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Developmental Biology

胚の蛍光標識でDNA特異的染色メチルグリーンの応用

doi: 10.3791/52769 Published: May 2, 2015

Protocol

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色素の1精製

  1. 10mlの蒸留水で汚れ粉末0.4グラムを溶解することにより、メチルグリーンの4%水溶液を調製します。それを完全に溶解するまで十分に混合します。
  2. ヒュームフードの下で、クロロホルムの少なくとも2部とそれを混ぜます。これは、チューブがクロロホルム耐性があるかどうかを事前に確認することが重要です。
  3. 十分に混合し、相分離を促進するために2,000×gで1分間遠心します。
  4. 遠心分離後、メチルグリーンと上部の水相、クロロホルム、通常汚染物質クリスタルバイオレットと下層の有機相が得られます。
  5. 上相を回収し、下相は、クリスタルバイオレットを完全に欠い表示されるまで、この手順を繰り返します。
  6. 終了時に、上相を回収し、2%のメチルグリーンの最終濃度まで水で希釈しました。このストック溶液を、ヶ月間作業台の上に安定であり、光から保護される必要がありません。

  1. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の(パラホルムアルデヒドから)4%ホルムアルデヒド中で一晩胚を修正しました。
    注:これは一晩胚の厚さに応じてするのに数時間かかることがあります。例では、一晩の48時間後に受精(HPF)ゼブラフィッシュの胚を固定しました。
  2. 5分間、PBS-T(PBS中1%のTriton X-100)中で胚を3回洗浄します。界面活性剤の高濃度は、キューティクルを透過性に。
  3. 5,000-1:PBS-T(2%ストック溶液から)メチルグリーン10,000溶液1を調製します。インキュベーション中の界面活性剤の存在は、ゼブラフィッシュの胚および幼生のような厚い標本のために有用です。
  4. 緩やかに揺り動かしながら、4℃で少なくとも6時間溶液中で胚を培養します。ここでも、胚の厚さは、培養時間の長さのための校正パラメータです。
  5. 胚3ティムを洗います洗剤過剰を取り除くために30分間、PBSでES。 DNAに結合した場合にメチルグリーン蛍光は、したがって、非結合分子からのバックグラウンドは無視できる、唯一のは明白です。
  6. 出土したスライドや実装溶液と自家製室(75%グリセロール、0.1Mトリス·塩酸pHは8)にマウント。
    注:核染色は免疫標識後に行われる場合、メチルグリーン、それを洗い流す必要なしに、使用濃度に取り付け溶液に組み込むことができます。
  7. ストアは、冷蔵またはすぐに撮影を開始します。レーザー走査共焦点(または他の蛍光)メチルグリーン発光は677 nmで最大となることを考慮して650〜750 nmに登録するように設定さ633 nmおよび発光フィルターで励起し顕微鏡で撮影を行います。
    注:私たちは、補足資料として、取得ソフトウェアにロードされるメチルグリーン発光プロファイルの測定データを、提供します。

3.蛍光原子力セントメチルグリーンを用いた全ニワトリ胚のaining

  1. 興味のあるステージに受精鶏卵をインキュベートします。 4℃で一晩、PBS中(パラホルムアルデヒドから)4%ホルムアルデヒド中で胚を修正しました。 2時間の胚をPBS-Tで3回洗浄します。
  2. 5,000-1:PBS-T(2%ストック溶液から)メチルグリーン10,000溶液1を調製します。 4℃で一晩染色液中の胚を培養します。胚をPBSで3回、1時間ごとに洗浄します。 75%グリセロール、0.1Mトリス、pHが8と、チャンバ内のマウント。

4.イメージング蛍光が全体に取り付けられた胚中の核を標識

  1. 顕微鏡スライド上に電気テープのいくつかの層を貼り合わせて画像化チャンバを準備し、慎重内の胚を配置するメスでそれに穴をカット。これは、撮像中に破砕から胚を防ぐことができます。
  2. 慎重に75%グリセロール、0.1 Mトリス-HCl、pH値= 8でトップにチャンバーを撮像チャンバーに胚を移し、フィルボイドバブル形成。
  3. メディア溢れを回避または除去する#0カバーガラスでカバーしています。マニキュアでそれを封印。
  4. 633励起フィルターやレーザーラインを装備した蛍光顕微鏡で標本の画像を取得します。
    注:発光フィルタは、メチルグリーンの677発光極大をカバーする必要があります。

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Representative Results

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厚い試料の核染色。本明細書に説明されたプロトコルは、全胚における深部構造の均一な染色を達成することができます。レンズの開発48 HPFのゼブラフィッシュ胚が均一に標識されている核の形態( 図1)。

メチルグリーンDNA染色は、有糸分裂像やアポトーシス核の識別( 図2A)のような、細胞周期依存性の形態学的な違いの識別を可能にします。ゼブラフィッシュ胚( 図2B)の表皮核のために示したように、高解像度の核内構造も明らかです。

メチルグリーンは、長期間にわたって高強度の照射下で光退色に対して耐性があります。同じ強度で633nmのレーザー光を照射するとき、それは同様のスペクトル特性を共有する別のDNA特異的染色の場合のように、メチルグリーン核染色は、TO-PRO-3、アウト漂白しません4。全体に取り付けられたゼブラフィッシュ胚の網膜の共焦点面を選択し、高い照射を実現するために63X 1.4NA目的でズームしました。ズームアウトするとメチルグリーンで染色された検体は、同じ条件であっても120秒で退色の目に見える証拠を示さなかった、TO-PRO-3で染色した標本は、( 図3、上のパネル)連続照射の60秒以内に漂白を示しました( 図3、下のパネル)。フィジーオープンソースソフトウェア(http://fiji.sc/)を使用してLASAFソフトウェアで取得された画像は、さらに、(最大値投影; 3D再構成明るさ/コントラストを)処理しました。

図1
図1:メチルグリーンと深部構造の均一な核染色は、z投影Oでメチルグリーン(MG)で染色した48 HPFのゼブラフィッシュ胚のレンズの開発します20、共焦点平面F。胚をTRITC共役ファロイジン(PHAL)とF-アクチンのために対比染色しました。スケールバー:15μmです。

図2
図2:核の形態およびメチルグリーン染色 A)48 HPFのゼブラフィッシュ胚の表皮内の異なる核形態を有する核内の解像度。。 MG、メチルグリーン。標本はTRITCファロイジンでF-アクチンために対比染色しました。アローヘッド:有糸分裂細胞。 10共焦点面の最大強度投影。有糸分裂細胞(矢印)と濃縮した核(矢印)を表示するのと同じ方法で標識されたB)ニワトリ胚神経板、。単一の共焦点面。 C)核内分解能の高度を示す高倍率でゼブラフィッシュ胚表皮核の3つの単焦点面、。スケールバー:A、15ミクロン; B、​​5ミクロン。 C、1ミクロン。


図3:48 HPFのゼブラフィッシュ網膜の連続励起下メチルグリーンの光安定 TO-PRO-3-染色された核は、633 nmの(上のパネル)での連続励起の60秒の際に漂白しました。露光時間(下のパネル)を複製​​する場合でも、同じ条件で、メチルグリーン染色胚(MG)は、知覚漂白を示さありませんでした。漂白及び取得は8,000ヘルツ、30%のレーザー出力とライン(×2)とフレーム(×4)、平均で、単一の平面内で走査することによって作製しました。スケールバー:30μmです。

波長(nm) パーセント放出
640 21.37
643 27.5
646 36.69
44.47
652 53.92
655 61.82
658 67.86
661 83.2
664 85.22
667 89.45
670 87.33
673 92.3
676 100
679 97.41
682 90.34
685 83.32
78.37
691 76.09
694 73.95
697 67.36
700 64.4
703 61.26
706 56.39
709 55.06
712 49.56
715 46.​​12
718 41.4
721 38.8
724 35.97
33.27
730 30.95
733 28.78
736 26.28
739 24.96
742 23.3
745 21.12
748 19.86
751 17.47
754 16.14
757 14.21
760 12.45
763 11.49
9.97
769 7.55
772 7.75
775 6.46
778 5.76
781 4.38
784 2.6
787 2.75
790 2.27
793 1.52
796 0

補足材料1:633 nmの励起下でメチルグリーン核染色の発光スペクトル。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Methyl green Dr. G. Grübler Also tested Sigma-Aldrich 323829, which is crystal violet-free
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Laser scanning confocal microscopy Leica TCS-SP5 Leica Microsystems
Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma-Aldrich
P1951 
chloroform Sigma-Aldrich 372978
Centrifuge 5810 R eppendorf 5811 000.010  
microscope slides Deltalab D100004
cover slips Esco optics R525025

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References

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Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769, doi:10.3791/52769 (2015).More

Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769, doi:10.3791/52769 (2015).

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