Abstract
De grenzen van optische resolutie en de uitdaging van het identificeren van specifieke eiwit bevolkingsgroepen in transmissie elektronenmicroscopie zijn obstakels in de celbiologie geweest. Veel verschijnselen kunnen niet verklaard worden door in vitro analyse in vereenvoudigde systemen en aanvullende structurele informatie nodig in situ, in het bijzonder in het traject tussen 1 nm en 0,1 urn, teneinde te worden begrepen. Hier, elektronen spectroscopische beeldvorming, een transmissie elektronenmicroscopie techniek die gelijktijdig in kaart brengen van de verdeling van eiwitten en nucleïnezuren mogelijk maakt, en een uitdrukking tag, miniSOG, worden gecombineerd om de structuur en organisatie van DNA double-strand break repair foci bestuderen.
Introduction
Ondanks de aanzienlijke vooruitgang in het licht microscopie afgelopen jaren 1, cel-biologen nog steeds last van een hiaat in de resolutie. Dit beperkt begrip van de structuur-functie relaties in de fundamentele cellulaire processen die de gecoördineerde wisselwerking tussen macromoleculaire complexen omvatten (bijvoorbeeld in chromatine remodeling, reparatie van DNA, RNA transcriptie en DNA-replicatie). Hoewel transmissie elektronenmicroscopen (TEM) s de vereiste resolutie, het moeilijk is geweest om deze processen structureel vanwege het onvermogen definiëren eiwitten te labelen terwijl ook in staat om de biochemische samenstelling van de gevisualiseerde structuren te bepalen. Aangezien interne membranen te differentiëren nucleaire structuren, is de kern bijzonder uitdagend. Electron spectroscopische beeldvorming (ESI) lost sommige beperkingen doordat de gelijktijdige detectie en differentiatie van DNA, RNA en protein-gebaseerde nucleaire structuren 2-5.
Elektron spectroscopische beeldvorming:
Om elementaire verdeling met hoge gevoeligheid en resolutie van de elektronenmicroscoop kaart, kan men een beeldspectrometer dat elektronen die inelastisch verstrooid door interactie met binnenschaal elektronen van een element in het monster 6 selecteert gebruiken. Omdat element-specifieke hoeveelheden energie verloren als gevolg van ionisatie van atomen in het monster, kunnen deze elektronen worden gescheiden en gevisualiseerd met behulp van een spectrometer die de elektronenmicroscoop is bevestigd. Aldus analyse van het spectrum van de electronen die interactie met het monster laat kwalitatieve en kwantitatieve informatie over de elementaire samenstelling van het monster 7. Elektronen die geen energie verliezen bij het passeren van het monster zijn te vinden in de "nul-verlies piek" van het elektron energieverliesspectrum. De overvloed van deze elektronen is gerelateerd aan de massa, de dichtheid en dikte van het monster en bestaat uit elektronen die door het monster zonder te botsen met het monster of verlies van energie tijdens passage door het monster. Deze informatie kan nuttig zijn voor absolute kwantificering van het aantal atomen van een bepaald element aanwezig in het monster 8 zijn.
Omdat biologische monsters voornamelijk uit lichte elementen die slecht afbuigen de elektronen in de invallende bundel van de TEM, kleuringen die zware metaalzouten hebben om contrast in het monster te genereren worden toegepast. Het gebrek aan specificiteit van de meeste van deze contrastmiddelen en het onvermogen om meer dan één vlek indien specificiteit mogelijk zichtbaar is de waarde van conventionele elektronenmicroscopie beperkt in de studie van de kern. ESI heeft belangrijke voordelen ten opzichte van conventionele TEM, met name voor de studie van structuur van de celkern.Het is mogelijk om de fosfor-rijke natuur van DNA- en RNA-bevattende macromoleculaire complexen benutten nucleoproteïne complexen eiwitcomplexen onderscheiden en verschillende nucleoproteïne complexen op basis van hun dichtheid van nucleïnezuren lossen. Het resterende biologisch materiaal kan worden afgebeeld op basis van de overvloed aan stikstof. Mapping alleen deze twee elementen en de analyse van hun verspreiding en relatieve rijkdom binnen de verschillende anatomische structuren geeft ons veel informatie over de kern. Zo is het gemakkelijk om chromatine en de ribosomen in de kaart die fosfor overvloed identificeren. De interchromatin ruimte, porie complexen nucleaire en nucleaire organen, daarentegen, kan gemakkelijk worden gedetecteerd in beeld stikstof map.
Mini singlet zuurstof generator systeem (miniSOG)
Terwijl ESI is een krachtige techniek voor een studie in situ chromatinestructuur omdat nemens voordeel van de kenmerkende verhoudingen in elementaire samenstelling tussen fosfor en stikstof, de elementaire samenstelling kan normaliter worden gebruikt om te discrimineren tussen verschillende populaties van eiwitcomplexen. Antilichamen gelabeld met kleine gouddeeltjes in het nanobereik zijn op grote schaal gebruikt om de locatie van individuele moleculen in kaart. Aangezien de gouddeeltje gewoonlijk verbonden is aan een secundair antilichaam, verschijnt binnen een omtrek van ongeveer 20 nm rond gedetecteerd door het primaire antilichaam epitoop. Bij post-inbedding samples kunnen antilichamen alleen de epitopen die zijn blootgesteld aan het oppervlak van de secties detecteren. Hoewel het mogelijk is de aanwezigheid van een antigeen te bewijzen en relateren aan een bepaalde anatomische structuur van de cel, de informatie die wordt verkregen onvolledig is, aangezien de meeste epitopen worden verduisterd door hars. Pre-inbedding technieken die vergelijkbaar protocollen die voor fluorescentiemicroscopie gebruiken, toegang tot antigenen toestaan gedurendede gehele diepte van het monster maar de permeabilisatie stappen die nodig zijn om het antilichaam aan de cel penetreren vereisen typisch verwijderd lipidemembranen en componenten die niet aldehyden kunnen worden vastgesteld verwijderen. Bovendien is de voorkeur aldehyde fixeermiddel voor ultrastructuur behoud, glutaaraldehyde, gewoonlijk vernietigt epitopen en dientengevolge is paraformaldehyde typisch vereist. Dit is minder effectief bij eiwit-eiwit crosslinking. Een ander nadeel van antilichamen die zijn gemerkt met een gouden nanodeeltjes is dat goud een elektronen-dicht materiaal dat een sterk contrast interessante structurele details van het monster, die zwakker contrast heeft kunnen verhullen ontstaat.
De opkomst van het groen fluorescerend eiwit (GFP) als een expressie gebracht eiwit tag heeft getransformeerd het gebruik van fluorescentiemicroscopie om vragen te beantwoorden in de celbiologie. Tagging een eiwit met een kleine fluorescerende domein maakt mapping van de verdeling ervan in vivo 9. De reactieproducten van HRP kan diffunderen weg van de plaats van productie zodat de resolutie is slechter dan nanogold methode 10. Om deze problemen te omzeilen, werd de flitser / ReAsH ontwikkeld 11. Het bestaat uit recombinante fusie-eiwitten die een tetracysteine motief bezitten. Dit motief maakt de binding vaneen biarsenic fluorofoor. Bij opwinding, het gebonden Flash of ReAsH staat is de zeer reactieve singlet zuurstof en dus photoconvert diaminobenzidine (DAB) in een polymeer dat direct op de plaats van de gemerkte eiwitten precipiteert genereren. De DAB polymeer kan worden gekleurd met osmiumtetroxide, wat electron dichtheid en dus kunnen worden gebruikt om de verdeling van het recombinante fusie-eiwit in de TEM in kaart.
In 2011, Shu et al. 10 heeft de miniSOG systeem, dat bestaat uit een kleine 106 aminozuren fusion tag afgeleid van een flavoproteïne van Arabidopsis die fluorescent en kan vele singlet zuurstofradicalen te maken bij excitatie met 448 nm blauw licht. Deze singlet zuurstof radicalen kan worden gebruikt voor foto-oxideren diaminobenzidine polymeren aan en nabij het oppervlak van de gelabelde eiwitten, die aanzienlijk dichter dan immunogoud gemerkte antilichamen 11 te vormen. Terwijl de flitser / ReAsH systeem vereist waardoor de fluorchroom en diaminobenzidine in de cellen voordat u de photoconversion het miniSOG vereist alleen diaminobenzidine en licht en bovendien is ongeveer tweemaal zo doeltreffend polymeriseren diaminobenzidine. Hier miniSOG wordt toegepast in combinatie met ESI om de ultrastructuur van DNA herstel foci in kaart.
DNA-herstel foci (DRF)
Ongerepareerde DNA dubbele breuken vormen een ernstige bedreiging voor de cel omdat ze kunnen leiden tot translocaties en verlies van genetische informatie. Op zijn beurt kan leiden tot veroudering, kanker, en celdood. Veel eiwitten die betrokken zijn bij DNA dubbele breuken reparatie ophopen in brandpunten die monteren rond een DNA dubbele streng te breken 12-14. Hoewel hun functie niet bekend is, vertegenwoordigen zij de plaats in de kern die de DNA dubbele streng breuk bevat en de plaats van DNA dubbele streng breuk reparatie.
DNA-reparatie foci (DRF) zijn gekarakteriseerd door fluorescentiemicroscopie en zij dienen als biomarkers voor DNA schade 12,15. Ze zijn enorm ten opzichte van de grootte van het dubbelstrengs breuken en waren betrekkelijk homogeen beschouwd zolang Language superresolutietechnieken studies toonden aanwijzingen van sub-compartimentering van moleculen binnen iedere 16 gericht. Om te begrijpen hoe deze plaatsen zijn georganiseerd, dient te visualiseren alle onderliggende biologische structuren ten opzichte van elkaar. Dit kan niet worden bereikt door fluorescentiemicroscopie maar kan door elektronenmicroscopie 17,18. Hier wordt een methode beschreven die elektronen spectroscopische beeldvorming combineert met de miniSOG methode om het potentieel van deze gecombineerde aanpak illustreren aan de ultrastructuur van DNA double-strand break repair verkennen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generatie van miniSOG Cell-lijnen
- Groei U2OS (humane osteosarcoom) -cellen in een 35 mm schotel met 2 ml van laag glucose Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) dat is aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO 2 atmosfeer.
- Transfecteren de cellen wanneer ze 80% samenvloeiing door lipofectie met gezuiverd transfectie kwaliteit (A269 / 280-verhouding 1,8-2,0) plasmide constructen die de sequenties voor miniSOG en mCherry gelabeld reparatie-eiwitten volgens het protocol van de fabrikant van de transfectiereagens 19. De miniSOG expressieplasmiden kunnen uit de Tsien-Lab worden besteld: http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
- Sorteer de cellen die het recombinant eiwit met de miniSOG en mCherry tag door fluorescentie geactiveerde celsortering twee dagen na de transfectie. Verzamelen cellenmet tussenliggende fluorescentie-intensiteit om cellen die overexpressie 20 voorkomen.
- Kweek de positieve cellen op een 10 cm schaal in 10 ml DMEM-medium dat is aangevuld met 10% FBS en 0,6 ug / ml van het selectiemiddel G418 (Geneticine).
- Nadat zichtbare kolonies ontstaan op de platen, scherm mCherry positieve kolonies onder gebruikmaking van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop en teken cirkels eromheen (op de bodem van de plaat) met een permanente marker. Gebruik een lage vergroting lucht objectief (bijvoorbeeld 10x) en pick-klonen met steriele techniek voorzichtig krassen de kolonies af en langzaam zuigen ze in een steriele 1000 ul pipetpunt.
- Vouw de geselecteerde kolonies en delen van hen bevriezen beneden met behulp van het groeimedium in stap 1.1, aangevuld met 10% dimethylsulfoxide beschreven. Test de cellen voor DRF vorming door de groeiende ze op steriele 18 x 18 mm 2 dekglaasjes en hen blootstellen aan2 Gy straling. De bestraalde cellen die stabiel uitdrukken van een miniSOG mCherry gelabeld reparatie eiwit moet de typische brandpunt patroon kenmerk van DSB's tonen wanneer gevisualiseerd met een fluorescentie microscoop met behulp van een filter-set voor de beeldvorming mCherry.
2. Cell Culture
- Cultuur U2OS cellen die stabiel de uiting van de miniSOG en mCherry gelabeld reparatie-eiwitten onder de in stap 1.1 omstandigheden. Kweek cellen 80% confluentie in een 35 mm diameter glazen bodem schaaltje met 2 ml DMEM. Zorg ervoor dat de lijm die het dekglas hecht aan de kunststof en de gebruikte kunststof is bestand tegen waterige en alcoholische oplossingen en bestand tegen de gebruikte hars!
- Alvorens tot het experiment schetsen een klein gebied van ongeveer 1 mm 2 dat cellen die het ectopische eiwitten door krassen met een steriele diamant pen met behulp van een fluorescentie microscoop op het gebied van belang te identificeren bevat. U kunt ook gebruik maken van een glazen bodem schaal that bevat een dekglaasje met een vooraf geëtste raster ingebouwd in het dekglaasje.
OPMERKING: Als met behulp van hoge kwaliteit correlatieve microscopie combineren ESI en fluorescentie microscopische foto's 21, zorg ervoor dat de dikte van het dekglaasje is compatibel met olie-immersie doelstellingen. Het moet de dikte No. 1,5 (0,16-0,18 mm) heeft. Kies een gebied dicht bij het centrum van de schotel voor de regio in de TEM te onderzoeken om problemen met de polymerisatie van de hars die zich kunnen voordoen in de buurt van de randen te voorkomen (zie punt 4,10-4,13).
3. DNA-schade Inductie
- Bestralen van de cellen met gammastraling, gebruikt een radionabootsende geneesmiddel of induceren schade door micro laser bestraling op een confocale microscoop (bijvoorbeeld zoals beschreven in 18,22 of 23).
- In dit voorbeeld, bestralen van de cellen met 2 en 6 Gy van gammastraling in een cesium-137 stralingsbron of laser microirradiate met de 405 nm solid state laser van een confocale microscoop na sensibiliseren de cellen gedurende 20 min met 0,5 ug / ml Hoechst.
4. Monstervoorbereiding
- Fixeer de cellen met 1 ml 4% paraformaldehyde in 0,1 M LET natriumcacodylaat buffer of 0,1 M fosfaatbuffer pH 7,4 gedurende 30 min bij kamertemperatuur in het donker.
LET OP: Paraformaldehyde en natriumcacodylaat zijn giftig! Draag handschoenen en gooi de giftige stoffen adequaat. - Was de cellen tweemaal met 4 ml 0,1 M natriumcacodylaat pH 7,4 of pH 7,4 fosfaatbuffer.
- Behandel de gefixeerde cellen met 2 ml 50 mM glycine, 5 mM aminotriazool en 10 mM kalium- cyanide VOORZICHTIG in 0,1 M natriumcacodylaat buffer en 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4) (controleer de pH!) Gedurende 30 min teneinde te blokkeren gereageerde aldehydegroepen en de reactieve zuurstof species gegenereerd door heem groepen te onderdrukken, waarbij de achtergrond kan verhogen.
LET OP: Kaliumcyanide is uiterst giftig! Woor handschoenen, werken onder een kap en afvoeren van de giftige stoffen adequaat. De reactie is erg gevoelig voor pH dus is het belangrijk dat de pH gecontroleerd en nauwkeurig. - Noteer het gebied dat werd geselecteerd in stap 2.2 in 2D of 3D op een geïnverteerde fluorescentiemicroscoop, indien correlatieve microscopie gewenst.
- Maak een 1 mg / ml diaminobenzidine hydrochloride VOORZICHTIG oplossing door een 10 mg diaminobenzidine hydrochloride tablet in een 2 ml microcentrifugebuis. Voeg 980 ul gedestilleerd H2O en 20 pl geconcentreerd zoutzuur (11,65 M) en meng totdat de oplossing licht bruin en doorschijnend. Verdun deze oplossing in 0,1 M fosfaat of 0,1 M natriumcacodylaat buffer tot een eindconcentratie van 1 mg / ml, terwijl de pH met natriumhydroxide op een pH tussen 7,0 en 7,6 (pH 7,4 wordt aanbevolen).
LET OP: Diaminobenzidine is giftig! Draag handschoenen en gooi de giftige stoffen adequaat. - Voor foto-oxidatie, replace de buffer met 2 ml van een 1 mg / ml diaminobenzidine hydrochloride-oplossing in 0,1 M natriumcacodylaat buffer of fosfaatbuffer. Bescherm tegen licht oplossing en koel het af op ijs tot 4 ° C teneinde de oplosbaarheid van zuurstof te verhogen. Verzadigen oplossing met zuurstof door doorleiden van zuurstof door de oplossing (gebruik een slang die in de oplossing is ingebracht en verbonden met een zuurstoffles). Controleer de pH opnieuw en aanpassen als dat nodig is.
NB: Het is van cruciaal belang voor de oxidatie reactie die de pH tussen pH 7,0 en pH 7,6. - Monteer de schotel met de vaste cellen voorzichtig op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop uitgerust met een 40x olie-immersie objectief en verplaatsen naar het gebied van de rente. Prikkelen de miniSOG tag met blauw licht door het gebruik van filter kubussen voor GFP of GVB. MiniSOG heeft een excitatie maximum bij 448 nm met een schouder bij 473 nm 10.
- Ga verder met de verlichting, zelfs nadat de groene miniSOG fluorescentie hais volledig verdwenen en tot de bruine foto-oxidatie product van de gepolymeriseerde diaminobenzidine komt in het doorgelaten licht kanaal. Wanneer het oxidatieproduct zichtbaar in de meeste cellen, zet de fluorescentieverlichting om de foto-oxidatie te stoppen.
OPMERKING: Foto-oxidatie kan tot enkele minuten, afhankelijk van het objectief, filter transmissie golflengten en efficiëntie, en de verlichting bron. - Postfix de cellen met 1 ml van 2% glutaaraldehyde in 0,1 M natriumcacodylaat pH 7,4 buffer of fosfaatbuffer pH 7,4 gedurende 30 min.
- Bevestig de membranen van de cellen met 0,1% -0,5% osmiumtetroxide gedurende 20 min in 0,1 M natriumcacodylaat pH 7,4 of 0,1 M fosfaatbuffer pH 7,4.
NB: Het is aanbevolen om de laagst mogelijke concentratie van osmiumtetroxide nodig om de membranen te stabiliseren gebruiken. Aangezien de gepolymeriseerde DAB precipitaten een hoge dichtheid van stikstof die direct door ESI een sterk kan worden gedetecteerdosmium kleuring is niet nodig om de miniSOG-gelabeld eiwit te identificeren en schadelijk voor de ESI kunnen zijn. Osmiumtetroxide is zeer giftig! Werk in een zuurkast en gooi het giftige afval adequaat. - Gedehydreerd, de cellen door een ethanol serie gebruikt 30%, 50%, 70%, 90%, 98% 100% ethanol stappen (ieder 5 min). Vervolgens incuberen van de cellen in een 1: 1 mengsel van 100% ethanol en acrylhars (LR White) en zet de schaal op een schudder gedurende 4 uur tot infiltratie in de cellen vergemakkelijken voordat de cellen te incuberen gedurende ten minste 4 uur bij 100 % acrylhars (LR White).
- Om de hars te polymeriseren, afgesneden van de deksel van een label 2 ml microcentrifugebuis met een scheermesje en vacht van de velg acrylhars accelerator. Zorg ervoor dat het gaspedaal alleen betrekking heeft op de velg en stroomt niet in de buis. Vervolgens zorgvuldig vul de buis ongeveer tweederde met LR White hars met behulp van een Pasteur pipet. Zorg ervoor dat de hars niet in contact with het gaspedaal op de rand!
- Verwijder het hars dat de cellen geïnfiltreerd in de schaal en zet de schaal ondersteboven op de rechtopstaande microcentrifugebuis zodat de breedte van de buis bijna volledig het glas bedekt kijkvenster van de schotel vult.
- Wacht 1 tot 2 min van het gaspedaal aan de buis en het dekglaasje af te dichten, dan keren de buis zodanig dat de hars in de buis omvat nu cellen.
- Plaats de schaal met de buis in een oven bij 60 ° C en genezen gedurende 12 uur.
- Wanneer het blok wordt uitgehard, verwijdert de schaal met de bijgevoegde hars gevulde microcentrifugebuis uit de oven en scheiden de microcentrifugebuis van de schotel. Faciliteren scheiding door vries-dooi cycli in vloeibare stikstof en warm water.
- Gooi de glazen onderste schaal voorzichtig opengesneden de microcentrifugebuis met een scheermesje om het blok te verwijderen.
- Het etiket van het blok met een permanent marker.
- Gebruik een scheermesje om trim het blok zodat niets maar 1 mm 2 gebied dat het gebied eerder gemarkeerde de diamant of wolfraam pen bevat (of bevat het gebied met de cellen van belang) blijft.
- Monteer het blok in een ultramicrotoom, trim het blok met een Stanleymes en snijd ultra-dunne secties van ongeveer 50 nm met behulp van een diamant mes.
- Pick-up van de secties op high-transmissie 300 mesh netten. Deze roosters zeer kleine spijlen en dus omvatten minder cellen in het interessegebied.
- De vacht van de hoofdstukken over de roosters met ongeveer 0,2-0,4 nm koolstof met een koolstofbedamper te helpen stabiliseren ze onder de elektronenbundel van de TEM.
5. Electron Microscopy
- Laad de roosters in een TEM die is uitgerust met een energiefilter. Na het afstemmen van de microscoop en de energie-filter volgens de instructies van de fabrikant, inspecteren de cellen op de secties in de lage vergroting mode (normale transmissie) en vergelijkze data fluorescentie wanneer nodig (verkregen bij stap 4,4).
- Zodra een kern met interessante eigenschappen (DNA schade track of DNA-reparatie brandpunten) wordt gevonden, schakelt de energie filtering modus en neem een dikte kaart.
OPMERKING: Deze procedure omvat de opname van een zero-verlies en een ongefilterd beeld. Dikten tot 0,3 vrije weglengte (30% van de elektronen van de invallende bundel wordt verstrooid door het monster) zijn dun genoeg om goede elementaire kaarten genereren. - Neem verhouding kaarten van de elementen fosfor en stikstof met de software die het energiefilter van de gebruikte microscoop bestuurt. Noteer de fosfor kaart na rand beelden bij 175 eV energieverlies met een spleetbreedte van 20 eV en pre-edge beelden bij 120 eV energieverlies, ook met een spleetbreedte van 20 eV. Voor de stikstof kaarten opnemen na de rand beelden bij 447 eV met een spleetbreedte van 35 eV en pre-edge beelden bij 358 eV, ook met een spleetbreedte van 35 eV.
OPMERKING: Aangezien de inhoud van de afgebeelde elementen (phosphOrus en stikstof) is relatief laag (ong. 1%), kies "Ratio Afbeelding" (kwalitatieve elementaire kaart) over de "3-venster-methode" (te kwantificeren elementaire kaart) om beelden met een betere signaal-ruisverhouding te genereren.
6. Beeldverwerking
- Open de elementaire verhouding kaarten in een beeld processing software die de bestandsindeling van de verworven beelden (bijv Digital Micrograph) aankan. Kopieer de stikstof kaart in het rode kanaal en de fosfor kaart in het groene kanaal van een RGB-afbeelding, dan over elkaar en lijn de kaarten.
- Exporteer de samengestelde beeld als een Tagged Image File Format-bestand (TIFF). Open de afbeelding in een beeld processing software die lagen kunnen gebruiken (bijvoorbeeld Photoshop).
- Pas het dynamische bereik van ieder kanaal herschalen de minimum en maximum waarden in het beeld van een 8-bit data set (0 tot 255).
- Trek het fosforgehalte van het stikstofatoom kaart (deWindow "Layers") om een kwalitatieve kaart die de verdeling van eiwit wordt afgebeeld.
- Omzetten van de kaarten van het nucleïnezuur (fosfor) en het eiwit (stikstof) in de vorige stap in "geïndexeerde kleur" en maak een gele opzoektabel in de CMYK-kleurruimte voor de kaart met de nucleïnezuur distributie en een cyaan opzoektabel de niet-nucleoproteïne map tonen. De kleuren zijn gekozen maximum contrast tussen de twee elementaire maps genereren.
- Maak een nieuwe afbeelding en importeer de kaarten met de verdelingen van fosfor en eiwit als verschillende lagen. Gebruik de "screen" transparantie mode om zowel lagen bovenop elkaar te zien.
- Open de zero-loss afbeelding verworven in stap 5.2. Dit beeld vertegenwoordigt een beeld van het opgenomen gebied dat lijkt het conventionele TEM als maar bevat alleen de elektronen die zijn gepasseerd door het preparaat zonder te botsen met het monster. Exportdit beeld van een TIFF zo.
- Open de geëxporteerde afbeelding nul verlies in een foto-editor en kopieer het in de bovenste laag van het plaatje van de elementaire kaart. Lijn de afbeelding met behulp van de "screen" transparantie mode.
- Eventueel drempel van de nul-verlies afbeelding om segment het signaal dat afkomstig is van de miniSOG. Naar het resulterende beeld als een aparte laag zoals hierboven beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ESI
Vergelijking van de ESI beelden van de nucleus (figuur 1) van de conventionele TEM beelden (bijvoorbeeld figuur 7-1) toont een dramatische toename van anatomische structuren die gemakkelijk onderscheiden kan worden. De chromatine richels verschijnen in het geel en het is heel gemakkelijk om de chromocenters in muizen cellen te identificeren. Nucleoli gemakkelijk te onderscheiden van hun door chromatine structuur en verschillende kleuren, daar de voorgemonteerde ribosomen grote hoeveelheden eiwitten, welke rijk is aan stikstof, naast het RNA, dat rijk is aan fosfor bevatten al. De perifere chromatine bevindt als een dunne laag op de grens van de nucleus en de nucleaire poriën kan worden gezien als stikstofrijke structuren die de perifere chromatine onderbreken. Vaak zijn de lamina kunnen worden gezien als een zeer dun laagje blauwe buiten het perifere chromatine. In het cytoplasma, vele kleine deeltjes die rijk zijn aan fosfor kangezien worden. Deze kunnen worden geïdentificeerd als ribosomen basis van hun grootte, omvang en locatie buiten de kern. De interchromatin ruimte kan worden gezien als de eiwitrijke gebied gelegen tussen de chromatine. Hierin nucleaire organen en rijk aan kleine gele signalen, zoals ribonucleoproteïnepartikels en clusters van ribonucleoproteïnecomplex granules (Figuur 2). De laatste worden genoemd interchromatin granule clusters en worden karakteristiek verrijkt eiwitten vereist pre-mRNA splicing. Figuur 1B, C en D illustreren de verschijning van andere bekende structuren zoals mitotische chromosomen, centrosomes, mitochondria en centromeren. In figuur 2 zijn de stappen gebruikt om gekleurde samengestelde beelden van de ruwe elementaire verhouding maps genereren samengevat. Het samenvoegen van de fosfor kaart (groen) en de stikstof kaart (rood) in de RGB-kleurruimte (bovenste rij) zorgt voor een betere beoordeling van het bedrag van die elementen in het monster. However, aftrekken van het fosfor signaal de bijdrage van nucleïnezuurbevattend structuren van de stikstof kaart afbrekende aan het eiwit map (cyaan) en samen te voegen met fosfor kaart (geel) in CMYK kleurenruimte op een meer uitgesproken visuele weergave van nucleoproteïne en niet-nucleoproteïne (onderste rij). Dit maakt het mogelijk de gegevens gemakkelijker worden geïnterpreteerd door individuen onbekend met de technologie.
Laser microirradiated cellen die MDC1, 53BP1 en Rad52
Door de gebruiker gedefinieerde grootte, vorm en plaats van de laser schade tracks, regio DAB afzetting in de laser microirradiated cellen zijn zeer gemakkelijk te vinden in de TEM bij gebruik van het systeem miniSOG. Foto's die in lage vergroting transmissiemodus (dwz conventionele helderveld TEM) onthullen de karakteristieke schade sporen en te vergelijken met gegevens die zijn opgenomen met een fluorescentiemicroscoop voorafgaand aan het inbedden.Dit is vooral handig als correlatieve microscopie wordt bedoeld, want het maakt een eenvoudige identificatie en verplaatsing van enkele kernen. (Afbeelding 2-4).
Het eerste voorbeeld (figuur 3) toont een U2OS cellijn stabiel tot expressie MDC1 miniSOG-mCherry. In een laser microirradiation experiment, de rekrutering van de MDC1 met de miniSOG en mChrerry markeringen was vergelijkbaar met GFP-tag versies van dit eiwit (gegevens niet getoond). Vaststelling van de cellen 1 uur na DNA schade inductie en de monsterbereiding voor de TEM, werden de MDC1 schade sporen gemakkelijk te identificeren in de ultra-dunne secties normale TEM modus donkere strepen over de kernen, die zeer goed aan de fluorescentiegegevens overeen ( Afbeelding 3-5). Wanneer we de verdeling van het eiwit kan een duidelijke toename van stikstof signaal waargenomen bij de laser beschadigde plaatsen. Het moet worden opgemerkt dat dit in de eerste plaats wordt veroorzaakt door de gepolymeriseerde diami nobenzidine, dat rijk is aan stikstof en versterkt het signaal van de miniSOG gelabeld reparatie eiwitten, in plaats van uitsluitend door de accumulatie van reparatie-eiwitten tot schade spoor. Vergelijking van de chromatinestructuur in de rest van de kern van de structuur schade sporen toont een duidelijk verschil. De beschadigde chromatine (die wordt getoond binnen de gestreepte lijnen in figuur 3) lijkt meer decondensed in tegenstelling tot de niet bestraalde chromatine, die optreedt in dikke ribbels in het nucleoplasma. Binnen de schade tracks, konden nucleaire lichamen (200-300 nm) (met pijlen aangegeven in figuur 3 II2, IIb, IIc en lila) die rijk MDC1-miniSOG eiwit, maar vrij zijn van nucleïnezuur ook worden waargenomen. Het zou heel moeilijk om deze nucleaire lichamen chromatine-vrije structuren te definiëren, zonder deze techniek. Het suggereert ook een extra niveau van complexiteit om schade sites die niet wordt voorspeld door de bekende biochemie van MDC1.
ntent "> Wat de schade sporen van 53BP1 (figuur 4) die zijn gemaakt onder dezelfde omstandigheden als eerder beschreven schade-MDC1 getransfecteerde cellen, kan bijna dezelfde resultaten worden waargenomen. Het signaal dat werd geproduceerd door foto-oxidatie van het miniSOG was druk en vulde de ruimte tussen de vouwen van chromatine. bevlekt nucleaire lichamen kunnen ook worden waargenomen (gemarkeerd met een pijl in figuur 4 D, E, F).Uit experimenten met Rad52-GFP-constructen, is het bekend dat Rad52 kleine heldere microcompartements zal vormen 24 langs een laser geïnduceerde schade spoor. Vanwege de resolutie limiet van conventionele licht microscopen, is het onduidelijk hoe groot deze structuren werkelijk zijn en hoe zij betrekking hebben op het beschadigde DNA. Wat de TEM beeld van laser bestraalde kernen U2OS constitutief Rad52-miniSOG-mCherry, werden de grootte van deze organen gemeten als gemiddeld (150-250 nm). het isnog verrassender om te kijken naar deze brandpunten met ESI. In tegenstelling tot de voorgaande voorbeelden, de Rad52-miniSOG-mCherry foci lijken heel anders eveneens op dezelfde schade spoor en lijken compacte kern body-achtige structuren die bestaan uit eiwitten en geen detecteerbare nucleïnezuren in hun interieur. Op basis kijken naar de nucleïnezuur / eiwit-verhouding in de beschadigde gebieden verkregen met onze gecombineerde miniSOG en ESI benadering, stellen we voor dat het DNA herstel plaats aan het oppervlak van de foci in plaats van in de inrichting kan nemen.
De onderste afbeelding in figuur 5 toont resultaten vergelijkbaar met figuur 3-III. De chromatine in het beschadigde gebied lijkt meer te decondensed vergeleken met de chromatine in de niet-bestraalde gebieden (zie gebied van rode streepjes aangegeven).
Gamma bestraalde cellen
Terwijl de laser micro-bestraling is een handig hulpmiddel om quickly-test eiwitten die een fluorescerend label bevat voor de aanwerving naar sites van DNA laesies, het creëert grote hoeveelheden complexe schade (dubbele breuken, enkele breuken, base schade, en cyclopyrimidine dimeren) 25. Om de compartimenten die directer zich rond dubbelstrengs DNA breuken te bestuderen, onderzochten we DRFs dat ongeveer afzonderlijke DSBs gevormd door blootstelling van cellen aan gammastraling.
U2OS cellen die stabiel tot expressie 53BP1-miniSOG-mCherry blootgesteld aan 2 Gy gammastraling en een half uur na de bestraling vastgesteld. Het karakteristieke patroon van grote foci verdeeld over het nucleoplasma kan worden waargenomen (figuur 6Ia). Na het foto-oxidatie van diaminobenzidine, kan donkere vlekken ontstaan op de plaatsen waar de fluorescerende mCherry signalen werden in fluorescentie microfoto zien in de electronenmicroscoop (figuur 6Ib en c). Deze vlekken kunnen worden gecorreleerd aan beelden TEMdie werden genomen bij een lage vergroting (figuur 6Id en e). De ESI beelden van deze brandpunten, die kennelijk ongeveer 1-1,5 urn in diameter, liet een interessante structuur. Dunne strengen van chromatine leek te worden tussen de 53BP1 eiwit van ongeveer tweemaal de dikte.
In andere experimenten werden de cellen blootgesteld aan een hogere hoeveelheid straling en op latere tijdstippen (na 3 uur en 6 uur, respectievelijk) om de grotere foci te genereren en lokaliseren van deze ultra-dunne secties (figuur 7) bevestigd. Omdat we kunnen afzonderlijk in kaart nucleoproteïne en eiwitten, ESI blijkt dat de structuur van de brandpunten lijken te reorganiseren tijd. De relatieve hoeveelheid 53BP1 eiwit in de focus blijkt toe te nemen terwijl de chromatine draait perifere positie.
Aangezien 53BP1 foci ook in niet-bestraalde cellen als "cryptische foci" in G1 cellen op plaatsen van onder replicerend DNA 26,27, die foci werden afgebeeld. Deze cryptische brandpunten lijken te hoge hoeveelheden eiwit ten opzichte van de straling geïnduceerde foci haven en tonen een interessante regelmatige structuur van chromatine.
Aldus visualiseren DNA repair foci bestanddelen met de miniSOG methode helpt om gebieden van DNA-schade te identificeren en de distributie van de gelabelde hersteleiwit opzichte van het chromatine in kaart.
Figuur 1. Overzicht van de structuren die kunnen worden waargenomen in een afbeelding ESI Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
(A) ESI beeld van een muis embryonale fibroblast. Chromatine ruggen (geel) zijn omgeven door nucleoplasma (cyaan) opvullen van de interchromatin space. De kern wordt omringd door perifere heterochromatine en chromocenters (linksonder) die worden onderbroken door porie complexen nucleaire (cyaan). De nucleoli kan duidelijk worden gescheiden door hun kleur. Dit komt door het feit dat de hoeveelheid proteïne ten opzichte van nucleïnezuur hoger in de nucleolair structuur dan in chromatine. Buiten de kern, mitochondria en kunnen ribosomen (rijk nucleïnezuur) gemakkelijk worden geïdentificeerd.
(B) Afbeelding van een kern en de centrosomes (zie pijlen), die kan worden gezien als een holle eiwitrijke deeltjes in de linkerbovenhoek van de afbeelding.
(C) Dwarsdoorsnede door een metafase plaat. De zeer gecondenseerde metafasechromosomen hebben afgestemd op een schijf die zich uitstrekt van de linker bovenhoek naar de linker benedenhoek. Hoge concentraties stikstof zichtbaar zijn op het oppervlak van bepaalde chromosomen. Deze gebieden zijn de kinetochoren (zie pijlen).
(Bovenste rij) De eerste twee foto's in de rij tonen de verhouding kaarten van fosfor en stikstof. De laatste foto in de bovenste rij toont deze elementaire kaarten gelegd in de RGB-kleurruimte. Gele structuren vertegenwoordigen nucleoproteïnen, als gevolg van de aanwezigheid van zowel fosfor en stikstof. (Onderste rij) De eerste foto toont de fosfor map die hoofdzakelijk onthult de verdeling van nucleïnezuur in het monster. De middelste foto toont de verdeling van nucleïnezuur uitgeputte / negatieve stru ctures. Het werd berekend door de fosfor kaart van de stikstof map. De rechter foto toont een fusie van de nucleïnezuur kaart en het eiwit kaart in de subtractieve kleurruimte. Deze kleurencomposiet worden gebruikt om te helpen bij de identificatie van afzonderlijke structuren en hen classificeren als nucleoproteïne of nucleoproteïne. De kwantitatieve informatie over de fosfor en stikstof overvloed moeten visueel worden afgeleid uit het net fosfor en nettostikstofmineralisatie grijstinten kaarten of uit composieten gegenereerd door additieve kleuren, zoals in de bovenste rij. 
Figuur 2. Oprichting van een multi-color ESI foto 
Figuur 3. Laser micro bestraling van U2OS cellen die stabiel tot expressie MDC1-miniSOG-mCherry. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
(II) Het gebied, gemarkeerd door een groen plein in Ic werd uitvergroot en weergegeven in de normale transmissiemodus (IIa) en de ESI (IIb). Lic toont een overlay van het beeld ESI het signaal van de schade spoor. De schade spoor signaal werd verkregen door drempelvorming de bovenste afbeelding.
(III) Voorbeelden van de structuur van laser micro-irradiated chromatine en chromatine buiten de laser beschadigd gebied.
Figuur 4. Laser micro bestraling van cellen die stabiel tot expressie 53BP1-miniSOG-mCherry. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Linker kolom: (A) Fluorescentie, (B) conventionele TEM en (C) ESI beeld van dezelfde laser micro bestraald kern.
Rechts column: (D) Conventionele TEM, (E) ESI en (F) Overlay van de ESI afbeelding met de miniSOG signaal dat werd gesegmenteerd door een drempel van (D) (zie stap 6.10)
Figuur 5. U2OS cellijn stabiel tot expressie Rad52-miniSOG-mCherry en beschadigd door laser-micro-bestraling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
(A) Overlay beeld fluorescentie van een laag-vergroting TEM met een laser microirradiated U2OS kern met een schade spoor linksonder met.
(B) Vertegenwoordiger confocale fluorescentiemicroscopie beeld van een laser micro bestraald Hoechst-gekleurde kern (blauw) uiten Rad52-miniSOG-mCherry die het karakteristieke patroon van kleine foci langs de schade spoor (rood signaal).
(C) conventionele TEM, (D) ESI,
(G) ESI beeld van een ander U2OS kern stabiel tot expressie Rad52-miniSOG-mCherry toont een laser-geïnduceerde schade track in de context van de gehele kern.
Figuur 6. U2OS cellen die stabiel tot expressie 53BP1-miniSOG-mCherry bestraald met 2 Gy en na 30 minuten vast. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
(I) a) het Fluorescence met de gammastraling-geïnduceerde 53BP1 brandpunten. b) Verzonden lichtbeeld na fotopolymerisatie. c) Overlay van de fluorescentie met het uitgezonden licht afbeelding. d) het Lage vergroting TEM (de zwarte streep is een TEM rooster bar). e) Overlay van de tl-afbeelding met afbeelding van de lage vergroting TEM.
(II) Schade aandacht gemerkt met een asterisk in het doorgelaten licht beeld opgenomen in de normale TEM en ESI-modus. a) Zero-verlies, b) ESI, c) Fosfor, d) Protein e) Overlay ESI en gesegmenteerde signaal van het nul-verlies.
(III) Schade aandacht gemerkt met een kruis in de fluorescentie beeld opgenomen in de normale TEM en ESI-modus. a) Zero-verlies, b) ESI, c) Fosfor, d) Protein e) Overlay ESI en gesegmenteerde signaal van het nul-verlies.
Figuur 7. Veranderingen in brandpunten structuur tussen foei na verschillende tijden van bestraling. < / strong> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
U2OS 53BP1 miniSOG mCherry cellen blootgesteld aan 6 Gy van gamma na 3u (1A-E, FJ) respectievelijk 6h (2A-E, FJ) vast bestraling. 3 toont een bestraald U2OS 53BP1 miniSOG mCherry kern met een cryptische scherpstelling (AE). ESI afbeeldingen worden weergegeven in de volgorde ESI (nucleïnezuur en eiwit), nucleïnezuur (alleen), eiwit (alleen), ESI (nucleïnezuur en eiwit) + gesegmenteerde miniSOG signaal.
Figuur 8. DNA-reparatie haarden zijn nog steeds zichtbaar in de conventionele transmissie modus wanneer na fixatie met osmiumtetroxide wordt weggelaten. arge.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Ultradunne sectie (50 nm) van een U2OS kern met twee 53BP1 foci van een monster dat niet is behandeld met osmiumtetroxide. (A) Bij conventionele TEM-modus, is het mogelijk verwijzingen gekleurd door de DAB polymeer zie ook zonder versterking contrast met de heavy metal vlek. (B) Het contrast van de brandpunten kan verder worden verbeterd door het nemen van zero-loss beelden (verfijning weg alle elektronen die oorsprong van meervoudige verstrooiing evenementen).
Figuur 9. Het bepalen van de optimale energie-venster instellingen voor mapping fosfor
(A) Elemental verhouding kaart opgenomen voor fosfor met post rand bij 155 eV en pre-edge op 120 eV.
content "> (B) Elemental verhouding kaart opgenomen voor fosfor met post rand bij 175 eV en pre-edge op 120 eV.(C) Berekening fosfor verhouding kaarten uit een constante vooraf edge venster bij 120 eV energieverlies en een variabel post-edge window variërend van 140-200eV energieverlies om de combinatie die het best in tegenstelling bepalen. De intensiteit verschil van de helderste en de dimmestpixel in een line-scan verspreid over dezelfde fosfor rijke en arme regio fosfor toont hoogste contrast waarden (dynamisch bereik) wanneer een post-edge beeld van 175 eV energieverlies werd gekozen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ESI kan dienen als een uitstekend hulpmiddel voor de behandeling van verschillende staten van chromatine en ribonucleoproteins in de kern, omdat het in staat is om specifiek in kaart gebieden die rijk zijn aan fosfor zijn. Het verhoogt diep de hoeveelheid detail die kan worden verkregen met een elektronenmicroscoop en is niet afhankelijk van aspecifieke zeer uiteenlopende methoden. Een nadeel van ESI is dat het vereist dunnere dan conventionele TEM tegelijk versnellingsspanning. Dit kan worden ondervangen door met seriecoupes of via tomografische methoden 28.
Hoewel veel informatie kan worden verkregen door te kijken naar de verdeling van fosfor en stikstof, is het van belang om te kunnen ook kaart de verdeling van bepaalde eiwitten. Met de werkwijze in dit document werd aangetoond dat ESI kan worden gecombineerd met werkwijzen die zijn gebaseerd op de plaatsspecifieke polymerisatie van diaminobenzidine. Hoewel deze methode geen fu toevoegenll nieuwe kleur ESI is duidelijk nuttig om de verdeling van een eiwit in kaart. Dit geldt met name voor eiwitten die interageren met de chromatine. Als een onderzoek moet meer dan één eiwitpopulatie visualiseren, kan de labeling methoden waarbij immunogold toch worden gebruikt wanneer toegepast als pre-inbedding kleuring voorafgaand aan foto-oxidatie 9. Vergeleken met stabiele cellijnen transiënte transfecties het nadeel dat expressieniveaus aanzienlijk kan variëren tussen cellen en aldus het moeilijk om meerdere cellen die vergelijkbare hoeveelheden van het gelabelde eiwit vinden. Daarom is het creëren van stabiele cellijnen aanbevolen. Het is echter mogelijk de relatieve hoeveelheid eiwitexpressie beoordelen via fluorescentie beeldvorming en selecteer cellen met tussenuitdrukking na transiënte transfectie.
Hoewel de miniSOG fusie tag zelf is fluorescerende, de quantum yield is aanzienlijk slechter dan GFP (0,37 versus 0,6) 10. Voor de purpOSE van correlatieve microscopie, het toevoegen van een extra fluorescent eiwit tag zoals mCherry laat beeldvorming in de levende cellen, zonder de productie van singlet zuurstof die optreedt met miniSOG excitatie. Het expressieniveau van de miniSOG-gemerkte eiwitten, kan de hoeveelheid zuurstof in de DAB-bevattende buffer en de pH van invloed op de snelheid van foto-oxidatie. Soms kan het heel problematisch homogene foto-oxidatie in het gebied van belang bereikt door het licht afhankelijkheid van de foto-oxidatiereactie. Langdurige foto-oxidatie kan leiden tot niet-specifieke kleuring en de afzetting van te veel zware metalen in de steekproef, die de detectie van element-specifieke signalen kunnen compliceren door ESI. De foto-oxidatie vrij veel tijd, zodat meestal slechts een klein gebied dat enkele cellen op het dekglaasje worden doorgaans gekleurd.
We hebben aangetoond dat de combinatie van miniSOG gemerkte eiwitten met behulp van ESI een monolaag van een aanhanger human kanker cellijn. In principe kan de werkwijze ook worden toegepast op elk ander monster (gist, bacteriën, weefsel, embryo) zolang het mogelijk is de miniSOG-gemerkt eiwit op een redelijk niveau en zolang translucentie en de diffusie van zuurstof uiten en DAB voldoende hoog om goede foto-oxidatie en derhalve homogene kleuring mogelijk maken. Verende cellen, zou het voordelig zijn om de locatie van cellen vast op een dekglaasje met behulp van een kleefmiddel zoals poly-L-lysine. Voor dikkere monsters, zullen doelstellingen met een lagere numerieke lensopening een meer homogene verlichting te bereiken, maar duurt het langer om foto-oxideren.
We hebben voorgesteld het gebruik van de miniSOG gemerkte fusieproteïnen zo dicht mogelijk bij het oorspronkelijke protocol door Shu et al 10 gepubliceerde mogelijk -. Inclusief het gebruik van osmiumtetroxide. Er kon worden vastgesteld dat, behalve voorkeur afzetten on DAB-polymeren en membranen, osmiumtetroxide toont enkele reactiviteit enafzetten op de meeste biologisch materiaal in het monster (10 Figuur 3). Osmiumtetroxide heeft een elementaire rand aan 45 eV. Dit signaal en de plasmonen kunnen worden bovenop de elektronen energieverlies spectrum als de dikte van het monster toe en enkele elektronen ondergaan meerdere energieverlies gebeurtenissen tijdens passage door het monster. Dit kan de kwaliteit van de fosfor elementaire kaarten te beperken als hoge OsO 4 concentraties worden gebruikt in de bereiding van de monsters. De concentraties die we hier hebben gebruikt, die aanzienlijk lager dan wat eerder is gebruikt 10 zijn, mogen de generatie van goede kwaliteit fosfor kaarten. In een experiment met gelabeld miniSOG eiwitten die hogere concentraties OsO 4 vraagt, de beste concentratie die toch toelaat goede fosfor kaartverwezenlijking moet empirisch worden bepaald.
We hebben gevonden dat de DAB polymeer die zich vormt op het DNA-herstel foei sufficiently dichte worden gezien in conventionele TEM-modus (of zero-loss mode nog beter contrast) ook bij post-fixatie met osmiumtetroxide weggelaten (zie figuur 8). De segmentatie van de signalen die zijn opgenomen op deze wijze was zo robuust als met de monsters die werden behandeld met osmium. Afhankelijk van het nucleair eiwit dat moet worden gevisualiseerd, de grootte van de structuur vormt en de noodzaak membraansystemen visualiseren, het gebruik van osmiumtetroxide wellicht niet nodig en het weglaten bij kunnen maskeren de elementaire ondertekening fosfor te verwijderen.
Vergeleken met andere publicaties via ESI 18,29,30 hebben wij verschillende instellingen voor de pre- en post-edge beelden gebruikt om elementaire verhouding kaarten met de minste hoeveelheid ruis. Wij hebben empirisch bepaald de instellingen die in het manuscript (zie figuur 9). De gekozen instellingen rond de randen moeten leiden tot ele corrigerenmentale kaarten tenzij de collectie vensters overlappen met andere elementen die aanwezig zijn in het monster. In ons geval, kan zwavel dergelijk element. Omdat de concentratie van zwavel (dat voorkomt in de aminozuren methionine en cysteine) is zeer laag en draagt bij tot de berekende kaart slechts een verwaarloosbare hoeveelheid, geloven wij betere S / N-verhouding dat we verkregen met de hier gebruikte opweegt tegen de nadelen die kunnen voortvloeien uit sporen van zwavel in het monster.
We bleek de ultrastructuur van DRFs op nanometer resoluties met behulp van de DNA-reparatie-eiwitten MDC1, 53BP1 en Rad52 in combinatie met ESI en TEM technieken. De organisatie van het chromatine en individuele DSB reparatie eiwit lokalisatie werd opgelost met behulp van deze aanpak. De lokalisatie op gebieden die rijk zijn aan DNA laesies na laser micro-bestraling DNA en de neiging van reparatie-eiwitten om de ruimte tussen de ribben chromatine vul werd getoond. Bij Rad52, waarvan plays een rol bij homologe recombinatie, de vorming van nucleaire body-achtige bolvormige structuren langs de laser beschadigde spoor waar te nemen en dit in tegenstelling tot de andere twee geteste eiwitten. Wanneer de schade met gammastraling wordt toegepast, 53BP1 foci gevormd rond de beschadigde chromatine. De relatieve samenstelling en de positie van chromatine en eiwit in de foci lijkt de tijd veranderen. De relatie tussen deze eiwitten en de beschadigde chromatine evenals veranderingen in de organisatie van chromatine en de samenstelling van de nucleaire lichamen kunnen allemaal gemakkelijk worden verkregen met behulp van de ESI-techniek, terwijl conventionele helderveld microscopie met behulp van uranium en lood contrasterende agenten kunnen niet deze eigenschappen rechtstreeks te beoordelen. Dus deze techniek toont hoog potentieel voor de studie van structuur-functie relaties, in het bijzonder voor werkwijzen die op DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Gridded 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-2-14-CGRD | not made for immersion objectives |
| LR White: acryl resin | emsdiasum | 14381 | |
| LR White accelerator | emsdiasum | 14385 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets | Sigma | D5905 | |
| Slim Bar Grids 300 Mesh | SPI | 1161123 | |
| Tungsten-Point Lab Pen | emsdiasum | 41148 | |
| Osmium Tetroxide | emsdiasum | 19100 | |
| Carbon Coater 208 carbon | Cressington | ||
| Ultra microtome Leica EM UC6 | Leica | ||
| Photoshop CS5 | Adobe | might even work with older versions | |
| Digital Micrograph V.2.30 | Gatan | might even work with older versions | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H-1399 | |
| Effectene | Quiagen | ||
| MiniSOG-Constructs | Tsien-Lab | tsienlab@yahoo.com | |
| MDC1 miniSOG mCherry | |||
| 53BP1 miniSOG mCherry | |||
| Rad52 miniSOG mCherry | |||
| cesium 137 radiation source "MARK 1" | (J.L. Shepherd & Associated) | ||
| ImageJ/FiJi | open source | http://fiji.sc/Fiji | |
| 2 ml Eppendorf tubes | Fisherbrand | 05-408-146 | |
| Diamond Knife ultra 35° | Diatome | ||
| Trimming Knife ultratrim | Diatome | ||
| Sodium cacodylate trihydrate | emsdiasum | 12300 | Caution Toxic! |
| Glutaraldehyde EM Grade 8% | emsdiasum | 16020 | Caution Toxic! |
| Sodium phosphate dibasic | emsdiasum | 21180 | |
| Sodium phosphate monobasic | emsdiasum | 21190 | |
| Paraformaldehyde | emsdiasum | 19202 | |
| Osmium tetroxide 4% solution | emsdiasum | 19150 | |
| Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Hydrochloric Acid | Fisherbrand | A142-212 | |
| Sodium Hydroxide Solution 10M | Fluka | 72068 | |
| Oxygen | Medigas | ||
| 3-Amino-1,2,4-triazole | Sigma | A8056 | |
| Potassium cyanide | Sigma | 207810 | Caution Toxic! |
| Ethanol | emsdiasum | 15058 | Caution Toxic! |
| Razor blade Single Edge Carbon Steel | emsdiasum | 71960 | Caution Sharp! |
| DMEM | Sigma | D 5546 | |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | |
| G418 | Life Technologies | 11811-023 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Transmission Electron Microscope 200 kV | JEOL | 2100 | |
| GIF Tridiem 863 Energy filter | Gatan |
References
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).
- Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. Stoichiometric analysis of protein- and nucleic acid-based structures in the cell nucleus. Micron (Oxford, England: 1993). 30, 151-157 (1999).
- Michael J Hendzel, F. M. B., Bazett-Jones, D. P. Direct Visualization of a Protein Nuclear Architecture. Molecular biology of the cell. 10, 2051 (1999).
- Ottensmeyer, F. P., Andrew, J. W. High-resolution microanalysis of biological specimens by electron energy loss spectroscopy and by electron spectroscopic imaging. Journal of ultrastructure research. 72, 336-348 (1980).
- Leapman, R. D., Ornberg, R. L. Quantitative electron energy loss spectroscopy in biology. Ultramicroscopy. 24, 251-268 (1988).
- Simon, G. T. Electron spectroscopic imaging. Ultrastructural pathology. 11, 705-710 (1987).
- Egerton, R. Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , Springer. (2011).
- Aronova, M. A., Kim, Y. C., Zhang, G., Leapman, R. D. Quantification and thickness correction of EFTEM phosphorus maps. Ultramicroscopy. 107, 232-244 (2007).
- Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. Chimeric molecules employing horseradish peroxidase as reporter enzyme for protein localization in the electron microscope. Methods in enzymology. 327, 35-45 (2000).
- Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS biology. 9, e1001041 (2011).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science (New York, NY). 296, 503-507 (2002).
- Fernandez-Capetillo, O., Celeste, A., Nussenzweig, A. Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors. Cell cycle (Georgetown, Tex). 2, 426-427 (2003).
- Haaf, T., Golub, E. I., Reddy, G., Radding, C. M., Ward, D. C. Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 2298-2302 (1995).
- Maser, R. S., Monsen, K. J., Nelms, B. E., Petrini, J. H. hMre11 and hRad50 nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 17, 6087-6096 (1997).
- Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA repair. 9, 1219-1228 (2010).
- Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. Journal of cell science. 125, 3529-3534 (2012).
- Dellaire, G., Kepkay, R., Bazett-Jones, D. P. High resolution imaging of changes in the structure and spatial organization of chromatin, gamma-H2A.X and the MRN complex within etoposide-induced DNA repair foci. Cell cycle (Georgetown, Tex). 8, 3750-3769 (2009).
- Kruhlak, M. J., et al. Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks. The Journal of Cell Biology. 172, 823-834 (2006).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor protocols. 2010, (2010).
- Zeyda, M., Borth, N., Kunert, R., Katinger, H. Optimization of sorting conditions for the selection of stable, high-producing mammalian cell lines. Biotechnology progress. 15, 953-957 (1999).
- Dellaire, G., Nisman, R., Bazett-Jones, D. P. Correlative light and electron spectroscopic imaging of chromatin in situ. Methods in enzymology. , 375-456 (2004).
- Campbell, S., Ismail, I. H., Young, L. C., Poirier, G. G., Hendzel, M. J. Polycomb repressive complex 2 contributes to DNA double-strand break repair. Cell cycle. 12, 2675-2683 (2013).
- Mortusewicz, O., et al. Recruitment of RNA polymerase II cofactor PC4 to DNA damage sites. J Cell Biol. 183, 769-776 (2008).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173, 195-206 (2006).
- Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Frontiers in genetics. 4, 135 (2013).
- Lukas, C., et al. 53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress. Nature. 13, 243-253 (2011).
- Harrigan, J. A., et al. Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells. The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).
- Aronova, M. A., et al. Reprint of 'Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST). J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).
- Fussner, E., et al. Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming. The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).
- Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin. Cell cycle. 10, Georgetown, Tex. 308-322 (2011).
