इलेक्ट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी इमेजिंग के साथ संयोजन में miniSOG गईं डीएनए मरम्मत प्रोटीन के दृश्य (ईएसआई)
Summary
Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.
Abstract
ऑप्टिकल संकल्प और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में विशिष्ट प्रोटीन आबादी की पहचान करने की चुनौती के लिए सीमा कोशिका जीव विज्ञान में बाधाओं किया गया है। कई घटनाएं सरलीकृत प्रणालियों में इन विट्रो विश्लेषण के द्वारा समझाया और पूरी तरह से समझ में आ सकता है, क्रम में विशेष रूप से 1 एनएम और 0.1 माइक्रोन के बीच सीमा में, बगल में अतिरिक्त जानकारी संरचनात्मक जरूरत नहीं किया जा सकता। इधर, इलेक्ट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी इमेजिंग, प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड के वितरण के साथ-साथ मानचित्रण की अनुमति देता है कि एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक, और एक अभिव्यक्ति टैग, miniSOG, डीएनए डबल कतरा तोड़ मरम्मत foci की संरचना और संगठन के अध्ययन के लिए संयुक्त रहे हैं।
Introduction
हाल के वर्षों 1 पर प्रकाश माइक्रोस्कोपी में महत्वपूर्ण प्रगति के बावजूद, सेल जीव अभी भी संकल्प में एक अंतराल से पीड़ित हैं। इस macromolecular परिसर के बीच समन्वित परस्पर क्रिया शामिल है कि मौलिक सेलुलर प्रक्रियाओं में संरचना समारोह संबंधों की समझ की सीमा (जैसे, क्रोमेटिन remodeling, डीएनए की मरम्मत, आरएनए प्रतिलेखन और डीएनए प्रतिकृति में)। संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (मंदिर) की आवश्यकता संकल्प प्रदान है, यद्यपि यह भी कल्पना की संरचनाओं के जैव रासायनिक संरचना का निर्धारण करने में सक्षम होने के साथ ही विशिष्ट प्रोटीन लेबल करने के लिए संरचनात्मक रूप से, क्योंकि अक्षमता की इन प्रक्रियाओं को परिभाषित करने के लिए चुनौती रहा है। परमाणु संरचनाओं अंतर करने में मदद करने के लिए आंतरिक झिल्ली के अभाव में, नाभिक विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण हो गया है। इलेक्ट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी इमेजिंग (ईएसआई) डीएनए, आरएनए और prot के एक साथ पता लगाने और भेदभाव की अनुमति देकर इन सीमाओं से कुछ हल करती हैपरमाणु संरचनाओं 2-5 ein आधारित।
इलेक्ट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी इमेजिंग:
इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में उच्च संवेदनशीलता और संकल्प पर मौलिक वितरण नक्शा करने के लिए आदेश में, एक inelastically नमूना 6 में एक तत्व के भीतरी खोल इलेक्ट्रॉनों के साथ बातचीत के माध्यम से बिखरे हुए किया गया है कि इलेक्ट्रॉनों का चयन करता है कि एक इमेजिंग स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर सकते हैं। ऊर्जा के तत्व-विशिष्ट मात्रा नमूना में परमाणुओं के आयनीकरण का एक परिणाम के रूप में खो जाते हैं, क्योंकि इन इलेक्ट्रॉनों अलग कर दिया और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप से जुड़ा हुआ है कि एक स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर देखे जा सकते हैं। इस प्रकार, नमूना के साथ बातचीत की है कि इलेक्ट्रॉनों के स्पेक्ट्रम का विश्लेषण नमूना 7 की मौलिक रचना के बारे में गुणात्मक और मात्रात्मक जानकारी का पता चलता है। नमूना के माध्यम से गुजर रहा है जब ऊर्जा खोना नहीं है कि इलेक्ट्रॉनों इलेक्ट्रॉन ऊर्जा नुकसान की "शून्य नुकसान पीक" में पाए जाते हैंस्पेक्ट्रम। इन इलेक्ट्रॉनों की बहुतायत नमूना की बड़े पैमाने पर, घनत्व और मोटाई से संबंधित है और नमूना के साथ टकराने या नमूना के माध्यम से पारित होने के दौरान ऊर्जा को खोने के बिना नमूना के माध्यम से पारित है कि इलेक्ट्रॉनों के शामिल है। यह जानकारी नमूना 8 में एक विशिष्ट तत्व वर्तमान के परमाणुओं की संख्या का पूर्ण मात्रा का ठहराव के लिए उपयोगी हो सकता है।
जैविक नमूने भारी धातु का उपयोग ज्यादातर खराब मंदिर की घटना किरण में इलेक्ट्रॉनों मोड़ना है कि प्रकाश तत्वों, धुंधला तरीकों से मिलकर चूंकि लवण नमूने में विपरीत उत्पन्न करने के क्रम में लागू किया जाना है। इन विषम एजेंटों और अक्षमता का सबसे विशिष्टता संभव है, जहां एक से अधिक दाग कल्पना करने की विशिष्टता की कमी नाभिक के अध्ययन में पारंपरिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का मूल्य सीमित है। ईएसआई विशेष रूप से सेल नाभिक के ढांचे के अध्ययन के लिए, पारंपरिक मंदिर से अधिक महत्वपूर्ण लाभ है।यह प्रोटीन परिसरों से nucleoprotein परिसरों भेद करने के लिए और न्यूक्लिक एसिड के अपने घनत्व के आधार पर अलग अलग nucleoprotein परिसरों को हल करने के लिए डीएनए और आरएनए युक्त macromolecular परिसर की फास्फोरस युक्त प्रकृति का दोहन करने के लिए संभव है। शेष जैविक सामग्री नाइट्रोजन के अपने बहुतायत के आधार पर imaged किया जा सकता है। विभिन्न संरचनात्मक ढांचे के भीतर अपने वितरण और रिश्तेदार बहुतायत की मैपिंग सिर्फ इन दो तत्वों और विश्लेषण नाभिक के बारे में जानकारी का एक बहुत कुछ के साथ हमें प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, यह क्रोमेटिन और फास्फोरस बहुतायत का प्रतिनिधित्व नक्शे में राइबोसोम की पहचान करने के लिए आसान है। interchromatin अंतरिक्ष, परमाणु ताकना परिसरों, और परमाणु निकायों, दूसरे हाथ पर, आसानी से नाइट्रोजन नक्शा छवि में पता लगाया जा सकता है।
मिनी स्वेटर ऑक्सीजन जनरेटर प्रणाली (miniSOG)
ईएसआई एक शक्तिशाली तकनीक का प्रतिनिधित्व करता है, वहीं इसे ले क्योंकि सीटू क्रोमेटिन संरचना में अध्ययन करने के लिएफास्फोरस और नाइट्रोजन के बीच मौलिक रचना में विशेषता अनुपात के लाभ, मौलिक रचना सामान्य रूप से प्रोटीन परिसरों के विभिन्न आबादी के बीच भेदभाव करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता। नैनोमीटर रेंज में छोटे से सोने के कणों के साथ लेबल एंटीबॉडी व्यापक रूप से व्यक्तिगत अणुओं के स्थान नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। सोने के कण आमतौर पर एक माध्यमिक एंटीबॉडी से जुड़ा हुआ है, इसलिए यह प्राथमिक एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया मिलान के आसपास लगभग 20 एनएम की परिधि के भीतर प्रदर्शित होगी। पोस्ट-embedding नमूनों में एंटीबॉडी ही वर्गों की सतह पर उजागर कर रहे हैं कि एपिटोप्स पता लगा सकते हैं। यह, प्राप्त जानकारी है कि एक प्रतिजन की उपस्थिति को साबित करने और सेल की एक निश्चित शारीरिक संरचना से संबंधित करना संभव है एपिटोप्स के सबसे राल से छिप कर रहे हैं, के बाद से अधूरा है। भर एंटीजन लिए उपयोग की अनुमति, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के लिए इसी तरह के प्रोटोकॉल का उपयोग तकनीक है, जो पूर्व embeddingनमूने की पूरी गहराई लेकिन आम तौर पर लिपिड झिल्ली को हटाने की आवश्यकता होती है और एल्डीहाइड द्वारा तय नहीं किया जा सकता है कि घटकों को दूर एंटीबॉडी सेल प्रवेश करने की अनुमति के लिए आवश्यक हैं कि permeabilization कदम। इसके अलावा, फैटी संरक्षण, glutaraldehyde के लिए पसंदीदा एल्डिहाइड लगानेवाला, सामान्यतः फलस्वरूप, paraformaldehyde आम तौर पर आवश्यक है, एपिटोप्स को नष्ट कर देता है। यह प्रोटीन, प्रोटीन तिर्यक में कम प्रभावी है। एक सोने nanoparticle के साथ चिह्नित कर रहे हैं कि एंटीबॉडी का एक और नुकसान सोना कमजोर विपरीत है नमूना है, जो की दिलचस्प संरचनात्मक विवरण अस्पष्ट कर सकते हैं कि एक मजबूत विपरीत बनाता है कि एक बहुत ही इलेक्ट्रॉन घने सामग्री है।
एक व्यक्त प्रोटीन टैग के रूप में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के उद्भव कोशिका जीव विज्ञान में सवालों के जवाब देने प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग तब्दील हो गया है। एक छोटे फ्लोरोसेंट डोमेन के साथ एक प्रोटीन टैगिंग विवो में इसके वितरण की मैपिंग की अनुमति देता है </eमीटर> संरचना को बदल सकते हैं कि permeabilization प्रक्रियाओं के लिए आवश्यकता के बिना। माइक्रोस्कोपी इलेक्ट्रॉन के एक सेल में प्रोटीन वितरण नक्शा करने के लिए प्रोटीन टैग का उपयोग कर के सुरुचिपूर्ण सिद्धांत का अनुवाद करने के लिए, एक प्रणाली ब्याज की संरचना के लिए एक संकेत बंद का उत्पादन और मंदिर में विपरीत उत्पन्न करने में सक्षम है कि जरूरत थी। Polymerized diaminobenzidine अक्सर बाध्यकारी एंटीबॉडी का पता लगाने के ऊतक विज्ञान में प्रयोग किया जाता है कि एक दाग है। यह दाग आमतौर पर एक माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्मित हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) का उपयोग कर जमा किया जाता है। प्रतिक्रिया के लिए एक विश्वसनीय परिणाम पैदा करता है, एचआरपी 9 कोशिकाओं की cytosol में catalytically सक्रिय नहीं है। उनके संकल्प nanogold विधि 10 से भी बदतर है कि इतने एचआरपी की प्रतिक्रिया उत्पादों को भी पीढ़ी की साइट से दूर फैलाना कर सकते हैं। इन समस्याओं को बायपास करने के लिए, फ्लैश / ReAsH सिस्टम 11 विकसित किया गया था। यह एक tetracysteine मूल भाव के अधिकारी है कि पुनः संयोजक संलयन प्रोटीन होते हैं। यह मूल भाव के बंधन की अनुमति देता हैएक biarsenic fluorophore। उत्साहित है, तो बाध्य फ़्लैश या ReAsH टैग प्रोटीन के स्थल पर तुरंत अवक्षेप कि एक बहुलक में उच्च प्रतिक्रियाशील स्वेटर ऑक्सीजन और इस तरह photoconvert diaminobenzidine (थपका) उत्पन्न करने में सक्षम है। थपका बहुलक इलेक्ट्रॉन घना है और इस प्रकार मंदिर में पुनः संयोजक संलयन प्रोटीन का वितरण नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो आज़मियम tetroxide, साथ दाग जा सकता है।
2011 में, शू एट अल। 10 फ्लोरोसेंट और 448 एनएम नीले प्रकाश के साथ उत्साहित है जब कई स्वेटर ऑक्सीजन कण पैदा करने में सक्षम है कि एराबिडोप्सिस की एक flavoprotein से ली गई एक छोटी सी 106 अमीनो एसिड संलयन टैग के होते हैं जो miniSOG प्रणाली, प्रस्तुत किया। उन स्वेटर ऑक्सीजन कण पर और immunogold लेबल एंटीबॉडी 11 की तुलना में काफी करीब है, जो टैग प्रोटीन, की सतह के पास पॉलिमर फार्म के लिए फोटो-oxidize diaminobenzidine के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। फ्लैश / ReAsH सिस्टम फ्लोरो लाने की आवश्यकता हैक्रोम और photoconversion करने से पहले कोशिकाओं में diaminobenzidine, miniSOG प्रणाली केवल diaminobenzidine और प्रकाश की आवश्यकता है और इसके अलावा में diaminobenzidine polymerizing पर के बारे में दो बार के रूप में प्रभावी है। इधर, miniSOG डीएनए की मरम्मत foci के फैटी नक्शा करने के क्रम में ईएसआई के साथ संयोजन में कार्यरत है।
डीएनए की मरम्मत foci (डीआरएफ)
वे ट्रांसलोकेशन और आनुवंशिक जानकारी का नुकसान हो सकता है, क्योंकि बिना मरम्मत के डीएनए डबल किनारा टूट सेल के लिए एक गंभीर खतरा है। बारी में, यह बुढ़ापा, कैंसर, और सेल मौत हो सकती है। डीएनए डबल कतरा तोड़ मरम्मत में शामिल कर रहे हैं कि कई प्रोटीन 12-14 तोड़ने के एक डीएनए डबल कतरा चारों ओर इकट्ठा कि foci में जमा। उनके कार्य ज्ञात नहीं है, वे डीएनए डबल कतरा तोड़ होता है और डीएनए डबल कतरा तोड़ मरम्मत की साइट है कि नाभिक में साइट का प्रतिनिधित्व करते हैं।
डीएनए की मरम्मत संस्कृति और उसकेमैं (डीआरएफ) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा विशेषता किया गया है और वे डीएनए की क्षति 12,15 के लिए बायोमार्कर के रूप में काम करते हैं। वे डबल कतरा तोड़ के आकार के लिए बड़े पैमाने पर रिश्तेदार हैं और हाल ही में सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी अध्ययन प्रत्येक 16 ध्यान केंद्रित भीतर अणुओं के उप compartmentalization के कुछ सबूत से पता चला जब तक अपेक्षाकृत सजातीय पर विचार किया गया। इन साइटों का आयोजन कर रहे हैं कि कैसे को समझने के लिए, यह एक दूसरे के लिए अंतर्निहित जैविक संरचनाओं के सभी रिश्तेदार कल्पना करने के लिए आवश्यक है। इस प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा हासिल की लेकिन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 17,18 के माध्यम से संभव है नहीं किया जा सकता। इधर, एक विधि डीएनए डबल कतरा तोड़ मरम्मत की फैटी पता लगाने के लिए इस संयुक्त दृष्टिकोण की क्षमता का वर्णन करने के लिए miniSOG विधि के साथ इलेक्ट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी इमेजिंग जोड़ती है कि वर्णित है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ईएसआई यह विशेष रूप से फास्फोरस में अमीर हैं कि क्षेत्रों के नक्शे में सक्षम है क्योंकि नाभिक में क्रोमेटिन और ribonucleoproteins के विभिन्न राज्यों की जांच के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण के रूप में काम कर सकते हैं। यह ग?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Roger Tsien for providing us with the miniSOG constructs. Dr. Xuejun Sun for help with the TEM. Lisa Lem, and Peter Shipple from the Cross Cancer Institute for supplying oxygen. Hilmar Strickfaden holds a postdoctoral fellowship by the Alberta Cancer foundation and was supported by the Bayrische Forschungsallianz. This work was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research and Alberta Cancer Foundation.
Materials
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Gridded 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-2-14-CGRD | not made for immersion objectives |
| LR White: acryl resin | emsdiasum | 14381 | |
| LR White accelerator | emsdiasum | 14385 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets | Sigma | D5905 | |
| Slim Bar Grids 300 Mesh | SPI | 1161123 | |
| Tungsten-Point Lab Pen | emsdiasum | 41148 | |
| Osmium Tetroxide | emsdiasum | 19100 | |
| Carbon Coater 208carbon | Cressington | ||
| Ultra microtome Leica EM UC6 | Leica | ||
| Photoshop CS5 | Adobe | might even work with older versions | |
| Digital Micrograph V.2.30 | Gatan | might even work with older versions | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H-1399 | |
| Effectene | Quiagen | ||
| MiniSOG-Constructs | Tsien-Lab | tsienlab@yahoo.com | |
| MDC1 miniSOG mCherry | |||
| 53BP1 miniSOG mCherry | |||
| Rad52 miniSOG mCherry | |||
| cesium 137 radiation source "MARK 1" | (J.L. Shepherd & Associated) | ||
| ImageJ/FiJi | open source | http://fiji.sc/Fiji | |
| 2 ml Eppendorf tubes | Fisherbrand | 05-408-146 | |
| Diamond Knife ultra 35° | Diatome | ||
| Trimming Knife ultratrim | Diatome | ||
| Sodium cacodylate trihydrate | emsdiasum | 12300 | Caution Toxic! |
| Glutaraldehyde EM Grade 8% | emsdiasum | 16020 | Caution Toxic! |
| Sodium phosphate dibasic | emsdiasum | 21180 | |
| Sodium phosphate monobasic | emsdiasum | 21190 | |
| Paraformaldehyde | emsdiasum | 19202 | |
| Osmium tetroxide 4% solution | emsdiasum | 19150 | |
| Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Hydrochloric Acid | Fisherbrand | A142-212 | |
| Sodium Hydroxide Solution 10M | Fluka | 72068 | |
| Oxygen | Medigas | ||
| 3-Amino-1,2,4-triazole | Sigma | A8056 | |
| Potassium cyanide | Sigma | 207810 | Caution Toxic! |
| Ethanol | emsdiasum | 15058 | Caution Toxic! |
| Razor blade Single Edge Carbon Steel | emsdiasum | 71960 | Caution Sharp! |
| DMEM | Sigma | D 5546 | |
| FBS | lifetechnologies | 16000-044 | |
| G418 | lifetechnologies | 11811-023 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Transmission Electron Microscope 200 kV | JEOL | 2100 | |
| GIF Tridiem 863 Energy filter | Gatan |
References
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