Abstract
הגבולות לרזולוציה אופטית והאתגר של זיהוי אוכלוסיות חלבון ספציפיות במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים היו מכשולים בביולוגיה של תא. לא ניתן להסביר תופעות רבות על ידי ניתוח במבחנה במערכות פשוטות וזקוקים למידע מבני נוסף באתר, במיוחד בטווח שבין 1 ננומטר ו 0.1 מיקרומטר, כדי להבין באופן מלא. כאן, הדמיה ספקטרוסקופיות אלקטרון, טכניקה מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים שמאפשרת מיפוי בו זמנית של ההפצה של חלבונים וחומצות גרעין, ותג ביטוי, miniSOG, משולבת כדי לחקור את המבנה וארגון של מוקדי תיקון הפסקה כפולים גדיל DNA.
Introduction
למרות ההתקדמות המשמעותית במיקרוסקופ אור בשנים האחרונות 1, תא-ביולוגים עדיין סובלים מפער ברזולוציה. זה מגביל את ההבנה של מערכות היחסים מבנה-תפקוד בתהליכים תאיים בסיסיים שכוללים את יחסי גומלין בין מתואמים מתחמי macromolecular (למשל, בשיפוץ הכרומטין, תיקון DNA, שעתוק RNA ושכפול ה- DNA). למרות שמיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים (TEM) זה לספק את הרזולוציה הנדרשת, זה כבר מאתגר להגדיר תהליכים מבני בגלל חוסר היכולת אלה לתייג חלבונים ספציפיים בעת גם להיות מסוגל לקבוע את ההרכב הביוכימי של המבנים דמיינו. בהעדר הקרום הפנימי כדי לעזור להבדיל מבנים גרעיניים, הגרעין היה מאתגר במיוחד. הדמיה ספקטרוסקופיות אלקטרונים (ESI) פותרת חלק ממגבלות אלה על ידי המאפשרים זיהוי ובידול בו זמניים של DNA, RNA, וprotעין מבוססת מבנים גרעיניים 2-5.
הדמיה ספקטרוסקופיות אלקטרונים:
כדי למפות הפצות יסודות ברגישות גבוהה ורזולוציה במיקרוסקופ האלקטרונים, אחד יכול להשתמש בספקטרומטר הדמיה שבוחר אלקטרונים שכבר פזורים inelastically דרך אינטראקציות עם אלקטרונים מעטפת פנימיים של אלמנט בדגימה 6. בגלל כמויות אלמנט ספציפי של אנרגיה הולכות לאיבוד כתוצאה מיינון של האטומים בדגימה, ניתן להפריד אלקטרונים אלה ומדמיינים באמצעות ספקטרומטר המחובר למיקרוסקופ האלקטרונים. לפיכך, ניתוח של הספקטרום של האלקטרונים שתקשרו עם הדגימה חושף מידע איכותי וכמותי על הרכב היסודות של המדגם 7. אלקטרונים שלא לאבד אנרגיה כאשר עוברים דרך הדגימה נמצאים ב" שיא אפס האובדן "של אובדן אנרגיית האלקטרוןספקטרום. השפע של אלקטרונים אלה קשור למסה, הצפיפות והעובי של הדגימה ומורכבת מאלקטרונים שעוברים דרך הדגימה ללא התנגשות עם הדגימה או לאבד אנרגיה במהלך מעבר בדגימה. מידע זה יכול להיות שימושי לכימות מוחלט של המספרים של אטומים של יסוד מסוים בהווה הדגימה 8.
מאז דגימות ביולוגיות מורכבות בעיקר של אלמנטי אור שגרוע להסיט את האלקטרונים באלומת האירוע של TEM, שיטות צביעה באמצעות מתכת כבדה מלחים צריכים להיות מיושמים על מנת ליצור ניגוד במדגם. חוסר הספציפי של רוב הסוכנים המנוגדים הללו וחוסר היכולת לחזות כתם אחד או יותר שבו סגוליות הוא אפשרי הגביל את הערך של מיקרוסקופ אלקטרונים הקונבנציונלי במחקר של הגרעין. יש ESI יתרונות משמעותיים על פני TEM הקונבנציונלי, במיוחד לחקר מבנים של גרעין התא.אפשר לנצל את טבע זרחן העשיר של דנ"א ומתחמי macromolecular המכיל RNA להבחין מתחמי nucleoprotein מקומפלקסי חלבונים ולפתור מתחמי nucleoprotein שונים המבוססים על צפיפותם של חומצות גרעין. ניתן הדמיה החומר ביולוגי שנותר מבוסס על השפע של חנקן. מיפוי רק שני אלמנטים אלה וניתוח של ההפצה שלהם ושפע יחסי בתוך מבנים אנטומיים שונים מספק לנו הרבה מידע על הגרעין. לדוגמא, קל לזהות הכרומטין והריבוזומים במפה מייצגים שפע זרחן. חלל interchromatin, מתחמים נקבוביות גרעיניים, וגופים גרעיניים, לעומת זאת, ניתן לאתר בקלות בתמונה מפת החנקן.
מערכת מחולל חמצן גופיית מיני (miniSOG)
בעוד ESI מייצג טכניקה חזקה ללמוד במבנה הכרומטין אתר כי זה ייקחיתרון של של היחסים האופייניים ברכב יסודות בין זרחן וחנקן, הרכב היסודות לא יכול בדרך כלל לשמש להפלות בין אוכלוסיות השונות של קומפלקסי חלבונים. נוגדנים שכותרתו עם חלקיקי זהב קטנים בטווח ננומטר היו בשימוש נרחב כדי למפות את המיקום של מולקולות בודדות. מאז חלקיקי הזהב הוא בדרך כלל מצורף לנוגדנים משני, היא תופיע בהיקף של כ 20 ננומטר סביב epitope זוהה על ידי הנוגדן הראשוני. בדגימות שלאחר ההטבעה, נוגדנים יכולים רק לזהות את אפיטופים שנחשפים על פני השטח של החלקים. למרות שניתן להוכיח את קיומו של אנטיגן ומתייחס זה למבנה האנטומי מסוים של התא, המידע שמתקבל אינם שלם, שכן רוב epitopes הם מוסתרים על ידי שרף. טרום הטבעת טכניקות, המשתמשות בפרוטוקולים דומים לאלה המשמשים למיקרוסקופ פלואורסצנטי, לאפשר גישה לאנטיגנים בכלכל העומק של המדגם אבל צעדי permeabilization הנדרשים על מנת לאפשר את הנוגדן לחדור לתא בדרך כלל דורש הסרת קרומי שומנים ולהסיר רכיבים שלא ניתן לתקן על ידי אלדהידים. יתר על כן, מקבע אלדהיד העדיף לשימור ultrastructure, glutaraldehyde, בדרך כלל הורס epitopes וכתוצאה מכך, נדרש בדרך כלל paraformaldehyde. זה פחות יעיל בcrosslinking חלבונים. חסרון נוסף של נוגדנים שכותרתו עם ננו-חלקיקי זהב הוא שזהב הוא חומר אלקטרון-צפוף מאוד שיוצר ניגוד חזק שיכול לטשטש פרטים מבניים מעניינים של המדגם, שבה יש ניגוד חלש.
ההופעה של חלבון הניאון הירוק (GFP) כתג חלבון הביע הפכה את השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לענות על שאלות בביולוגיה של תא. תיוג חלבון עם תחום ניאון קטן מאפשר מיפוי של ההפצה שלה בvivo 9. תוצרי התגובה של HRP יכול גם לפזר מהאתר של ייצור, כך שהרזולוציה שלהם היא יותר גרועה מאשר בשיטת nanogold 10. כדי לעקוף בעיות אלה, המערכת / ReAsH הבזק פותחה 11. הוא מורכב מחלבוני היתוך רקומביננטי שיש מוטיב tetracysteine. מוטיב זה מאפשר קשירה שלfluorophore biarsenic. כאשר נרגש, פלאש הכבול או ReAsH הוא מסוגל לייצר חמצן תגובתי הגופייה וdiaminobenzidine כך photoconvert (DAB) לפולימר שמשקע באופן מיידי באתר של החלבונים המתויגים. פולימר DAB יכול להיות מוכתם עם tetroxide אוסמיום, אשר הוא אלקטרון צפוף ובכך יכול לשמש כדי למפות את ההפצה של חלבון היתוך רקומביננטי בTEM.
בשינה 2011, שו et al. 10 הציגו את מערכת miniSOG, אשר מורכבת תג היתוך חומצות אמינו קטן 106 נגזר מflavoprotein של ארבידופסיס שהוא ניאון ומסוגל ליצור רדיקלים רבים גופייה כאשר נרגשים עם אור כחול 448 ננומטר. אלה רדיקלים גופייה יכולים לשמש לdiaminobenzidine צילום חמצן כדי ליצור פולימרים ובסמכו לפני השטח של החלבון מתויג, שהוא במידה ניכרת קרוב יותר מנוגדנים שכותרת immunogold 11. בעוד מערכת Flash / ReAsH דורשת להביא fluoroכרום וdiaminobenzidine לתוך התאים לפני שאני עושה photoconversion, מערכת miniSOG דורשת רק diaminobenzidine ואור ובנוסף היא פי שניים יעיל בpolymerizing diaminobenzidine. כאן, miniSOG מועסק בשילוב עם ESI כדי למפות את ultrastructure של מוקדי תיקון DNA.
מוקדי תיקון DNA (DRF)
הפסקות גדיל הדנ"א כפולות מתוקן מהוות איום רציני לתא שכן הם יכולים להוביל לטרנסלוקציות ואובדן של מידע גנטי. בתורו, זה יכול להוביל להזדקנות, סרטן, ומוות של תאים. חלבונים רבים שעוסקים בתיקון הפסקת גדיל הדנ"א כפול מצטברים במוקדים שסביב להרכיב גדיל הדנ"א כפול לשבור 12-14. למרות שתפקידם אינו ידוע, הם מייצגים את האתר בגרעין המכיל את הפסקת גדיל הדנ"א הכפולה, והוא האתר של תיקון הפסקת גדיל הדנ"א כפול.
foc תיקון DNAאני (DRF) מתאפיינים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי והם משמשים כסמנים ביולוגיים לנזק לדנ"א 12,15. הם מסיביים יחסית לגודל של הפסקת גדיל פעמיים ונחשבו הומוגנית יחסית עד מחקרי מיקרוסקופ ברזולוציה הסופר האחרונים חשפו כמה עדויות של תת-מידור של מולקולות בתוך כל להתמקד 16. על מנת להבין כיצד אתרים אלו מאורגנים, יש צורך לדמיין את כל המבנים ביולוגיים הבסיסיים ביחס לזה. זה לא יכול להיות מושגת על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי אבל אפשרי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים 17,18. הנה, שיטה מתוארת המשלבת הדמיה ספקטרוסקופיות אלקטרון עם שיטת miniSOG כדי להמחיש את הפוטנציאל של גישה משולבת זו כדי לחקור את ultrastructure של תיקון הפסקה כפול גדיל DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. דור של תא-קווי miniSOG
- לגדול U2OS (אוסטאוסרקומה האנושית) תאים בצלחת 35 מ"מ המכילה 2 מיליליטר של מדיום גלוקוז הנמוך השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) שהוא השלים עם סרום 10% שור עוברי (FBS) על 37 מעלות צלזיוס בחממה humidified עם 5% CO 2 אווירה.
- Transfect התאים כאשר הם 80% ומחוברות בlipofection עם איכות מטוהרת transfection (1.8-2.0 A269 / 280 יחס) בונה פלסמיד המכילה את הרצפים לminiSOG וmCherry מתויגת חלבוני תיקון על פי הפרוטוקול של היצרן של מגיב transfection 19. ניתן להזמין מ- Lab Tsien פלסמידים ביטוי miniSOG: http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
- מיין תאים המבטאים את חלבון רקומביננטי עם תג miniSOG וmCherry על ידי תא מופעל הקרינה מיון לאחר transfection יומיים. איסוף תאיםעם עוצמת הקרינה ביניים על מנת למנוע תאים שביתר 20.
- תרבות התאים החיוביים על צלחת 10 סנטימטר 10 מיליליטר של מדיום DMEM שהוא השלים עם 10% FBS ו -0.6 מיקרוגרם / מיליליטר סוכן הבחירה G418 (Geneticin) של.
- לאחר מושבות גלויות צמחו על הצלחות, מסך למושבות חיוביות mCherry באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך ולצייר עיגולים סביבם (על תחתית הצלחת) עם סמן קבע. השתמש בעדשה אובייקטיבית אוויר בהגדלה נמוך (למשל, 10x) ולבחור שיבוטים באמצעות טכניקה סטרילית על ידי מגרד בזהירות את המושבות ומלאט מוצץ אותם לקצה פיפטה 1,000 μl סטרילי.
- הרחב את המושבות שנבחרו ולהקפיא חלקים של אותם באמצעות מדיום הגידול מתואר בשלב 1.1 בתוספת 10% sulphoxide דימתיל. בדוק את התאים להיווצרות DRF על ידי גידולם על 18 x 18 מ"מ 2 תלושי כיסוי סטרילי וחושף אותם ל2 Gy של קרינה. התאים המוקרנים ביציבות להביע mCherry miniSOG מתויגים חלבון תיקון חייב להראות מאפיין דפוס המוקד הטיפוסי של DSBs כאשר דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מסנן שנקבע להדמית mCherry.
תרבות 2. תא
- תאי U2OS תרבות להביע ביציבות miniSOG וmCherry מתויג חלבוני תיקון בתנאים המפורטים בשלב 1.1. לגדל תאים לconfluency 80% בצלחת תחתית זכוכית קוטר 35 מ"מ המכילה 2 מיליליטר של DMEM. ודא שהדבק שמתחבר להחליק את המכסה לפלסטיק והפלסטיק המשמש הוא עמיד לתמיסות מימיות ואלכוהול ועמיד לשרף המשמש!
- לפני ביצוע הניסוי, מתאר שטח קטן של כ 1 מ"מ 2 המכיל תאים המבטאים את החלבונים מחוץ לרחם על ידי גירוד עם עט יהלומי סטרילי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לזהות את האזור של עניין. לחלופין להשתמש t צלחת תחתית זכוכיתכובע מכיל coverslip עם מערכת רשת מראש חרוטה המובנה בcoverslip.
הערה: אם באמצעות מיקרוסקופ הגומל באיכות גבוהה המשלב ESI וקרינת תמונות מיקרוסקופיות 21, לוודא כי העובי של coverslip תואם את יעדי טבילת שמן. זה צריך להיות בעובי מס '1.5 (.16-0.18 מ"מ). בחר אזור קרוב למרכז הצלחת לאזור להיבחן בTEM כדי להימנע מבעיות עם פילמור של השרף שעלול להתרחש ליד הקצוות (ראה נקודה 4.10-4.13).
אינדוקציה נזק 3. DNA
- מכשיר את התאים עם קרינת גמא, להשתמש בסמי radiomimetic, או לגרום הנזק על ידי הקרנת מיקרו לייזר במיקרוסקופ confocal (למשל, כפי שתואר ב18,22 או 23).
- בדוגמא זו, מקרינים את התאים עם 2 ו -6 Gy של קרינת גמא בmicroirradiate צסיום -137 מקור קרינה או לייזר באמצעות סול 405 ננומטרלייזר מזהה מצב של מיקרוסקופ confocal לאחר רגישות התאים במשך 20 דקות עם 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר Hoechst.
הכנת 4. לדוגמא
- תקן את התאים עם 1 מיליליטר של 4% זהירות paraformaldehyde במאגר cacodylate 0.1 M נתרן או בחיץ pH 0.1 M פוספט 7.4 למשך 30 דקות ב RT בחושך.
זהירות: Paraformaldehyde וcacodylate נתרן הם רעילים! ללבוש כפפות ולהשליך חומרים רעילים במידה מספקת. - לשטוף את התאים פעמיים עם 4 מיליליטר של pH 0.1 M נתרן חיץ cacodylate 7.4 או pH חיץ פוספט 7.4.
- פנק את התאים הקבועים עם גליצין 2 מיליליטר של 50 מ"מ, 5 מ"מ aminotriazole וזהירות 10 מ"מ אשלגן ציאניד במאגר cacodylate 0.1 M נתרן או 0.1 M חיץ פוספט (pH 7.4) (לבדוק את ה- pH!) למשך 30 דקות כדי לחסום unreacted קבוצות ואלדהיד לדכא מיני החמצן מגיבים נוצרו על ידי קבוצות heme, אשר יכול להגביר את הרקע.
זהירות: ציאניד אשלגן הוא רעיל ביותר! Wכפפות אוזן, לעבוד מתחת למכסת מנוע ולהשליך חומרים רעילים במידה מספקת. התגובה היא מאוד רגישה ל- pH ולכן חשוב שpH אומת ומדויק. - רשום את האזור שנבחר בשלב 2.2 ב2D או 3D במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך, אם מיקרוסקופיה הגומלת היא רצויה.
- הכן 1 מ"ג / פתרון זהירות hydrochloride diaminobenzidine מיליליטר ידי הצבת לוח hydrochloride diaminobenzidine 10 מ"ג לתוך צינור microcentrifuge 2 מיליליטר. להוסיף 980 μl של מזוקק H 2 O ו -20 μl של חומצה הידרוכלורית מרוכזת (11.65 מ ') ולערבב עד הפתרון הוא חום ואור שקוף. לדלל את הפתרון הזה ב 0.1 M פוספט או 0.1 חיץ cacodylate M נתרן לריכוז סופי של 1 מ"ג / מיליליטר תוך התאמת pH עם נתרן הידרוקסידי לpH בין 7.0 ו -7.6 (pH 7.4 מומלץ).
זהירות: diaminobenzidine הוא רעיל! ללבוש כפפות ולהשליך חומרים רעילים במידה מספקת. - לphotooxidation, replace החיץ עם 2 מיליליטר של 1 מ"ג / מיליליטר פתרון hydrochloride diaminobenzidine במאגר cacodylate 0.1 M נתרן או חיץ פוספט. הגן על פתרון זה מהאור ולקרר אותו על קרח עד 4 מעלות צלסיוס כדי להגדיל את המסיסות של חמצן. להרוות את הפתרון עם חמצן על ידי מבעבע חמצן דרך הפתרון (תשתמש בצינור שמוכנס לתוך הפתרון ומחובר לבקבוק חמצן). בדוק את ה- pH שוב ולהתאים במידת צורך.
הערה: זה הוא חיוני לתגובת photooxidation שpH הוא בין pH 7.0 ו- pH 7.6. - הר הצלחת עם התאים הקבועים בזהירות על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך מצוידים בעדשה אובייקטיבית 40X טבילת שמן ולהעביר אותה לאזור של עניין. Excite תג miniSOG עם אור כחול באמצעות קוביות מסנן לGFP או CFP. יש MiniSOG מרבי עירור ב ננומטר 448 עם כתף ב473 10 ננומטר.
- המשך עם התאורה גם לאחר חה הקרינה miniSOG הירוקהזה נעלם לחלוטין ועד למוצר תמונה-חמצון החום של diaminobenzidine polymerized עולה בערוץ האור המועבר. כאשר מוצר החמצון גלוי ברוב התאים, לכבות את תאורת הקרינה לעצור את צילום החמצון.
הערה: תמונה-חמצון יכול לקחת עד בהתאם לעדשה האובייקטיבית, אורכי גל שידור מסנן ויעילות, ומקור התאורה כמה דקות. - Postfix את התאים עם 1 מיליליטר של glutaraldehyde 2% בpH cacodylate 0.1 M נתרן 7.4 חיץ או pH חיץ פוספט 7.4 למשך 30 דקות.
- תקן את הקרומים של התאים עם 0.1% -0.5% tetroxide אוסמיום עבור 20 דקות בחיץ pH cacodylate 0.1 M נתרן 7.4 או 0.1 M pH חיץ פוספט 7.4.
הערה: מומלץ להשתמש בריכוז הנמוך ביותר האפשרי של tetroxide אוסמיום הנדרש כדי לייצב את הקרומים. מאז יש לי משקעים DAB polymerized צפיפות גבוהה של חנקן, אשר ניתן לאתרם ישירות על ידי ESI, חזקצביעת אוסמיום אין צורך לזהות את החלבון מתויג miniSOG ועשויה להזיק לESI. tetroxide אוסמיום הוא רעיל מאוד! לעבוד במנדף ולהשליך הפסולת הרעילה במידה מספקת. - מייבשים, התאים באמצעות סדרת אתנול באמצעות 30%, 50%, 70%, 90%, 98% 100% אתנול צעדים (כל 5 דקות). בהמשך לכך, דגירה התאים ב1: 1 תערובת של 100% אתנול ושרף אקרילי (LR הלבן) ולשים את הצלחת על שייקר במשך 4 שעות כדי להקל על חדירה לתאים לפני דוגרים התאים לפחות עוד 4 שעות ב100 % שרף אקרילי (LR הלבן).
- כדי פלמר השרף, לחתוך את המכסה של צינור microcentrifuge 2 מיליליטר שכותרתו עם סכין גילוח ומעיל השפה עם מאיץ שרף אקרילי. ודא שהמאיץ מכסה רק את השפה ואינו זורם לתוך הצינור. בהמשך לכך, בזהירות למלא את הצינור כשני שליש עם שרף LR הלבן בעזרת פיפטה פסטר. דואג שהשרף לא להיכנס שנינות קשרh המאיץ על השפה!
- הסר את השרף שהסתנן לתאים בצלחת ומניח את הצלחת הפוכה על צינור microcentrifuge עומד הזקוף, כך שהרוחב של הצינור מתמלא כמעט לגמרי את חלון תצפית הזכוכית המכוסה של המנה.
- חכה 1 עד 2 דקות למאיץ לאטום את הצינור וcoverslip, אז להפוך את הצינור כך שהשרף בצינור החברה מכסה את התאים.
- מניחים את הצלחת עם הצינור לתוך תנור על 60 מעלות צלזיוס ולרפא אותה במשך שעה 12.
- כאשר הבלוק הוא נרפא, להסיר את הצלחת עם צינור microcentrifuge מלא שרף המצורף מהתנור ולהפריד את צינור microcentrifuge מהצלחת. להקל הפרדה על ידי להקפיא להפשיר מחזורים בחנקן נוזלי ומים חמים.
- מחק את צלחת תחתית הזכוכית ולחתוך בזהירות לפתוח את צינור microcentrifuge עם סכין גילוח כדי להסיר את החסימה.
- תווית הבלוק עם סמן קבע.
- השתמש בסכין גילוח לTRIמ 'הבלוק כך ששום דבר אבל באזור 1 מ"מ 2 המכיל את האזור המסומן בעבר עם עט יהלומים או טונגסטן (או מכיל את האזור עם התאים של ריבית) נשאר.
- הר לחסום בultramicrotome, לקצץ את הבלוק עם סכין חיתוך ולחתוך חלקים דקים של כ -50 ננומטר באמצעות סכין יהלום.
- להרים את החלקים בשידור גבוה 300 רשתות רשת. יש רשתות אלה ברים רשת קטנים מאוד ובכך לכסות פחות תאים באזור של עניין.
- מעיל הסעיפים ברשתות עם כ .2-.4 ננומטר של פחמן באמצעות coater פחמן כדי לעזור לייצב אותן מתחת לאלומת האלקטרונים של TEM.
5. מיקרוסקופית אלקטרונים
- טען את הרשתות לTEM שמצויד במסנן אנרגיה. לאחר כוונון מיקרוסקופ ומסנן האנרגיה על פי הוראות היצרן, לבדוק את התאים בחלקים במצב ההגדלה הנמוך (שידור רגיל) ולהשוותשלהם לקרינת נתונים בעת הצורך (שהושג בשלב 4.4).
- ברגע שגרעין עם תכונות מעניינות (מסלול נזק לדנ"א או מוקדי תיקון DNA) נמצא, מתג למצב סינון האנרגיה ולהקליט מפת עובי.
הערה: הליך זה כולל את ההקלטה של אפס אובדן ותמונה לא מסוננת. עוביים עד 0.3 מהלך חופשי ממוצעים (30% מהאלקטרונים של קורה האירוע מקבל מפוזרים על ידי המדגם) הם דקים מספיק כדי ליצור מפות יסודות טובות. - מפות רשומות יחס של זרחן וחנקן האלמנטים באמצעות התוכנה ששולטת במסנן האנרגיה של המיקרוסקופ משמש. רשום את התמונות לאחר קצה מפת זרחן ב175 אובדן אנרגיית eV עם רוחב חריץ של 20 תמונות eV ומראש קצה ב 120 אובדן אנרגיית eV, גם עם רוחב חריץ של 20 eV. למפות חנקן, תמונות פוסט קצה שיא ב447 eV עם רוחב חריץ של 35 תמונות eV ומראש קצה ב358 eV, גם עם רוחב חריץ של 35 eV.
הערה: מאחר שהתוכן של אלמנטי הדמיה (phosphOrus וחנקן) הוא נמוך יחסית (כ. 1%), לבחור "תמונת יחס" (מפת יסודות איכותית) על "3 חלון השיטה" (לכמת מפת יסודות) כדי ליצור תמונות עם אות טובה יותר יחס רעש.
עיבוד תמונה 6.
- פתח את מפות יחס הבסיסיות בתוכנת עיבוד תמונה שיכול לטפל בפורמט הקובץ של התמונות שנרכשו (לדוגמא, דיגיטלי מיקרוסקופ). העתק את מפת החנקן לתוך הערוץ האדום ומפת זרחן לערוץ הירוק של תמונת RGB, אז להרכיב ולהתאים את המפות.
- לייצא את התמונה המורכבת כפורמט קובץ תמונה מתויג קובץ (TIFF). פתח את התמונה בתוכנת עיבוד תמונה שיכולה להשתמש בשכבות (למשל, Photoshop).
- התאם את הטווח הדינמי של כל ערוץ על ידי rescaling ערכי המינימום ומקסימום בתמונה לסט נתונים 8 סיביות (0 עד 255).
- הפחת את תוכן זרחן מהמפה החנקן (באמצעות"שכבות" חלון) כדי ליצור מפה איכותית שמציגה את ההתפלגות של חלבון.
- המרת המפות של חומצות הגרעין (זרחן) וחלבון (החנקן) נוצרו בשלב הקודם ל" צבע צמוד "וליצור טבלת בדיקה צהובה במרחב צבעי CMYK למפה המציגה את התפלגות חומצות גרעין וטבלת חיפוש ציאן כדי להראות את המפה הלא-nucleoprotein. הצבעים נבחרו כדי ליצור ניגוד מרבי בין שתי המפות הבסיסיות.
- ליצור תמונה חדשה ולייבא את המפות המציגות את החלוקה של זרחן וחלבון כשכבות שונות. השתמש במצב "המסך" השקיפות כדי לראות את שני השכבות על גבי זה.
- פתח את תמונת אפס האובדן רכשה בשלב 5.2. תמונה זו מייצגת תמונה של האזור נרשם שנראה כמו תמונת TEM קונבנציונלית אלא רק מכילה אלקטרונים שעברו בדגימה ללא התנגשות עם הדגימה. יצואתמונה זו כתמונת TIFF.
- פתח את תמונת אפס האובדן מיוצאת בעורך תמונה ולהעתיק אותו לשכבה העליונה של התמונה מראה את מפת היסודות. יישר את התמונה באמצעות המצב "מסך" שקיפות.
- סף לחלופין תמונת אפס האובדן למגזר האות שמקורו בminiSOG. הוסף את התמונה וכתוצאה מכך כשכבת נפרדת כפי שתואר לעיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ESI
השוואת תמונות ESI של הגרעין (איור 1) עם תמונות TEM קונבנציונליות (לדוגמא, איור 7-1) כי חל גידול דרמטי במבנים אנטומיים שניתן להבחין בקלות. רכסי הכרומטין מופיעים בצהוב וזה די קל לזהות chromocenters בתאי עכבר. בקלות ניתן להבחין nucleoli מהכרומטין על ידי המבנה העגול שלהם וצבע שונה, מאז הריבוזומים מראש התאספו כבר מכילים כמויות גבוהות של חלבון, אשר עשיר בחנקן, בנוסף ל- RNA, אשר עשיר בזרחן. הכרומטין ההיקפי מתגורר כשכבת דקה על הגבול של הגרעין והנקבובי גרעיניים ניתן לראות מבני חנקן עשיר שיפריעו הכרומטין ההיקפי. לעתים קרובות lamina ניתן לראות שכבה כחולה דקה מאוד מחוץ להכרומטין ההיקפי. בציטופלסמה, יכולים רבים חלקיקים קטנים עשירים בזרחןנראה. אלה יכולים להיות מזוהים כריבוזומים המבוססים על הגודל, השפע שלהם ומיקום מחוץ לגרעין. חלל interchromatin ניתן לראות את האזור עשיר בחלבון הממוקם בין הכרומטין. זה מכיל גופים ואזורים עשירים באותות צהובים קטנים, כגון חלקיקי ribonucleoprotein ואשכולות של גרגירי ribonucleoprotein (איור 2) גרעיניים. האחרון מכונים interchromatin אשכולות גרגיר ומועשרים בחלבונים אופייני הנדרשים לשחבור הרנ"א ראשוני. איור 1, C ו- D להמחיש את המראה של מבנים ידועים אחרים כגון כרומוזומים, centrosomes, מיטוכונדריה וcentromeres mitotic. באיור 2, הצעדים המשמשים ליצירת תמונות מורכבות מצבע מפות יחס יסודות גלם מסוכמים. מיזוג מפת זרחן (ירוק) ומפת החנקן (האדום) במרחב צבעי RGB (שורה העליונה) מאפשר הערכה טובה יותר של סכומים אלה האלמנטים במדגם. However, הפחתת אות זרחן לרוקן את התרומה של מבנים המכילים חומצות גרעין מהמפה החנקן להניב מפת החלבון (ציאן) ומיזוגה עם מפת זרחן (צהוב) במרחב צבע CYMK מספקת ייצוג חזותי ברור יותר של nucleoprotein והלא nucleoprotein (שורה תחתונה). זה מאפשר לנתונים להתפרש בקלות רבה יותר על ידי אנשים שאינם מכירים את הטכנולוגיה.
תאי microirradiated לייזר להביע MDC1, 53BP1 וRad52
בשל המוגדרים על ידי המשתמש, גודל, צורה ומיקום של מסלולי נזק לייזר, האזור של תצהיר DAB בתאי לייזר microirradiated הם קל מאוד למצוא בTEM בעת שימוש במערכת miniSOG. תמונות שצולמו במצב נמוך שידור הגדלה (כלומר, TEM brightfield הקונבנציונלי) לחשוף את מסלולי נזק האופייניים וניתן להשוות עם הנתונים שנרשמו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפני ההטבעה.זה שימושי במיוחד אם מיקרוסקופיה מתאם מיועדת, שכן הוא מאפשר זיהוי קל והעתקה של גרעינים בודדים. (איור 2-4).
הדוגמא הראשונה (איור 3) מראה שורת תאי U2OS יציבות להביע MDC1 miniSOG-mCherry. בניסוי microirradiation לייזר, הגיוס של MDC1 מכיל תגי miniSOG וmChrerry היה דומה מאוד לגרסאות מתויג GFP של חלבון זה (מידע לא מוצג). תיקון תאי שעה 1 לאחר אינדוקציה נזק לדנ"א והכנת המדגם עבור TEM, מסלולי נזק MDC1 זוהו בקלות בסעיפים הדק במצב TEM נורמלי כפסים כהים על פני הגרעינים, שתואמים היטב לנתוני הקרינה ( איור 3-5). כאשר מסתכל על ההפצה של החלבון, עלייה ברורה באות חנקן יכולה להיבחן באתרים פגועי הלייזר. זה חייב להיות ציין כאן כי זה נגרם בעיקר על ידי diami polymerized nobenzidine, אשר עשיר בחנקן ומגביר את האות של miniSOG מתויג חלבון תיקון, ולא אך ורק דרך ההצטברות של חלבוני תיקון במסלול הנזק. השוואת מבנה הכרומטין בשאר הגרעין עם המבנה במסלולי הנזק מראה הבדל ברור. הכרומטין הפגום (שמוצג בקווים מקווקווים באיור 3) מופיע יותר decondensed בניגוד להכרומטין מוקרן עישון, אשר מתרחש ברכסים עבים בnucleoplasm. בתוך מסלולי הנזק, גופים גרעיניים (200-300 ננומטר) (מסומנים בחצים באיור 3 II2, IIb, IIC וIIIa), כי הם עשירים בחלבון MDC1-miniSOG אבל חופשיים מחומצות גרעין יכולים להיות גם ציינו. זה יהיה מאוד מאתגר להגדיר גופים הגרעיניים אלה כמבנים ללא הכרומטין ללא טכניקה זו. הוא גם מציע רמה נוספת של מורכבות לאתרי נזק שלא נחזו על ידי ביוכימיה הידועה של MDC1.
ntent "> כאשר מסתכלים על מסלולי הנזק של 53BP1 (איור 4) שנוצרו באמצעות אותם התנאים כמו הנזק שתואר קודם לכן בתאים-transfected MDC1, ניתן לצפות לתוצאות דומות מאוד. האות שהופקה על ידי התמונה-החמצון של miniSOG היה צפוף ומילא את החלל שבין הקפלים של הכרומטין. גופים גרעיניים מוכתמים גם יכולים להיות שנצפו (מסומן בחץ באיור 4 D, E, F).מניסויים עם בונה Rad52-GFP, ידוע שRad52 יהווה microcompartements הבהיר קטן 24 לאורך מסלול נזק הנגרם לייזר. בשל מגבלת הרזולוציה של מיקרוסקופי אור קונבנציונליים, זה כבר לא ברור עד כמה גדול מבנים אלה באמת וכיצד הם מתייחסים ל- DNA הפגום. כאשר מסתכל על תמונת TEM של גרעיני U2OS מוקרן בלייזר constitutively להביע Rad52-miniSOG-mCherry, בגודל של גופים אלה נמדדו להיות ב( ננומטר 150-250) הממוצע. זהעוד יותר מפתיע להסתכל על מוקדים אלה עם ESI. בניגוד לדוגמאות הקודמות, מוקדי Rad52-miniSOG-mCherry נראים מאורגנים בצורה שונה לגמרי לאורך מסלול הנזק ונראים כמו מבני גוף-גרעיניים קומפקטיים שמורכבים מחלבון, ואין לי חומצות גרעין לזיהוי בתוך הפנים שלהם. בהתבסס על מחפש את הקשר / חלבון גרעין חומצה באזורים שנפגעו שהושגו עם גישת miniSOG וESI המשולבת שלנו, אנו מציעים שתיקון DNA יכול להתבצע על פני השטח של המוקדים ולא בעיצוב הפנים.
התמונה התחתונה באיור 5 מציג תוצאות דומות לאיור 3-III. הכרומטין באזור הפגוע נראה יותר decondensed לעומת הכרומטין באזורים שאינם מוקרן (ראה אזור שהתווה קווים אדומים).
תאים המוקרנים גמא
בעוד מיקרו-קרינת לייזר הוא כלי נוח לquicklחלבוני מבחן y המכילים תג ניאון לגיוס לאתרים של נגעי DNA, הוא יוצר כמויות גדולות של נזק מורכב (הפסקות גדיל כפול, הפסקות גדיל בודדות, נזק בסיס, והדימרים cyclopyrimidine) 25. על מנת ללמוד את התאים היוצרים סביב הפסקות גדיל הדנ"א כפול באופן ישיר יותר, בדקנו DRFs היוצרים סביב DSBs הבודד על ידי חשיפת תאים לקרינת גמא.
תאי U2OS שיציבות להביע 53BP1-miniSOG-mCherry נחשפו עד 2 Gy של קרינת גמא וקבוע חצי שעה לאחר ההקרנה. הדפוס האופייני של מוקדים גדולים מופץ ברחבי nucleoplasm יכול להיבחן (איור 6Ia). לאחר צילום חמצון של diaminobenzidine, כתמים כהים המתעוררים בעמדות שבו אותות mCherry ניאון אותרו בmicrographs הקרינה ניתן היו לראות בmicrographs האלקטרונים (איור 6Ib וג). כתמים אלה יכולים להיות מתואמים לTEM תמונותשנלקחו בהגדלה נמוכה (איור 6Id ודואר). התמונות של ESI מוקדים אלה, שנראים על 1-1.5 מיקרומטר בקוטר, הראו מבנה מעניין. חוטים דקים של הכרומטין נראה היה שזורים בחלבון 53BP1 של כ פעמיים העובי.
בניסויים אחרים, התאים נחשפו לכמות גדולה יותר של קרינה וקבועה בנקודות זמן מאוחר יותר (לאחר 3 שעות ו -6 שעות, בהתאמה) על מנת ליצור מוקדים גדולים יותר ולהקל על איתורם בסעיפים דקים (איור 7). כי אנחנו מסוגלים למפות nucleoprotein וחלבון בנפרד, ESI מגלה כי המבנה של המוקדים מופיע לארגן מחדש לאורך זמן. הכמות היחסית של חלבון 53BP1 במוקד מופיעה להגדיל בעוד הכרומטין לוקח עמדה שולית יותר.
מאז מוקדי 53BP1 מופיעים גם באינם מוקרן תאים כ" מוקדים נסתרים "בתאי G1 באתרים של-לשכפל תחתד DNA 26,27, מוקדים אלו גם צילמו. נראים מוקדים נסתרים אלה לנמל כמויות גבוהות של חלבון ביחס למוקדי הקרינה מושרה ולהראות מבנה קבוע מעניין של הכרומטין.
לפיכך, הדמיה מרכיבי מוקדי תיקון DNA בשיטת miniSOG עוזרת לזהות אזורים של נזק לדנ"א ולמפות את ההפצה של מתויג חלבון תיקון ביחס להכרומטין.
1. איור של מבנים שניתן לראות בתמונת ESI אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
(א) תמונה של ESI פיברובלסטים עובריים של עכבר. רכסי הכרומטין (צהוב) מוקפים nucleoplasm (ציאן) ממלא את sp interchromatinאס. הגרעין מוקף heterochromatin ההיקפי וchromocenters (השמאלית תחתון) שנקטעו על ידי מתחמים גרעיניים נקבוביות (ציאן). Nucleoli ניתן להפריד באופן ברור על ידי צבעם. זאת בשל העובדה כי כמות חלבון ביחס לחומצות גרעין היא גבוהה יותר במבנה nucleolar מאשר בהכרומטין. מחוץ לגרעין, ניתן לזהות מיטוכונדריה והריבוזומים (עשירים בחומצות גרעין) בקלות.
תמונה (ב) לגרעין וcentrosomes (ראה חיצים), שניתן לראותו כחלקיקים עשירים בחלבון חלול בפינה השמאלית העליונה של התמונה.
סעיף (ג) צלב דרך צלחת metaphase. כרומוזומים metaphase מרוכזים מאוד שמיושרים לדיסק, שישתרע מהפינה השמאלית העליונה לפינה השמאלית התחתון. ריכוזים גבוהים של חנקן גלויים על פני השטח של כמה כרומוזומים. אזורים אלה הם kinetochores (ראה חיצים).
(שורה העליונה) שתי התמונות הראשונות בשורה להראות מפות היחס של זרחן וחנקן. התמונה האחרונה בשורה העליונה מציגה מפות יסודות אלה על גבי במרחב צבע RGB. צהובים מבנים מייצגים נוקלאו, המשקף את נוכחותם של שני זרחן וחנקן. (שורה תחתונה) התמונה הראשונה מראה את מפת זרחן, שבעיקר חושפת את חלוקת חומצות גרעין במדגם. התמונה האמצעית מראה את חלוקת / stru השלילי מדולדל חומצות הגרעין ctures. זה היה מחושב על ידי הפחתת מפת זרחן מהמפה החנקן. התמונה הימנית התחתונה מראה מיזוג של מפת חומצות הגרעין וחלבוני המפה במרחב צבע תוסף. יש להשתמש בצבע זה מרוכבים כדי לסייע בזיהוי של מבנים בודדים ולסווג אותם כnucleoprotein או לא nucleoprotein. המידע כמותי על שפע זרחן וחנקן צריך להיות שנאסף מבחינה ויזואלית מזרחן הרשת ומפות בגווני אפור חנקן נטו או מחומרים מרוכבים שנוצרו על ידי שימוש בצבעי תוסף, כגון בשורה העליונה. 
יצירת איור 2. של תמונת ESI צבע רב 
איור קרינת מיקרו 3. לייזר של תאי U2OS יציבות להביע MDC1-miniSOG-mCherry. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
(II) האזור, מודגש על ידי ריבוע ירוק בIc היה מוגדל ומוצג במצב שידור רגיל (IIa) וESI (IIb). IIC מציג שכבה של תמונת ESI עם האות של מסלול הנזק. אות מסלול הנזק הייתה מתקבלת על ידי thresholding התמונה העליונה.
(III) דוגמאות למבנה של מיקרו לייזר הכרומטין -irradiated והכרומטין מחוץ לאזור פגוע הלייזר.
איור קרינת מייקר 4. לייזר של תאים ביציבות להביע 53BP1-miniSOG-mCherry. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
עמודה שמאלית: (א) הקרינה, (ב) הקונבנציונלי TEM ו- (ג) ESI תמונה של אותו מיקרו הלייזר מוקרן גרעין.
עמודה ימנית: (ד) הקונבנציונלי TEM, (E) ESI ו( F) כיסוי של תמונת ESI עם אות miniSOG שמפולחת לפי thresholding של (ד) (ראה שלב 6.10)
-together.within עמודים = "תמיד"> 
שורת תאי 5. U2OS איור יציבות להביע Rad52-miniSOG-mCherry ונפגע על ידי לייזר מיקרו-קרינה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
כיסוי (א) לתמונת הקרינה עם תמונת TEM נמוכה הגדלה מראה לייזר microirradiated U2OS גרעין עם מסלול נזק בפינה השמאלית התחתונה.
תמונה (ב) נציג הקרינה confocal מיקרוסקופיה של מיקרו לייזר מוקרן גרעין הצבעוני Hoechst (כחולה) להביע Rad52-miniSOG-mCherry מראה את הדפוס האופייני של מוקדים קטנים לאורך מסלול נזק (האות האדומה).
(ג) הקונבנציונלי TEM, (ד) ESI,
תמונה (G) ESI של גרעין U2OS אחר יציבות להביע Rad52-miniSOG-mCherry מראה מסלול נזק הנגרם לייזר בהקשר של כל הגרעין.
איור 6. תאי U2OS יציבות להביע 53BP1-miniSOG-mCherry מוקרן עם 2 Gy וקבוע לאחר 30 דקות. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
(I)) תמונת הקרינה מראה את מוקדי 53BP1 מושרה קרינת גמא. ב) מועבר תמונת אור לאחר photopolymerization. ג) אובerlay של הקרינה עם תמונת האור המועברת. ד) תמונת TEM בהגדלה נמוכה (הפס השחור הוא בר רשת TEM). דואר כיסוי) של תמונת הניאון עם תמונת TEM ההגדלה הנמוכה.
מוקד נזק (II) שכותרתו עם כוכבית בתמונה האור המועברת נרשמה בTEM הרגיל ובמצב ESI. ) אפס-הפסד, ב) ESI, ג) זרחן, ד) דואר חלבון) הכיסוי ESI ואות מפולחת מתמונת אפס האובדן.
מוקד נזק (III) שכותרתו עם צלב בתמונה הקרינה נרשמה בTEM הרגיל ובמצב ESI. ) אפס-הפסד, ב) ESI, ג) זרחן, ד) דואר חלבון) הכיסוי ESI ואות מפולחת מתמונת אפס האובדן.
שינויי איור 7. במבנה מוקדים בין המוקדים לאחר שעות שונות של קרינה. < / Strong> אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תאי U2OS 53BP1 miniSOG mCherry נחשפו עד 6 Gy של קרינת גמא קבועה לאחר 3H (1A-E, FJ) ו6 שעות (2 א-E, FJ) בהתאמה. 3 תערוכות גרעין unirradiated U2OS 53BP1 miniSOG mCherry מראה מוקד נסתר (AE). תמונות ESI מוצגות לפי הסדר ESI (חומצות גרעין וחלבונים), חומצות גרעין (לבד), חלבון (לבד), ESI (חומצות גרעין וחלבונים) + מפולחות אות miniSOG.
8. מוקדי DNA-תיקון איור עדיין נראים במצב שידור קונבנציונלי כאשר לאחר קיבוע עם tetroxide אוסמיום מושמט. "Target =" _ arge.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
סעיף Ultrathin (50 ננומטר) של גרעין U2OS מראה שני מוקדי 53BP1 ממדגם שלא טופל בtetroxide אוסמיום. (א) במצב TEM קונבנציונלי, ניתן לראות באתרים מוכתמים על ידי פולימר DAB גם ללא שיפור לעומת כתם כבד מתכת. (ב) לעומת זאת מהמוקדים ניתן לשפר עוד יותר על ידי לקיחת תמונות אפס אובדן (סינון את כל האלקטרונים שמקור מאירועי פיזור לשון רבים).
קביעת איור 9. של הגדרות חלון אנרגיה האופטימלית לזרחן מיפוי
() מפת יחס Elemental נרשמה לזרחן עם הודעה קצה ב155 eV ומראש קצה ב 120 eV.
תוכן "> (ב) מפת יחס Elemental נרשמה לזרחן עם הודעה קצה ב175 eV ומראש קצה ב 120 eV.(ג) חישוב מפות יחס זרחן מחלון מראש קצה קבוע ב 120 אובדן אנרגיית eV וחלון פוסט-קצה משתנה החל אובדן אנרגיית 140-200eV על מנת לקבוע את השילוב שהוא הטוב ביותר בניגוד. הבדל עוצמת הבהירה וdimmestpixel בקו-סריקה משתרעת על אותו זרחן האזור עני ועשיר זרחן מראה ערכים הגבוהים ביותר לעומת (טווח דינמי) כאשר תמונת פוסט-קצה של 175 אובדן אנרגיית eV נבחרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ESI יכול לשמש ככלי מצוין לבחינת מצבים שונים של הכרומטין וribonucleoproteins בגרעין, כי הוא מסוגל למפות במיוחד אזורים עשירים בזרחן. זה עמוק מרחיב את כמות הפרטים שניתן להשיג על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים ואינה תלוי בשיטות מנוגדות ספציפיות. אחד חסרונות של ESI הוא שהיא דורשת חלקים רזים יותר TEM הקונבנציונלי באותו המתח מאיץ. זה ניתן להתגבר על ידי עבודה עם חלקים סידוריים או בשיטות טומוגרפיה 28.
למרות שניתן להשיג הרבה מידע על ידי הסתכלות על ההפצות של זרחן וחנקן, זה עניין של להיות מסוגל גם למפות את ההפצה של חלבונים מסוימים. בשיטה שהוצגה במאמר זה, זה היה הראה כי ESI יכול להיות משולב עם שיטות המבוססות על פילמור האתר ספציפי של diaminobenzidine. למרות ששיטה זו אינה מוסיפה פוצבע החדש ll לESI, זה ברור שימושי כדי למפות את ההפצה של חלבון. זה חל בעיקר לחלבונים שאינטראקציה עם הכרומטין. אם מחקר צריך לדמיין אוכלוסיית חלבון אחד או יותר, עדיין ניתן להשתמש בשיטות התיוג באמצעות immunogold כאשר מיושמים כמכתים הטבעה מראש, לפני צילום חמצון 9. בהשוואה לשורות תאי יציבות, יש לי transfections החולף החסרון שרמות הביטוי יכולות להשתנות באופן משמעותי בין תאים ובכך להפוך אותו קשה למצוא מספר תאים המבטאים כמויות דומות של החלבון מתויג. לכן, יצירת שורות תאי יציבות מומלצת. עם זאת, אפשר לשפוט את הכמות היחסית של ביטוי חלבון באמצעות הדמיה הקרינה ובחר תאים עם ביטוי ביניים הבאים transfection החולף.
למרות תג היתוך miniSOG הוא פלורסנט עצמו, תשואת הקוונטים שלה היא גרועה באופן משמעותי מה- GFP (0.37 לעומת 0.6) 10. לpurpOSE של מיקרוסקופיה הגומלת, הוספת תג חלבון פלואורסצנטי נוסף כמו mCherry מאפשר הדמיה בתאים חיים ללא הייצור של חמצן גופייה שמתרחש עם עירור miniSOG. רמת הביטוי של החלבונים מתוייגים miniSOG, את כמות חמצן במאגר המכיל DAB, ואת ה- pH יכולים גם להשפיע על המהירות של תמונה-חמצון. לפעמים זה יכול להיות די בעייתי להשיג תמונה-חמצון הומוגנית באזור של עניין בגלל תלות אור תגובת פוטו-החמצון. צילום חמצון ממושך יכול לגרום להכתמה ספציפיות והתצהיר של יותר מדי מתכת כבדה במדגם, שיכול לסבך את זיהוי של אותות אלמנט ספציפי על ידי ESI. תהליך צילום החמצון הוא די זמן רב, כך שבדרך כלל רק באזור קטן מאוד המכיל כמה תאים על coverslip בדרך כלל מוכתם.
הראינו שילוב של miniSOG מתויג חלבונים עם ESI באמצעות monolayer של חסיד huשורת תאי סרטן אדם. בעיקרון, השיטה יכולה גם להיות מיושמת על כל מדגם אחר (שמרים, חיידקים, רקמות, עובר) כל עוד זה אפשרי לבטא חלבון miniSOG מתויג ברמות סבירות ושקיפות עוד ודיפוזיה של חמצן וDAB הוא גבוה מספיק כדי לאפשר צילום חמצון נאות וצביעה כך הומוגנית. לתאי השעיה, זה יהיה יתרון לתקן את המיקום של תאים בתלוש לכסות באמצעות דבק כגון פולי-L ליזין. עבור דגימות עבות יותר, מטרות עם צמצם מספרי נמוך תשיג תאורה הומוגנית יותר, אבל ייקחו זמן רב יותר לתמונה-חמצן.
יש לנו הצגנו את השימוש בחלבוני ההיתוך מתויג miniSOG הקרובים לפרוטוקול המקורי שפורסם על ידי שו et al 10 אפשרי -. כולל השימוש בtetroxide אוסמיום. שם זה יכול להיות שנצפה כי, מלבד מועדף על הפקדת DAB-פולימרים וקרומים, tetroxide אוסמיום מראה כמה תגובתיות ובתצהיר על רוב החומר הביולוגי בדגימה (10 איור 3). יש tetroxide אוסמיום קצה יסודות ב 45 eV. האיתותים וplasmons יכולים להיות על גבי ספקטרום אובדן אנרגיית האלקטרון כעובי של עליות הדגימה ואלקטרונים בודדים לעבור אירועי אובדן אנרגיה מרובים במהלך מעבר בדגימה. זה יכול להגביל את איכות מפות יסודות זרחן אם Oso 4 ריכוזים גבוהים משמשים בהכנת מדגם. הריכוזים שבם השתמשו כאן, שהם נמוכים באופן משמעותי ממה שהיה בשימוש בעבר 10, אפשרו לדור של מפות זרחן באיכות טובות. בניסוי באמצעות miniSOG מתויג חלבונים שדורש Oso 4 ריכוזים גבוהים יותר, הריכוז הטוב ביותר שעדיין מאפשר יצירת מפת זרחן הטוב יצטרך להיקבע באופן אמפירי.
מצאנו כי פולימר DAB שיוצר במוקדי תיקון DNA הוא sufficiently צפוף להיראות במצב TEM קונבנציונלי (או במצב אפס אובדן עם ניגוד אפילו טוב יותר) גם כאשר לאחר קיבוע עם tetroxide אוסמיום מושמט (ראה איור 8). הפילוח של האותות שנרשמו בדרך זו היה חזק כמו באמצעות הדגימות שטופלו באוסמיום. בהתאם לחלבון הגרעיני שיש להיות דמיינו, בגודל של המבנים שהיא יוצרת ואת הצורך לדמיין מערכות קרום, השימוש בtetroxide אוסמיום אולי לא יהיה צורך והשמטתה תסיר את הפוטנציאל של מיסוך חתימת היסודות של זרחן.
בהשוואה לפרסומים אחרים באמצעות ESI 18,29,30 השתמשנו הגדרות שונות לתמונות לפני ואחרי-קצה כדי ליצור מפות יחס בסיסיות עם הסכום הנמוך ביותר של רעש. באופן אמפירי שנקבענו ההגדרות שהוצגו בכתב היד (ראה איור 9). ההגדרות שבחר בקצוות צריכים להוביל לתיקון eleמפות נפשיות אלא אם חלונות האוסף חופפים עם גורמים אחרים שנמצאים במדגם. במקרה שלנו, גופרית יכולה להיות אלמנט כזה. מאז ריכוז גופרית (המתרחש במתיונין וציסטאין חומצות אמינו) הוא נמוך מאוד ותורם למפה מחושבת רק בסכום זניח, אנו מאמינים יחס S / N טוב יותר שהושגנו באמצעות ההגדרות משמשות כאן עולה על החסרונות שעלול להתעורר מעקבות של גופרית במדגם.
אנחנו חשפו את ultrastructure של DRFs ברזולוציות ננומטר באמצעות חלבוני תיקון ה- DNA MDC1, 53BP1 וRad52 בשילוב עם טכניקות ESI וTEM. הארגון של הכרומטין ולוקליזציה חלבון תיקון פרט DSB הוחלט שימוש בגישה זו. הלוקליזציה שלהם בתחומים עשירים בנגעי DNA הבאים DNA מיקרו-קרינת לייזר והנטייה של חלבוני תיקון כדי למלא את החלל שבין רכסי הכרומטין הוצגה. במקרה של Rad52, שPLAי"ש תפקיד ברקומבינציה ההומולוגית, ההיווצרות של מבנים כדוריים כמו גוף-גרעיניים לאורך המסלול פגוע הלייזר יכול להיבחן וזה היה בניגוד לשני חלבונים נבדקו האחרים. כאשר הנזק מוחל על ידי קרינת גמא, 53BP1 יצר מוקדים ברחבי הכרומטין הפגום. נראה הרכב והמיקום היחסי של הכרומטין וחלבון במוקדים לשנות לאורך זמן. יכול כל בקלות לקבל את הקשר בין חלבונים אלה והכרומטין הפגום, כמו גם שינויים בארגון של הכרומטין וההרכב של גופים גרעיניים באמצעות טכניקת ESI ואילו מיקרוסקופיה brightfield הקונבנציונלית באמצעות אורניום ולהוביל סוכנים מנוגדים שלא יכול להעריך נכסים אלה באופן ישיר. כך, טכניקה זו מציגה פוטנציאל גבוה ללימוד יחסי מבנה-תפקוד, במיוחד לתהליכים הפועלים על ה- DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Gridded 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-2-14-CGRD | not made for immersion objectives |
| LR White: acryl resin | emsdiasum | 14381 | |
| LR White accelerator | emsdiasum | 14385 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets | Sigma | D5905 | |
| Slim Bar Grids 300 Mesh | SPI | 1161123 | |
| Tungsten-Point Lab Pen | emsdiasum | 41148 | |
| Osmium Tetroxide | emsdiasum | 19100 | |
| Carbon Coater 208 carbon | Cressington | ||
| Ultra microtome Leica EM UC6 | Leica | ||
| Photoshop CS5 | Adobe | might even work with older versions | |
| Digital Micrograph V.2.30 | Gatan | might even work with older versions | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H-1399 | |
| Effectene | Quiagen | ||
| MiniSOG-Constructs | Tsien-Lab | tsienlab@yahoo.com | |
| MDC1 miniSOG mCherry | |||
| 53BP1 miniSOG mCherry | |||
| Rad52 miniSOG mCherry | |||
| cesium 137 radiation source "MARK 1" | (J.L. Shepherd & Associated) | ||
| ImageJ/FiJi | open source | http://fiji.sc/Fiji | |
| 2 ml Eppendorf tubes | Fisherbrand | 05-408-146 | |
| Diamond Knife ultra 35° | Diatome | ||
| Trimming Knife ultratrim | Diatome | ||
| Sodium cacodylate trihydrate | emsdiasum | 12300 | Caution Toxic! |
| Glutaraldehyde EM Grade 8% | emsdiasum | 16020 | Caution Toxic! |
| Sodium phosphate dibasic | emsdiasum | 21180 | |
| Sodium phosphate monobasic | emsdiasum | 21190 | |
| Paraformaldehyde | emsdiasum | 19202 | |
| Osmium tetroxide 4% solution | emsdiasum | 19150 | |
| Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Hydrochloric Acid | Fisherbrand | A142-212 | |
| Sodium Hydroxide Solution 10M | Fluka | 72068 | |
| Oxygen | Medigas | ||
| 3-Amino-1,2,4-triazole | Sigma | A8056 | |
| Potassium cyanide | Sigma | 207810 | Caution Toxic! |
| Ethanol | emsdiasum | 15058 | Caution Toxic! |
| Razor blade Single Edge Carbon Steel | emsdiasum | 71960 | Caution Sharp! |
| DMEM | Sigma | D 5546 | |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | |
| G418 | Life Technologies | 11811-023 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Transmission Electron Microscope 200 kV | JEOL | 2100 | |
| GIF Tridiem 863 Energy filter | Gatan |
References
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).
- Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. Stoichiometric analysis of protein- and nucleic acid-based structures in the cell nucleus. Micron (Oxford, England: 1993). 30, 151-157 (1999).
- Michael J Hendzel, F. M. B., Bazett-Jones, D. P. Direct Visualization of a Protein Nuclear Architecture. Molecular biology of the cell. 10, 2051 (1999).
- Ottensmeyer, F. P., Andrew, J. W. High-resolution microanalysis of biological specimens by electron energy loss spectroscopy and by electron spectroscopic imaging. Journal of ultrastructure research. 72, 336-348 (1980).
- Leapman, R. D., Ornberg, R. L. Quantitative electron energy loss spectroscopy in biology. Ultramicroscopy. 24, 251-268 (1988).
- Simon, G. T. Electron spectroscopic imaging. Ultrastructural pathology. 11, 705-710 (1987).
- Egerton, R. Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , Springer. (2011).
- Aronova, M. A., Kim, Y. C., Zhang, G., Leapman, R. D. Quantification and thickness correction of EFTEM phosphorus maps. Ultramicroscopy. 107, 232-244 (2007).
- Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. Chimeric molecules employing horseradish peroxidase as reporter enzyme for protein localization in the electron microscope. Methods in enzymology. 327, 35-45 (2000).
- Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS biology. 9, e1001041 (2011).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science (New York, NY). 296, 503-507 (2002).
- Fernandez-Capetillo, O., Celeste, A., Nussenzweig, A. Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors. Cell cycle (Georgetown, Tex). 2, 426-427 (2003).
- Haaf, T., Golub, E. I., Reddy, G., Radding, C. M., Ward, D. C. Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 2298-2302 (1995).
- Maser, R. S., Monsen, K. J., Nelms, B. E., Petrini, J. H. hMre11 and hRad50 nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 17, 6087-6096 (1997).
- Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA repair. 9, 1219-1228 (2010).
- Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. Journal of cell science. 125, 3529-3534 (2012).
- Dellaire, G., Kepkay, R., Bazett-Jones, D. P. High resolution imaging of changes in the structure and spatial organization of chromatin, gamma-H2A.X and the MRN complex within etoposide-induced DNA repair foci. Cell cycle (Georgetown, Tex). 8, 3750-3769 (2009).
- Kruhlak, M. J., et al. Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks. The Journal of Cell Biology. 172, 823-834 (2006).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor protocols. 2010, (2010).
- Zeyda, M., Borth, N., Kunert, R., Katinger, H. Optimization of sorting conditions for the selection of stable, high-producing mammalian cell lines. Biotechnology progress. 15, 953-957 (1999).
- Dellaire, G., Nisman, R., Bazett-Jones, D. P. Correlative light and electron spectroscopic imaging of chromatin in situ. Methods in enzymology. , 375-456 (2004).
- Campbell, S., Ismail, I. H., Young, L. C., Poirier, G. G., Hendzel, M. J. Polycomb repressive complex 2 contributes to DNA double-strand break repair. Cell cycle. 12, 2675-2683 (2013).
- Mortusewicz, O., et al. Recruitment of RNA polymerase II cofactor PC4 to DNA damage sites. J Cell Biol. 183, 769-776 (2008).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173, 195-206 (2006).
- Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Frontiers in genetics. 4, 135 (2013).
- Lukas, C., et al. 53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress. Nature. 13, 243-253 (2011).
- Harrigan, J. A., et al. Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells. The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).
- Aronova, M. A., et al. Reprint of 'Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST). J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).
- Fussner, E., et al. Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming. The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).
- Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin. Cell cycle. 10, Georgetown, Tex. 308-322 (2011).
