF embryon de poisson zèbre coloré au vert de méthyle (MG) dans une projection z-of 20 plans confocales. Les embryons ont été contre-F-actine avec phalloidin TRITC-conjugué (Phal). Barre d'échelle: 15 um.
Figure 2: la morphologie nucléaire et la résolution subnucléaire avec le vert de méthyle coloration A) des morphologies différentes nucléaires dans l'épiderme d'un embryon de poisson zèbre 48 HPF.. MG, vert de méthyle. Les échantillons ont été contre-F-actine avec TRITC-phalloïdine. Arrowhead: mitotique. Projection d'intensité maximale de 10 avions confocale. B) Chick embryon plaque neurale marqué de la même manière, en affichant les cellules en mitose (pointes de flèche) et les noyaux pycnotiques (flèches). Plan confocal unique. C) Trois avions de confocale simples d'un noyau embryon de poisson zèbre épidermique à fort grossissement, montrant un degré élevé de résolution subnucléaire. Les barres d'échelle: A, 15 um; B, 5 pm; C, 1 um.
Figure 3:. Photostabilité de vert de méthyle sous excitation continue TO-PRO-3-colorant le noyau de la rétine de poisson zèbre 48 hpf été blanchis lors de 60 secondes d'excitation continue à 633 nm (panneaux supérieurs). Dans les mêmes conditions, un embryon méthyle teinté vert (MG) n'a pas montré de blanchiment perceptible, même lors de la duplication du temps d'exposition (panneaux inférieurs). Blanchiment et l'acquisition a été faite par le balayage dans des plans simples, à 8000 Hz, 30% de la puissance du laser et de la ligne (x2) et le cadre (x4) moyenne. Barre d'échelle: 30 um.
| Longueur d'onde (nm) | Pour cent des émissions |
| 640 | 21.37 |
| 643 | 27,5 |
| 646 | 36.69 |
| 44.47 | |
| 652 | 53.92 |
| 655 | 61.82 |
| 658 | 67.86 |
| 661 | 83,2 |
| 664 | 85.22 |
| 667 | 89.45 |
| 670 | 87.33 |
| 673 | 92,3 |
| 676 | 100 |
| 679 | 97.41 |
| 682 | 90.34 |
| 685 | 83.32 |
| 78.37 | |
| 691 | 76.09 |
| 694 | 73.95 |
| 697 | 67.36 |
| 700 | 64,4 |
| 703 | 61.26 |
| 706 | 56.39 |
| 709 | 55.06 |
| 712 | 49.56 |
| 715 | 46.12 |
| 718 | 41,4 |
| 721 | 38,8 |
| 724 | 35.97 |
| 33.27 | |
| 730 | 30.95 |
| 733 | 28.78 |
| 736 | 26.28 |
| 739 | 24.96 |
| 742 | 23,3 |
| 745 | 21.12 |
| 748 | 19.86 |
| 751 | 17,47 |
| 754 | 16.14 |
| 757 | 14.21 |
| 760 | 12.45 |
| 763 | 11.49 |
| 9,97 | |
| 769 | 7,55 |
| 772 | 7,75 |
| 775 | 6.46 |
| 778 | 5,76 |
| 781 | 4.38 |
| 784 | 2.6 |
| 787 | 2.75 |
| 790 | 2.27 |
| 793 | 1.52 |
| 796 | 0 |
Matériel supplémentaire 1: spectre d'émission de méthyle coloration nucléaire verte sous excitation 633 nm.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Methyl green | Dr. G. Grübler | Also tested Sigma-Aldrich 323829, which is crystal violet-free | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Laser scanning confocal microscopy Leica TCS-SP5 | Leica Microsystems | ||
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 |
|
| chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 5811 000.010 | |
| microscope slides | Deltalab | D100004 | |
| cover slips | Esco optics | R525025 |
References
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