Sink finger-domener er iboende celle-gjennomtrengelige og i stand til å mediere proteinlevering til et bredt utvalg av pattedyrcelletyper. Her er en detaljert steg-for-steg-protokollen for å implementere sink-finger-teknologien for intracellulær protein levering presentert.
Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.
Svært effektive og allsidige protein levering strategier er kritisk for mange grunnleggende forskning og terapeutiske anvendelser. Den direkte levering av rensede proteiner i celler representerer en av de sikreste og enkleste metoder for å oppnå dette. 1,2 motsetning strategier som er avhengige av genekspresjon fra nukleinsyrer, proteiner utgjør 3-5 levering ingen risiko for insertional mutagenese, er uavhengig av cellulær transkripsjon / oversettelse maskiner og åpner for en umiddelbar effekt. Men forundrer mangelen på enkle og generaliseres metoder for endowing celle-trengende aktivitet på proteiner rutinemessig sine direkte inntreden i cellene. Nåværende metoder for å lette intracellulær proteinlevering er basert på bruk av naturlig forekommende 6-8 eller utformet cellepenetrerende peptider, 9-12 kompressor transduksjon domener, 13,14 nanopartikler 15 og liposomer, 16-viruslignende partikler 17,18 </sup> og polymere mikro materialer. 19 Dessverre er mange av disse tilnærmingene er hemmet av lave cellulært opptak priser, 20,21 dårlig stabilitet, 22 utilsiktet celle-type spesifisitet, 23 lav endosomal rømningsegenskaper 24 og toksisitet. 25 I tillegg er mange protein transduksjon teknologier redusere bioaktiviteten av de leverte proteiner. 14
Vårt laboratorium tidligere vist at sink-finger-nuklease (ZFN) proteiner – kimære restriksjonsendonukleaser som består av en programmerbar Cys to -Hans 2 sink-finger-DNA-bindende protein, og spalting domenet til FoKI restriksjonsendonuklease 26-28 – er iboende celle- 29 Denne overraskende celle-trengende aktivitet ble vist seg å være en iboende egenskap ved spesialdesignede sink-finger domene, et DNA-bindende plattform som har dukket opp som et kraftig verktøy for målrettet genom en gjennomtrengelig.gineering, 30-32 og anses å være et resultat av den konstellasjon av seks positivt ladede rester på proteinoverflaten. Faktisk har flere DNA-bindende proteiner, inkludert c-Jun og N-DEK blitt vist å ha en iboende evne til å krysse cellemembraner. 33 Mer nylig vårt laboratorium utvidet på disse resultater og viste at cellepenetrerende aktivitet av sink- finger (ZIF) domener kan utnyttes for intracellulær protein levering. Genetisk fusjon av enten en- eller to-finger ZIF domener til spesifikke protein last førte til opptak effektivitet som oversteg mange konvensjonelle celletrengende peptid leveringssystemer. 34 Mest spesielt, gjorde ZIF-mediert levering ikke kompromiss aktiviteten av smeltet enzymatisk last og tilrettelagt høye nivåer av cytosolisk levering. Sammen er disse funnene viser potensialet av ZIF domene for tilrettelegging for effektiv og lettvinte levering av proteiner, og potensielt mer varierte typer av makromolekyler, inn i cellene.
Her er en detaljert steg-for-steg-protokoll på hvordan man implementerer ZIF-teknologi for protein levering i pattedyrceller presentert. Vi har tidligere konstruert en pakke med en-, to-, tre-, fire-, fem- og seks-finger-domener Zif som mangler evnen til å binde DNA, på grunn av substitusjon av hver av de α-heliks DNA-bindingsrester, men er i stand til å levere proteiner i celler 34 (figur 1). Produksjon og transduksjon av Emerald GFP (EmGFP) i HeLa celler ved hjelp av en to-finger ZIF domenet er beskrevet. Denne protokollen er utvidbar til nesten hvilken som helst protein i stand til ekspresjon av oppløselig i Escherichia coli, og nesten en hvilken som helst pattedyrcelletype. Forventede resultater er gitt og strategier for å maksimere ytelsen til dette systemet blir også diskutert.
Her er en trinn-for-trinn-protokoll for proteinlevering ved hjelp av celle-gjennomtrengelige sink-finger (Zif) domener presentert. ZIF domene ikke redusere aktiviteten av smeltet enzymatisk last 34; muliggjør for produksjon og rensing av proteiner i utbytter nesten identiske med de som ble observert med ikke-modifisert protein; og kan transportere proteiner og enzymer i en rekke celletyper med effektivitet som overskrider tradisjonelle cellepenetrerende peptid eller protein transduksjon domenesystemer. Samme…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (DP1CA174426 til Carlos F. Barbas) og ShanghaiTech University, Shanghai, Kina (til JL). Molekylære grafikk ble generert ved hjelp PyMol.
XmaI | New England Biolabs | R0180L | |
SacI | New England Biolabs | R0156L | |
Expand High Fidelity PCR system | Roche | 11759078001 | |
dNTPs | New England Biolabs | N0446S | |
4-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells | Life Technologies | EC6028BOX | |
2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 161-0737 | |
T4 DNA Ligase | Life Technologies | 15224-017 | |
BL21 (DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527I | |
IPTG | Thermo Scientific | R0391 | |
Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086-5G | |
Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-25 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
DTT | Fisher Scientific | PR-V3151 | |
PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
Ni-NTA Agarose Resin | QIAGEN | 30210 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513-25G | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMO Millipore | UFC900324 | |
DMEM | Life Technologies | 11966-025 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-028 | |
Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
24-Well Flat Bottom Plate | Sigma-Aldrich | CLS3527-100EA | |
Poly-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
DPBS, No Calcium, No Magnesium | Life Technologies | 21600010 | |
Heparan Sulfate | Sigma-Aldrich | H4777 | |
Trypsin | Life Technologies | 25300054 | |
Hela cells | ATCC | CCL-2 | |
Nano Drop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 |