Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Bruk av DNA-Specific Stain Methyl Grønn i Fluorescent Merking av embryoer

doi: 10.3791/52769 Published: May 2, 2015

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Rensing av fargestoffet

  1. Tilbered en 4% vandig løsning av metyl-grønt ved å oppløse 0,4 g av flekken pulver i 10 ml destillert vann. Bland godt til det er helt oppløse den.
  2. Under en avtrekks-hette, bland det med minst to deler av kloroform. Det er viktig å kontrollere hvorvidt forhånd er rørene kloroform resistente.
  3. Bland godt og sentrifuger i 1 min ved 2000 x g for å akselerere faseseparasjon.
  4. Etter sentrifugering blir en øvre vandig fase med metylgrønt og en nedre organisk fase med kloroform og vanlig kontaminant krystallfiolett oppnådd.
  5. Gjenopprette den øvre fase og gjenta dette trinnet til lavere fase vises helt blottet for krystallfiolett.
  6. Ved slutten er den øvre fase gjenvinnes og fortynnet i vann til en sluttkonsentrasjon på 2% metyl-grønn. Denne stamoppløsning er stabil på arbeidsbenken i flere måneder, og trenger ikke å bli beskyttet mot lys.

  1. Fest embryoene over natten i 4% formaldehyd (fra paraformaldehyd) i fosfatbufret saltvann (PBS).
    Merk: Dette kan ta fra noen få timer til over natten, avhengig av tykkelsen av embryoene. I eksemplet faste vi 48 timer etter befruktning (HPF) sebrafisk embryo over natten.
  2. Vask embryoene tre ganger i PBS-T (1% Triton X-100 i PBS) i 5 min. Forhøyet konsentrasjon av vaskemiddel permeabilizes skjellaget.
  3. Forbered en 1: 5,000-1: 10.000 løsning av methyl grønt (fra 2% stamløsning) i PBS-T. Tilstedeværelsen av vaskemiddel under inkuberingen er nyttig for tykke prøver, slik som sebrafisk embryoer og larver.
  4. Inkuber embryoene i løsningen i minst 6 timer ved 4 ° C, med milde rocking. Igjen, er tykkelsen av embryoet kalibreringsparameter for lengden av inkuberingen.
  5. Vask embryoene 3 times med PBS i 30 minutter for å fjerne vaskemiddel overflødig. Metyl grønn fluorescens er bare tydelig når det er bundet til DNA, er følgelig bakgrunn fra den ubundne molekylet ubetydelig.
  6. Mount på en utgravd lysbilde eller en hjemmelaget kammer med monteringsløsning (75% glyserol, 0,1 M Tris-HCl pH 8).
    MERK: Hvis nukleær farging som skal utføres etter immunolabeling kan metylgrønt inkorporeres til monterings løsning ved arbeids konsentrasjon, uten behov for å vaske det bort.
  7. Oppbevares i kjøleskap eller starte bilde umiddelbart. Utføre bildebehandling med en laser scanning confocal (eller annen fluorescens) mikroskop med eksitasjon ved 633 nm og emisjonsfiltre satt til å registrere seg på 650-750 nm tar hensyn til at metylgrønt utslipp har nådd sitt maksimum på 677 nm.
    MERK: Vi gir de målte data for metylgrønt utslippsprofil, for å legges i oppkjøpet programvare, som supplerende materiale.

3. Fluorescent Nuclear Stinnelukker av Whole Chick Embryoet hjelp metylgrønt

  1. Ruge befruktede hønseegg til scenen av interesse. Fix embryoene over natten i 4% formaldehyd (fra paraformaldehyde) i PBS ved 4 ° C. Vask embryoer 3 ganger i PBS-T i 2 timer.
  2. Forbered en 1: 5,000-1: 10.000 løsning av methyl grønt (fra 2% stamløsning) i PBS-T. Inkuber embryoene i fargeløsning over natten ved 4 ° C. Vask embryoene tre ganger i PBS, 1 time hver. Høyden i kammeret med 75% glycerol, 0,1 M Tris, pH 8.

4. Imaging fluorescensmerkede Nuclei i Whole montert Embryoet

  1. Forbered en bildekammeret ved å stikke flere lag med elektriske tape over et objektglass og nøye skjære et hull i den med en skalpell til å plassere embryoene innenfor. Dette vil hindre embryoer fra knusing under bildebehandling.
  2. Nøye overføre embryoene avbildnings kammeret og fylle kammeret til toppen med 75% glycerol, 0,1 M Tris-HCl, pH = 8 til entomrommet bobledannelse.
  3. Dekk med en # 0 dekk unngå eller eliminere medium fylte. Forsegle den med neglelakk.
  4. Hente bilder av prøven på en fluorescens mikroskop utstyrt med en 633 eksitasjonsfilteret eller laserlinje.
    MERK: Utslipps filtre bør dekke 677 utslipp maksimalt metyl grønt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Nuclear farging av tykk prøver. Protokollen beskrevet her gjør for å oppnå homogen farging av dype strukturene i hele embryoer. Utviklingslinse kjerner skjema 48 HPF sebrafisk embryo er homogent merket (figur 1).

Metylgrønt DNA farging tillater diskriminering av cellesyklusavhengig morfologiske forskjeller som identifisering av mitotiske figurer eller apoptotiske kjerner (figur 2A). Subnuclear strukturer med høy oppløsning er også tydelig som vist for epidermal kjerner av sebrafisk embryo (figur 2B).

Metylgrønt er motstandsdyktig mot fotobleking under høy-intensitet-bestråling i lengre perioder av gangen. Når de bestråles med 633 nm laserlys ved samme intensitet, betyr metyl grønn nukleær farging ikke bleke ut som det er tilfellet med en annen DNA-spesifikk flekk deling lignende spektrale karakteristika, TO-Pro-3-4. En confocal planet av netthinnen av en hel montert sebrafisk embryo ble valgt og zoomet inn med en 63x 1.4NA mål å oppnå høy bestråling. Når zoomet ut, prøvene farget med TO-PRO-3 viste bleking innen 60 sekunder med kontinuerlig bestråling (figur 3, øverste panelene), mens prøvene farget med metylgrønt viste ingen synlige tegn på fotobleking selv på 120 sekunder i samme forhold (figur 3, nedre paneler). Bilder ervervet i LASAF programvare ble videre bearbeidet (lysstyrke / kontrast, 3D rekonstruksjon, maksimal intensitet projeksjon) bruker Fiji åpen kildekode (http://fiji.sc/).

Figur 1
Figur 1:. Homogen atom farging av dype strukturer med metylgrønt Utvikling linse av en 48 HPF sebrafisk embryo farget med metylgrønt (MG) ​​i en z-projeksjon of 20 konfokale flyene. Embryoer ble kontra for F-aktin med TRITC-konjugert phalloidin (Phal). Skala: 15 mikrometer.

Figur 2
Figur 2: Nuclear morfologi og subnuclear oppløsning med metyl grønne flekker A) Ulike atom morfologi i epidermis av en 48 HPF sebrafisk embryo.. MG, metyl grønt. Prøver som ble kontra for F-aktin med TRITC-phalloidin. Arrowhead: mitotiske celle. Maksimal intensitet projeksjon av 10 konfokale flyene. B) fra kyllingembryo neural plate merket på samme måte, viser mitotiske celler (pilhoder) og pyknotic atomkjerner (piler). Enkelt konfokalt flyet. C) Tre enkelt konfokale plan av en sebrafisk embryo epidermal kjernen ved høy forstørrelse, og viser en høy grad av subnuclear oppløsning. Skala barer: A, 15 mikrometer; B, 5 mikrometer; C, 1 mikrometer.


Figur 3:. Fotostabilitet av metylgrønt under kontinuerlig eksitasjon TO-PRO-3-farget kjerner av en 48 HPF sebrafisk netthinnen ble bleket på 60 sek kontinuerlig eksitasjon ved 633 nm (øverste panelene). Under samme vilkår, gjorde en metyl grønn-farget embryo (MG) ikke viser merkbar bleking, selv når duplisere eksponeringstiden (nedre paneler). Bleking og oppkjøpet ble gjort ved å skanne i enkle fly, på 8000 Hz, 30% laser makt og linje (x2) og rammen (x4) i snitt. Skala: 30 mikrometer.

Bølgelengde (nm) Prosent utslipp
640 21.37
643 27.5
646 36.69
44.47
652 53.92
655 61.82
658 67.86
661 83.2
664 85.22
667 89,45
670 87,33
673 92.3
676 100
679 97,41
682 90.34
685 83,32
78.37
691 76,09
694 73.95
697 67.36
700 64.4
703 61.26
706 56.39
709 55.06
712 49.56
715 46.12
718 41.4
721 38.8
724 35.97
33.27
730 30.95
733 28.78
736 26.28
739 24.96
742 23.3
745 21.12
748 19.86
751 17.47
754 16.14
757 14.21
760 12.45
763 11.49
9.97
769 7,55
772 7,75
775 6.46
778 5.76
781 4,38
784 2.6
787 2,75
790 2,27
793 1,52
796 0

Supplerende materiale 1: emisjonsspekteret av metyl-grønn nukleær farging i henhold til 633 nm eksitasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Methyl green Dr. G. Grübler Also tested Sigma-Aldrich 323829, which is crystal violet-free
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Laser scanning confocal microscopy Leica TCS-SP5 Leica Microsystems
Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma-Aldrich
P1951 
chloroform Sigma-Aldrich 372978
Centrifuge 5810 R eppendorf 5811 000.010  
microscope slides Deltalab D100004
cover slips Esco optics R525025

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klonisch, T., Wark, L., Hombach-Klonisch, S., Mai, S. Nuclear imaging in three dimensions: a unique tool in cancer research. Annals of anatomy. 192, (5), 292-301 (2010).
  2. Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic. 70, (5), 220-233 (1995).
  3. Latt, S. A., Stetten, G. Spectral studies on 33258 Hoechst and related bisbenzimidazole dyes useful for fluorescent detection of deoxyribonucleic acid synthesis. The journal of histochemistry and cytochemistry. 24, (1), 24-33 (1976).
  4. Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: a novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17, (2), 185-189 (1994).
  5. Beumer, T. L., Veenstra, G. J., Hage, W. J., Destrée, O. H. Whole-mount immunohistochemistry on Xenopus embryos using far-red fluorescent dyes. Trends in genetics. 11, (1), 9 (1995).
  6. Prieto, D., Aparicio, G., Morande, P. E., Zolessi, F. R. A fast, low cost, and highly efficient fluorescent DNA labeling method using methyl green. Histochemistry and cell biology. 142, (3), 335-345 (2014).
  7. Kim, S. K., Nordén, B. Methyl green. A DNA major-groove binding drug. FEBS letters. 315, (1), 61-64 (1993).
  8. Nordén, B., Tjerneld, F. Binding of methyl green to deoxyribonucleic acid analyzed by linear dichroism. Chemical Physics Letters. 50, (3), 508-512 (1977).
  9. Lyon, H., Jakobsen, P., Andersen, aP. Standardized methyl green-pyronin Y procedures using pure dyes. The Histochemical journal. 18, (2-3), 90-94 (1986).
  10. Amat, F., Keller, P. J. Towards comprehensive cell lineage reconstructions in complex organisms using light-sheet microscopy. Development, growth & differentiation. 55, (4), 563-578 (2013).
  11. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature methods. 10, (6), 508-5013 (2013).
  12. Lenz, P. Fluorescence measurement in thick tissue layers by linear or nonlinear long-wavelength excitation. Applied. 38, (16), 3662-3669 (1999).
Bruk av DNA-Specific Stain Methyl Grønn i Fluorescent Merking av embryoer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769, doi:10.3791/52769 (2015).More

Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769, doi:10.3791/52769 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter