Abstract
وكانت حدود لقرار بصري وتحدي تحديد السكان بروتين معين في المجهر الإلكتروني انتقال العقبات في علم الأحياء الخلوي. العديد من الظواهر لا يمكن تفسيره في المختبر تحليل نظم مبسطة وتحتاج المعلومات الهيكلية إضافية في الموقع، وخاصة في نطاق بين 1 نانومتر و 0.1 ميكرون، من أجل أن تكون مفهومة تماما. هنا، والتصوير الطيفي الإلكترون، وهي تقنية المجهر الإلكتروني النافذ الذي يسمح رسم الخرائط في وقت واحد لتوزيع البروتينات والأحماض النووية، وعلامة التعبير، miniSOG، يتم الجمع بين لدراسة بنية وتنظيم DNA مزدوج الجديلة إصلاح كسر البؤر.
Introduction
وعلى الرغم من التقدم الكبير في المجهر الضوئي خلال السنوات الأخيرة 1، خلية علماء الأحياء لا تزال تعاني من فجوة في القرار. هذا يحد من فهم العلاقات هيكل الوظائف في العمليات الخلوية الأساسية التي تنطوي على تفاعل منسق بين المجمعات الجزيئات (على سبيل المثال، في إعادة لونين، وإصلاح DNA، RNA النسخ والتكرار DNA). على الرغم من المجاهر الإلكترونية الإرسال (TEM) ق تقديم القرار المطلوب، فقد كان تحديا لتعريف هذه العمليات من الناحية الهيكلية بسبب عدم القدرة على تسمية بروتينات معينة في حين يجري أيضا قادرة على تحديد التركيب الكيميائي الحيوي للهياكل تصور. في غياب الأغشية الداخلية للمساعدة في التفريق الهياكل النووية، كانت نواة تحديا من نوع خاص. الإلكترون الطيفية التصوير (ESI) يحل بعض هذه القيود من خلال السماح للكشف في وقت واحد والتفريق بين DNA، RNA، والبروتوكول الاضافيهياكل النووية 2-5 عين المستندة إلى
الإلكترون التصوير الطيفي:
من أجل خريطة توزيعات عنصري في حساسية عالية ودقة في المجهر الإلكتروني، يمكن للمرء استخدام مطياف التصوير التي يختار الإلكترونات التي تشتتت inelastically من خلال التفاعل مع الإلكترونات قذيفة الداخلية عنصر في العينة 6. بسبب فقدان كميات عنصر معين من الطاقة نتيجة للتأين الذرات في العينة، وهذه الإلكترونات يمكن فصلها وتصور باستخدام مطياف التي يتم تركيبها على المجهر الالكتروني. وهكذا، تحليل الطيف من الإلكترونات التي تفاعلت مع العينة يكشف عن معلومات نوعية وكمية عن التركيب العنصري للعينة 7. تم العثور على الإلكترونات التي لا تفقد الطاقة عندما تمر العينة في "عدم الخسارة الذروة" من فقدان الطاقة الإلكترونالطيف. يرتبط وفرة من هذه الإلكترونات إلى الكتلة والكثافة وسمك العينة، وتتألف من الإلكترونات التي تمر من خلال عينة من دون الاصطدام مع العينة أو فقدان الطاقة أثناء مرورها من خلال العينة. يمكن أن تكون هذه المعلومات مفيدة لتقدير المطلق للأعداد ذرات عنصر معين موجود في العينة 8.
منذ العينات البيولوجية تتكون في معظمها من العناصر الخفيفة التي تحرف سيئة الإلكترونات في شعاع حادثة TEM، وأساليب تلطيخ باستخدام أملاح المعادن الثقيلة يجب أن تطبق من أجل توليد التباين في العينة. عدم وجود خصوصية لمعظم هذه العوامل المتناقضة وعدم القدرة على تصور وصمة عار أكثر من حيث خصوصية ممكنة قد حد من قيمة المجهر الإلكتروني التقليدية في دراسة النواة. ESI له مزايا هامة على TEM التقليدية، وخاصة لدراسة هياكل نواة الخلية.فمن الممكن لاستغلال الطبيعة الفسفور الغني DNA- والمجمعات الجزيئات التي تحتوي على الحمض النووي الريبي للتمييز مجمعات البروتين النووي من المجمعات البروتين ولحل مجمعات البروتين النووي مختلفة على أساس كثافتها من الأحماض النووية. ولا يمكن تصوير المواد البيولوجية المتبقية على أساس وفرة من النيتروجين. رسم الخرائط فقط هذين العنصرين وتحليل توزيعها والوفرة النسبية داخل هياكل تشريحية مختلفة توفر لنا الكثير من المعلومات حول النواة. على سبيل المثال، فإنه من السهل تحديد لونين وريبوسوم في الخريطة تمثل وفرة الفوسفور. مساحة interchromatin والمجمعات المسام النووية، والهيئات النووية، من ناحية أخرى، يمكن أن يتم الكشف بسهولة في الخريطة النيتروجين الصورة.
مصغرة النظام مولد الاوكسجين القميص (miniSOG)
في حين ESI يمثل تقنية قوية لدراسة الموقع هيكل لونين في ليستغرقالصورة الاستفادة من نسب مميزة في التركيب العنصري بين الفوسفور والنيتروجين وتكوين عنصر لا يمكن في العادة يستخدم للتمييز بين مجموعات مختلفة من المجمعات البروتين. الأجسام المضادة المسمى مع جزيئات الذهب الصغيرة في نطاق نانومتر وقد استخدمت على نطاق واسع لرسم خريطة للموقع الجزيئات الفردية. منذ عادة يتم إرفاق الجسيمات الذهب إلى الضد الثانوية، وسوف تظهر ضمن محيط من حوالي 20 نانومتر حول حاتمة الكشف عنها بواسطة الأجسام المضادة الأولية. في عينات بعد التضمين، يمكن أن الأجسام المضادة كشف فقط الحواتم التي يتم كشفها على سطح الأجزاء. في حين أنه من الممكن أن يثبت وجود مستضد وربطها بنية تشريحية معينة من الخلايا، فإن المعلومات التي يتم الحصول عليها غير كاملة، حيث يتم حجب معظم الحواتم التي كتبها الراتنج. التقنيات التي تستخدم بروتوكولات مماثلة لتلك المستخدمة في مضان المجهري قبل التضمين، تسمح بالوصول إلى المستضدات في جميع أنحاءعمق الكامل للعينة لكن الخطوات permeabilization المطلوبة للسماح للأجسام المضادة لاختراق الخلية عادة ما تتطلب إزالة الأغشية الدهنية وإزالة المكونات التي لا يمكن إصلاحها من خلال الألدهيدات. وعلاوة على ذلك، تثبيتي ألدهيد المفضل للحفاظ التركيب الدقيق، غلوتارالدهيد، ويدمر عادة الحواتم، وبالتالي مطلوب امتصاص العرق عادة. هذا هو أقل فعالية في البروتين البروتين يشابك. عيب آخر من الأجسام المضادة التي وصفت مع جسيمات متناهية الصغر الذهب أن الذهب هو مادة الإلكترون كثيفة جدا أن يخلق تناقضا واضحا أن يمكن أن يحجب تفاصيل الهيكلية مثيرة للاهتمام من العينة، والتي على النقيض أضعف.
ظهور البروتين الفلوري الأخضر (GFP) كما علامة البروتين أعرب حولت استخدام المجهر مضان الإجابة على الأسئلة في علم الأحياء الخلوي. علامات بروتين مع مجال الفلورسنت صغير يسمح رسم خرائط لتوزيعه في الجسم الحي 9. هذه المنتجات يمكن أن رد فعل HRP أيضا منتشر بعيدا من موقع جيل بحيث حلها هو أسوأ من طريقة nanogold 10. من أجل تجاوز هذه المشاكل، تم تطوير نظام فلاش / ReAsH 11. وهو يتألف من البروتينات الانصهار المؤتلف التي تمتلك عزر tetracysteine. هذا عزر يسمح ملزمة للوfluorophore biarsenic. عندما متحمس، ومضة المربوطة أو ReAsH قادر على توليد الأكسجين القميص شديدة التفاعل وdiaminobenzidine بالتالي photoconvert (DAB) إلى البوليمر الذي يترسب على الفور في موقع البروتينات الموسومة. يمكن أن تكون ملطخة البوليمر DAB مع رباعي أكسيد الأوزميوم، وهي كثيفة الإلكترون وبالتالي يمكن استخدامها لخريطة توزيع انصهار بروتين المؤتلف في TEM.
في عام 2011، شو وآخرون 10 قدم نظام miniSOG، والذي يتألف من 106 الأمينية الصغيرة علامة الأحماض الانصهار مشتقة من بروتين فلافيني من نبات الأرابيدوبسيس هذا هو فلوري وقادرة على خلق العديد من المتطرفين الأكسجين القميص عندما متحمس مع 448 الضوء الأزرق نانومتر. تلك الجذور الأكسجين القميص يمكن أن تستخدم لالصور أكسدة diaminobenzidine لتشكيل البوليمرات في وبالقرب من سطح البروتين الموسومة، والتي هي أقرب بكثير من الأجسام المضادة المسمى immunogold 11. في حين أن نظام فلاش / ReAsH يتطلب يصل الفلوريةالكروم وdiaminobenzidine إلى خلايا قبل القيام photoconversion، ونظام miniSOG يتطلب سوى diaminobenzidine والضوء وبالإضافة إلى ذلك حوالي الفعال مرتين كما في البلمرة diaminobenzidine. هنا، يعمل miniSOG في تركيبة مع ESI من أجل رسم خريطة التركيب الدقيق للإصلاح الحمض النووي البؤر.
إصلاح الحمض النووي بؤر (DRF)
DNA دون اصلاح فواصل حبلا مزدوجة تشكل تهديدا خطيرا للخلية لأنها يمكن أن تؤدي إلى نقل المواقع وفقدان المعلومات الوراثية. وهذا بدوره يمكن أن يؤدي إلى الشيخوخة، والسرطان، وموت الخلايا. العديد من البروتينات التي تشارك في الحمض النووي المزدوج إصلاح كسر حبلا تتراكم في البؤر التي تجمع حول حبلا مزدوج DNA كسر 12-14. على الرغم من وظيفتها غير معروف، إلا أنها تمثل الموقع في النواة التي تحتوي على الحمض النووي المزدوج كسر حبلا وغير موقع من الحمض النووي حبلا مزدوجة إصلاح كسر.
إصلاح الحمض النووي لجنة مسؤولي المنتدىوقد اتسمت ط (DRF) بواسطة المجهر مضان وأنها بمثابة المؤشرات الحيوية للتلف الحمض النووي 12،15. فهي نسبية كبيرة لحجم كسر مزدوج الجديلة واعتبرت متجانسة نسبيا حتى كشفت الدراسات الحديثة المجهر فائقة الدقة بعض الأدلة على التقسيم الفرعي للجزيئات في كل تركيز 16. من أجل فهم كيفية تنظيم هذه المواقع، لا بد من تصور كل من الهياكل البيولوجية الأساسية بالنسبة لبعضها البعض. لا يمكن أن يتحقق ذلك عن طريق الفحص المجهري مضان ولكن من الممكن من خلال المجهر الإلكتروني 17،18. هنا، يتم وصف أسلوب يجمع بين الإلكترون التصوير الطيفي مع أسلوب miniSOG لتوضيح إمكانات هذا النهج جنبا إلى جنب لاستكشاف التركيب الدقيق للDNA مزدوج الجديلة إصلاح كسر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. جيل من miniSOG الخلوي خطوط
- تنمو U2OS (عظمية البشري) خلايا في طبق 35 ملم يحتوي على 2 مل من انخفاض مستوى السكر في Dulbecco لتعديل المتوسطة النسر (DMEM) التي تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2 الغلاف الجوي.
- Transfect الخلايا عندما تكون 80٪ متموجة قبل lipofection مع نوعية ترنسفكأيشن النقاء (A269 / 280 نسبة 1،8-2،0) يبني البلازميد التي تحتوي على تسلسل لminiSOG وmCherry الموسومة البروتينات إصلاحها وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة للكاشف ترنسفكأيشن 19. ويمكن طلب البلازميدات التعبير miniSOG من تسين مختبر: http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
- نوع الخلايا التعبير عن بروتين المؤتلف مع العلامة miniSOG وmCherry مضان خلية تنشيط فرز يومين آخر ترنسفكأيشن. جمع الخلايامع كثافة مضان المتوسطة من أجل تجنب الخلايا التي يتم overexpressing 20.
- ثقافة الخلايا إيجابية على طبق 10 سم في 10 مل من DMEM المتوسطة التي تستكمل مع 10٪ FBS و 0.6 ميكروغرام / مل من وكيل اختيار G418 (Geneticin).
- بعد أن ظهرت مستعمرات واضحة على لوحات، وشاشة لمستعمرات إيجابية mCherry باستخدام المجهر مضان مقلوب ورسم الدوائر حولهم (على الجزء السفلي من لوحة) مع علامة دائمة. استخدام المنخفض الجوي التكبير عدسة الهدف (على سبيل المثال، 10X) واختيار الحيوانات المستنسخة باستخدام تقنية معقمة بواسطة الخدش بعناية المستعمرات وإيقاف ببطء مص لهم في العقيمة 1000 ميكرولتر ماصة.
- توسيع المستعمرات المختارة وتجميد أجزاء منها لأسفل باستخدام متوسط النمو هو موضح في الخطوة 1.1 تستكمل مع 10٪ ثنائي ميثيل sulphoxide. اختبار الخلايا لتشكيل DRF التي تنمو بها على معقمة 18 × 18 مم 2 زلات غطاء وتعريضهم ل2 غراي من الإشعاع. الخلايا المشع التعبير عن ثابت وminiSOG mCherry الموسومة البروتين إصلاح يجب أن تظهر نموذجية التنسيق سمة نمط DSBs عندما تصور مع المجهر مضان باستخدام مجموعة مرشح للتصوير mCherry.
2. خلية ثقافة
- ثقافة الخلايا U2OS يعبرون عن مستقر للminiSOG وmCherry الموسومة البروتينات إصلاح في ظل الظروف المذكورة في الخطوة 1.1. زراعة خلايا إلى 80٪ confluency في 35 ملم الزجاج صحن قطره السفلي يحتوي على 2 مل من DMEM. تأكد من أن الصمغ الذي تولى تغطية زلة لالبلاستيك والبلاستيكية المستخدمة مقاومة للالمحاليل المائية والكحولية ومقاومة للالراتنج المستخدم!
- قبل إجراء التجربة، الخطوط العريضة لمنطقة صغيرة من حوالي 1 ملم 2 يحتوي على الخلايا معربا عن البروتينات خارج الرحم بواسطة الخدش بالقلم الماس عقيمة باستخدام المجهر مضان لتحديد المنطقة ذات الاهتمام. وبدلا من استخدام ر الطبق أسفل الزجاجيحتوي على قبعة ساترة مع نظام الشبكة قبل محفورا في صلب ساترة.
ملاحظة: في حالة استخدام عالية الجودة المجهر مترابط يجمع بين ESI ومضان الصور المجهرية 21، تأكد من أن سمك ساترة متوافق مع أهداف الغمر النفط. يجب أن يكون سمك رقم 1.5 (0،16-0،18 مم). اختيار منطقة قريبة من وسط الطبق في المنطقة لفحصها في TEM من أجل تجنب المشاكل مع البلمرة من الراتنج التي قد تحدث بالقرب من حواف (انظر النقطة 4،10-4،13).
3. DNA الأضرار التعريفي
- أشرق الخلايا مع أشعة غاما، واستخدام المخدرات محاك للإشعاع، أو حث الأضرار التي أشعة الليزر الجزئي على المجهر متحد البؤر (على سبيل المثال، كما هو موضح في 18،22 أو 23).
- في هذا المثال، أشرق الخلايا مع 2 و 6 جراى من أشعة جاما في microirradiate 137 السيزيوم مصدر الإشعاع أو ليزر باستخدام سول 405 نانومترليزر الحالة معرف المجهر متحد البؤر بعد توعية الخلايا لمدة 20 دقيقة مع 0.5 ميكروغرام / مل هويشت.
4. إعداد نموذج
- إصلاح الخلايا مع 1 مل من 4٪ لامتصاص العرق تنبيه في 0.1 M الصوديوم العازلة كاكوديلات أو 0.1 M الفوسفات العازلة درجة الحموضة 7.4 لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام.
تنبيه: لامتصاص العرق وكاكوديلات الصوديوم سامة! ارتداء القفازات والتخلص من المواد السامة بشكل كاف. - غسل الخلايا مرتين مع 4 مل من 0.1 M الصوديوم العازلة كاكوديلات 7.4 درجة الحموضة أو العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 7.4.
- علاج الخلايا الثابتة مع 2 مل 50 ملي الجلايسين، 5 ملي aminotriazole و 10 ملي سيانيد البوتاسيوم تنبيه في 0.1 M الصوديوم العازلة كاكوديلات أو 0.1 M العازلة الفوسفات (7.4 درجة الحموضة) (فحص درجة الحموضة!) لمدة 30 دقيقة من أجل منع المتفاعل مجموعة ألدهيد وقمع أنواع الأكسجين التفاعلية الناتجة عن مجموعة الهيم، والتي يمكن أن تزيد من الخلفية.
تنبيه: سيانيد البوتاسيوم السامة للغاية! Wقفازات الأذن، تعمل تحت غطاء والتخلص من المواد السامة بشكل كاف. رد فعل حساس جدا لدرجة الحموضة لذلك من المهم أن الرقم الهيدروجيني التحقق منها ودقيقة. - تسجيل المنطقة التي تم تحديدها في الخطوة 2.2 في 2D أو 3D على مجهر مضان مقلوب، إذا كان المطلوب المجهري مترابط.
- إعداد 1 ملغ / مل diaminobenzidine حل هيدروكلوريد تنبيه عن طريق وضع 10 ملغ قرص diaminobenzidine هيدروكلوريد في أنبوب microcentrifuge 2 مل. إضافة 980 ميكرولتر من H 2 O المقطر و 20 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك المركز (11.65 م) وتخلط حتى الحل هو البني الفاتح وشفافة. تمييع هذا الحل في 0.1 M الفوسفات أو 0.1 M الصوديوم العازلة كاكوديلات إلى تركيز النهائي من 1 ملغ / مل في حين ضبط درجة الحموضة وهيدروكسيد الصوديوم لدرجة الحموضة بين 7.0 و 7.6 (يوصى 7.4 درجة الحموضة).
تنبيه: Diaminobenzidine سامة! ارتداء القفازات والتخلص من المواد السامة بشكل كاف. - لphotooxidation، صeplace العازلة مع 2 مل من 1 ملغ / مل حل هيدروكلوريد diaminobenzidine في 0.1 M الصوديوم العازلة كاكوديلات أو العازلة الفوسفات. حماية هذا الحل بعيدا عن الضوء وتبريده على الجليد إلى 4 درجة مئوية وذلك لزيادة قابلية ذوبان الأوكسجين. تشبع حل مع الأوكسجين من قبل محتدما الأكسجين من خلال حل (استخدام خرطوم التي يتم إدراجها في الحل ومتصلة زجاجة الأكسجين). تحقق من درجة الحموضة مرة أخرى وضبط إذا لزم الأمر.
ملاحظة: من المهم جدا للتفاعل photooxidation أن الرقم الهيدروجيني ما بين 7.0 درجة الحموضة ودرجة الحموضة 7.6. - تركيب الطبق مع الخلايا الثابتة بعناية على مجهر مضان مقلوب مجهزة 40X الغمر النفط عدسة موضوعية ونقلها إلى مجال الاهتمام. تثير علامة miniSOG مع الضوء الأزرق باستخدام مكعبات تصفية GFP أو الحراجية. MiniSOG لديه الحد الأقصى الإثارة في 448 نانومتر مع الكتف في 473 نانومتر 10.
- تواصل مع الإضاءة حتى بعد الأخضر miniSOG مضان هكتارق اختفى تماما وحتى البني المنتج التأكسد الضوئي للdiaminobenzidine بلمرة يظهر في القناة الخفيفة المرسلة. عندما يكون المنتج أكسدة مرئيا في معظم الخلايا، وإيقاف الإضاءة مضان لوقف التأكسد الضوئي.
ملاحظة: صور للأكسدة يمكن أن تصل إلى عدة دقائق اعتمادا على العدسة الشيئية، موجات الإرسال مرشح والكفاءة، ومصدر الإضاءة. - بوستفيكس الخلايا مع 1 مل من 2٪ غلوتارالدهيد في 0.1 M الصوديوم كاكوديلات 7.4 درجة الحموضة عازلة أو الفوسفات عازلة درجة الحموضة 7.4 لمدة 30 دقيقة.
- إصلاح أغشية الخلايا مع 0.1٪ -0.5٪ رباعي أكسيد الأوزميوم لمدة 20 دقيقة في 0،1 M الصوديوم العازلة كاكوديلات درجة الحموضة 7.4 أو 0.1 M الفوسفات العازلة درجة الحموضة 7.4.
ملاحظة: من المستحسن استخدام أقل تركيز ممكن من رباعي أكسيد الأوزميوم اللازمة لتحقيق الاستقرار في الأغشية. منذ رواسب DAB بلمرة لديها كثافة عالية من النيتروجين، والتي يمكن الكشف عنها مباشرة من قبل ESI، قويةالأوسيميوم تلطيخ ليس من الضروري التعرف على البروتين miniSOG الموسومة، وربما تكون ضارة للESI. رباعي أكسيد الأوزميوم هي سامة جدا! العمل في غطاء الدخان والتخلص من النفايات السامة بشكل كاف. - يذوى، الخلايا من خلال سلسلة الإيثانول باستخدام 30٪، 50٪، 70٪، 90٪، 98٪ 100٪ خطوات الإيثانول (كل 5 دقائق). وفي وقت لاحق، واحتضان الخلايا في 1: مزيج 1 من الإيثانول بنسبة 100٪ وراتنج الأكريليك (LR الأبيض) ووضع طبق على شاكر لمدة 4 ساعات لتسهيل تسلل إلى الخلايا قبل احتضان الخلايا على الأقل ساعة 4 أخرى في 100 راتنج الأكريليك٪ (LR الأبيض).
- من أجل بلمرة الراتنج، وقطع غطاء من المسمى 2 مل أنبوب microcentrifuge بشفرة حلاقة ومعطف حافة مع الاكريليك الراتنج دواسة البنزين. تأكد من أن مسرع لا يغطي سوى حافة ولا تتدفق في أنبوب. وفي وقت لاحق، وملء بعناية أنبوب حوالي ثلثي مع الراتنج LR الأبيض باستخدام ماصة باستور. الحرص على أن الراتنج لا تحصل على اتصال خفة دمح المسرع على حافة!
- إزالة الراتنج التي تسلل الخلايا في الطبق ووضع الطبق رأسا على عقب على تستقيم أنبوب microcentrifuge دائمة بحيث عرض أنبوب يملأ تماما تقريبا حتى الزجاج مغطى نافذة مراقبة الطبق.
- الانتظار 1-2 دقائق للمعجل لختم الأنبوب وساترة، ثم عكس الأنبوب بحيث الراتنج في أنبوب يغطي الآن الخلايا.
- وضع الطبق مع الأنبوب في فرن عند 60 ° C وعلاجه لمدة 12 ساعة.
- عندما يتم الشفاء كتلة، وإزالة الطبق مع المرفقة مليئة الراتنج أنبوب microcentrifuge من الفرن وفصل أنبوب microcentrifuge من الطبق. تسهيل الفاصل تجميد أذاب دورات في النيتروجين السائل والماء الساخن.
- تجاهل الطبق أسفل الزجاج وقطع بعناية فتح أنبوب microcentrifuge بشفرة حلاقة لإزالة كتلة.
- تسمية كتلة مع علامة دائمة.
- استخدام شفرة حلاقة لتريم كتلة بحيث لا شيء ولكن المنطقة 1 مم 2 الذي يحتوي على منطقة تميزت سابقا مع الماس أو التنغستن القلم (أو يحتوي على منطقة مع خلايا الفائدة) لا يزال قائما.
- جبل كتلة في مشراح مستدق، وتقليم كتلة بسكين وتقليم وقطع الأجزاء رقيقة جدا من حوالي 50 نانومتر باستخدام سكين الماس.
- التقاط المقاطع على عالية لنقل 300 شبكات سلكية. هذه الشبكات لها الحانات شبكة صغيرة جدا، وبالتالي تغطي أقل من الخلايا في مجال الاهتمام.
- معطف المقاطع على شبكات مع حوالي 0،2-0،4 نانومتر من الكربون يستخدم المغطي الكربون للمساعدة في استقرار منهم تحت شعاع الالكترون من TEM.
5. المجهر الإلكتروني
- تحميل الشبكات إلى TEM التي تم تجهيز مع مرشح الطاقة. بعد ضبط المجهر ومرشح الطاقة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، وفحص الخلايا على المقاطع في وضع التكبير المنخفض (انتقال طبيعي) وقارنلهم مضان البيانات عند الاقتضاء (حصلت عليه في الخطوة 4.4).
- مرة واحدة في النواة مع ميزات مثيرة للاهتمام (DNA الضرر المسار أو إصلاح الحمض النووي البؤر) وجدت، والتحول إلى وضع الترشيح الطاقة وتسجيل خريطة سمك.
ملاحظة: يتضمن هذا الإجراء تسجيل صفر الخسارة وصورة غير المرشحة. سمك يصل إلى 0.3 تعني المسار الحر (30٪ من الإلكترونات من شعاع حادث يحصل متفرقة عن طريق العينة) هي رقيقة بما يكفي لتوليد خرائط عنصري جيدة. - نسبة قياسية خرائط الفوسفور والنيتروجين العناصر باستخدام البرمجيات التي تسيطر على مرشح الطاقة من الاداة المستخدمة. تسجيل الخريطة الفوسفور الصور آخر الحافة على 175 فولت فقدان الطاقة مع عرض الشق من 20 فولت وقبل حافة الصور عند 120 فولت فقدان الطاقة، وأيضا مع عرض الشق من 20 فولت. لخرائط النيتروجين، وسجل آخر حافة الصور في 447 فولت مع عرض الشق من 35 فولت وقبل حافة الصور في 358 فولت، وأيضا مع عرض الشق من 35 فولت.
ملاحظة: بما أن محتوى العناصر المصورة (phosphorus والنيتروجين) منخفضة نسبيا (حوالي 1٪)، اختر "صورة نسبة" (خريطة عنصري النوعية) على "طريقة 3 النافذة" (quantitate خريطة عنصري) من أجل توليد الصور مع إشارة أفضل إلى نسبة الضوضاء.
تجهيز 6. صورة
- فتح الخرائط نسبة عنصري في برامج معالجة الصور التي يمكن التعامل مع تنسيق ملف الصور المنقولة (على سبيل المثال، صورة مجهرية رقمية). نسخ خريطة النيتروجين في القناة الحمراء وخريطة الفوسفور في القناة الخضراء صورة RGB، ثم ركب ومحاذاة الخرائط.
- تصدير صورة مركبة باعتباره الموسومة شكل ملف صورة (TIFF) ملف. فتح الصورة في صورة برامج معالجة التي يمكن استخدام طبقات (على سبيل المثال، فوتوشوب).
- ضبط مجموعة ديناميكية من كل قناة من خلال إعادة قياس الحد الأدنى والحد الأقصى للقيم في الصورة إلى مجموعة البيانات 8 بت (0-255).
- طرح محتوى الفوسفور من الخريطة النيتروجين (باستخدام"الطبقات" نافذة) من أجل توليد خريطة النوعية التي تبين توزيع البروتين.
- تحويل الخرائط من الحمض النووي (الفوسفور) والبروتين (النتروجين) التي تم إنشاؤها في الخطوة السابقة إلى "اللون المفهرس" وإنشاء جدول بحث الأصفر في الفضاء لون CMYK لخريطة تبين توزيع الحمض النووي وطاولة السماوي بحث لعرض خريطة غير البروتين النووي. ويتم اختيار الألوان لتوليد أقصى قدر من التناقض بين اثنين من خرائط عنصري.
- خلق صورة جديدة واستيراد الخرائط التي تبين توزيع الفوسفور وبروتين كما طبقات مختلفة. استخدام "شاشة" وضع الشفافية من أجل أن نرى كل من طبقات متراكبة على بعضها البعض.
- فتح الصورة صفر فقدان المكتسبة في الخطوة 5.2. هذه الصورة تمثل صورة من المنطقة المسجلة والتي تبدو وكأنها صورة TEM التقليدية ولكن يحتوي فقط على الإلكترونات التي مرت من خلال عينة من دون الاصطدام مع العينة. تصديرهذه الصورة كصورة TIFF.
- فتح تصدير صورة الخسارة صفر في محرر الصور ونسخها في الطبقة العليا من الصورة التي تظهر الخريطة عنصري. محاذاة الصورة باستخدام "الشاشة" واسطة الشفافية.
- العتبة اختياريا صفر الخسارة الصورة لشريحة إشارة إلى أن تنبع من miniSOG. إضافة الصورة الناتجة كطبقة منفصلة كما هو موضح أعلاه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ESI
وبمقارنة الصور ESI للنواة (الشكل 1) مع الصور TEM التقليدية (على سبيل المثال، الشكل 7-1) يكشف عن زيادة كبيرة في البنى التشريحية التي يمكن تمييزها بسهولة. تظهر التلال لونين الأصفر وأنه من السهل جدا لتحديد chromocenters في خلايا فأر. الأنوية يمكن بسهولة التمييز بين لونين من قبل بنيتها مستديرة ولون مختلف، منذ ريبوسوم تجميعها مسبقا يحتوي بالفعل على كميات عالية من البروتين، وهي غنية بالنيتروجين، بالإضافة إلى RNA، وهي غنية في الفوسفور. لونين الطرفية يقيم كطبقة رقيقة على الحدود بين النواة والمسام النووية يمكن أن ينظر إليها باعتبارها هياكل النيتروجين الغنية التي تقطع لونين الطرفية. في كثير من الأحيان الصفيحة يمكن اعتبار طبقة زرقاء رقيقة جدا خارج لونين الطرفية. في السيتوبلازم، والعديد من الجسيمات الصغيرة الغنية في الفوسفور يمكنمنظور. ويمكن تحديد هذه كما ريبوسوم على أساس حجمها وفرة والمكان خارج النواة. يمكن أن ينظر إلى الفضاء interchromatin على أنها منطقة غنية بالبروتين الموجود بين لونين. هذا يحتوي على الهيئات النووية والمناطق الغنية في إشارات صفراء صغيرة، مثل جزيئات بروتين نووي ريبوزي ومجموعات من حبيبات بروتين نووي ريبوزي (الشكل 2). وتسمى هذه الأخيرة interchromatin مجموعات الحبيبية ويتم إثراء مميز في البروتينات اللازمة لمرحلة ما قبل مرنا الربط. الشكل 1B، C و D توضيح ظهور هياكل أخرى معروفة مثل الكروموسومات الإنقسامية، centrosomes، الميتوكوندريا والقسيم. في الشكل 2، وتتلخص الخطوات المستخدمة لتوليد الصور المركبة الملونة من الخام الخرائط نسبة عنصري. دمج خريطة الفوسفور (الأخضر) وخريطة النيتروجين (الأحمر) في مساحة اللون RGB (الصف العلوي) يسمح لتقييم أفضل للكميات من تلك العناصر في العينة. Howeveص، طرح إشارة الفوسفور في استنزاف مساهمة الهياكل التي تحتوي على الحمض النووي من على الخريطة النيتروجين لانتاج خريطة بروتين (السماوي) ودمجه مع خريطة الفوسفور (الصفراء) في فضاء اللون CYMK يوفر تمثيل مرئي أكثر وضوحا من البروتين النووي وعدم البروتين النووي (الصف السفلي). وهذا يسمح البيانات المراد تفسيرها بسهولة من قبل أفراد غير مألوف مع التكنولوجيا.
الليزر خلايا microirradiated معربا عن MDC1، 53BP1 وRad52
نظرا لحجم وشكل المعرفة، والمكان من المسارات الضرر الليزر، ومنطقة DAB ترسب في الخلايا الليزر microirradiated من السهل جدا أن تجد في TEM عند استخدام نظام miniSOG. الصور التي التقطت في البلدان المنخفضة واسطة نقل التكبير (أي التقليدي brightfield TEM) تكشف عن مسارات الضرر مميزة ويمكن مقارنتها مع البيانات التي تم تسجيلها مع المجهر مضان قبل التضمين.وهذا مفيد خصوصا إذا كان المقصود المجهر مترابط، لأنه يتيح سهولة تحديد ونقل نواة واحدة. (الشكل 2-4).
المثال الأول (الشكل 3) ويظهر في خط خلية U2OS التعبير عن ثابت MDC1 miniSOG-mCherry. في تجربة microirradiation الليزر، وكان توظيف MDC1 تحتوي على miniSOG وmChrerry علامات مشابهة جدا لإصدارات الموسومة GFP هذا البروتين (لا تظهر البيانات). تحديد الخلايا 1 ساعة بعد الحمض النووي من التلف تحريض وإعداد نموذج للTEM، تم تحديد المسارات الضرر MDC1 بسهولة في أقسام رقيقة جدا في وضع TEM كالمعتاد الظلام المشارب في جميع أنحاء نوى، وهو ما يعادل جيدا للبيانات مضان ( الشكل 3-5). عند النظر في التوزيع من البروتين، يمكن ملاحظة زيادة واضحة في إشارة النيتروجين في المواقع التي تضررت من الليزر. لا بد من الإشارة هنا إلى أن هذا هو السبب في المقام الأول من قبل diami بلمرة nobenzidine، وهي غنية بالنيتروجين وتضخيم إشارة من miniSOG الموسومة البروتين إصلاح، وليس فقط من خلال تراكم البروتينات إصلاح في المسار الضرر. مقارنة هيكل لونين في بقية النواة مع هيكل في المسارات الضرر يظهر فرقا واضحا. لونين التالفة (الذي يظهر في الخطوط المتقطعة في الشكل 3) يبدو أكثر decondensed على النقيض من لونين غير المشع، والذي يحدث في التلال سميكة في جبلة النواة. ضمن المسارات الضرر، ويمكن أيضا أن تراعى الهيئات النووية (200-300 نانومتر) (عن طريق السهام أبرزت في الشكل 3 II2، بنك الاستثمار الدولي، جنة التحقيق المستقلة والثالث ألف) التي هي غنية في البروتين MDC1-miniSOG ولكن خالية من الحمض النووي. سيكون من الصعب للغاية تحديد هذه الهيئات النووية وهياكل خالية من لونين من دون هذه التقنية. فهو يشير أيضا إلى مستوى إضافي من التعقيد إلى مواقع الضرر الذي لا يتوقع من الكيمياء الحيوية المعروفة من MDC1.
ntent "> وعند النظر إلى المسارات الضرر من 53BP1 (الشكل 4) التي تم إنشاؤها باستخدام نفس الظروف حيث أن الضرر هو موضح سابقا في الخلايا transfected MDC1، نتائج مماثلة جدا يمكن ملاحظتها. إشارة التي تم إنتاجها من قبل التأكسد الضوئي لل كان miniSOG مزدحمة ويملأ الفراغ بين طيات لونين. هذا ويمكن ملاحظة الهيئات النووية الملون بالديون (التي أبرزها سهم في الشكل 4 D، E، F).من التجارب مع بنيات Rad52-GFP، فمن المعروف أن Rad52 ستشكل microcompartements مشرق صغيرة 24 على طول المسار الضرر الناجم عن الليزر. يرجع ذلك إلى حد قرار المجاهر التقليدية الخفيفة، فقد كان من غير الواضح مدى ضخامة هذه الهياكل هي في الواقع وكيف تتصل تلف الحمض النووي. وعند النظر إلى صورة TEM من نوى U2OS-المشع ليزر معربا جوهري Rad52-miniSOG-mCherry، تم قياس حجم هذه الهيئات أن تكون في متوسط (150-250 نانومتر). إنهاحتى أكثر إثارة للدهشة أن ننظر إلى هذه البؤر مع ESI. وعلى النقيض من الأمثلة السابقة، ويبدو أن بؤر Rad52-miniSOG-mCherry التي سيتم تنظيمها بشكل مختلف تماما على طول المسار الضرر ويبدو أن هياكل الجسم مثل النووية المدمجة التي تتكون من البروتين وليس لها أي الأحماض النووية التي يمكن اكتشافها داخل الداخلية الخاصة بهم. على أساس النظر في نوكليك حمض العلاقة / البروتين في المناطق المتضررة التي تم الحصول عليها من خلال الجمع بين miniSOG وESI النهج، فإننا نقترح أن إصلاح الحمض النووي قد تجري على السطح من البؤر وليس في الداخل.
في الصورة السفلى في الشكل 5 يظهر نتائج مشابهة للشكل 3-III. يبدو أن لونين في المنطقة المتضررة إلى أن أكثر decondensed مقارنة لونين في المناطق غير المعرضة للإشعاع (انظر المنطقة التي حددها شرطات الحمراء).
الخلايا المعرضة للإشعاع غاما
في حين الليزر الدقيقة التشعيع هو أداة مريحة على وجه السرعهذ اختبار البروتينات التي تحتوي على علامة فلوري للتجنيد في مواقع آفات الحمض النووي، فإنه يخلق كميات كبيرة من الضرر معقدة (فواصل حبلا مزدوج، فواصل حبلا واحدة، والضرر القاعدة، وdimers cyclopyrimidine) 25. من أجل دراسة المقصورات التي تشكل حوالي DNA فواصل حبلا مزدوج أكثر مباشرة، درسنا DRFs التي تشكل حوالي DSBs الفردية من خلال تعريض الخلايا لأشعة جاما.
تعرض خلايا U2OS التي تعبر عن ثابت 53BP1-miniSOG-mCherry إلى 2 غراي من أشعة جاما وثابتة لمدة نصف ساعة بعد التشعيع. ويمكن ملاحظة نمط مميز من بؤر كبيرة موزعة في جميع أنحاء جبلة النواة (الشكل 6Ia). بعد الصور أكسدة diaminobenzidine، يمكن رؤية بقع داكنة الناشئة في المواقف التي تقع فيها إشارات mCherry الفلورسنت في الميكروسكوب مضان في الميكروسكوب الإلكتروني (الشكل 6Ib وج). يمكن أن تكون مرتبطة هذه البقع إلى تيم الصورالتي تم اتخاذها في التكبير المنخفض (الشكل 6Id وه). الصور ESI من هذه البؤر، والتي يبدو أن حوالي 1-1.5 ميكرون في القطر، وأظهر هيكل مثيرة للاهتمام. بدت خيوط رقيقة من لونين إلى أن تتخللها البروتين 53BP1 ما يقرب من ضعف سمك.
في تجارب أخرى، تعرض الخلايا إلى كمية أكبر من الإشعاع وثابتة في وقت لاحق نقاط الوقت (بعد 3 ساعات و 6 ساعة، على التوالي) من أجل توليد بؤر أكبر وتسهيل تحديد مكان لهم في أقسام رقيقة جدا (الشكل 7). لأننا قادرون على الخريطة بشكل منفصل البروتين النووي والبروتين، ESI يكشف عن أن هيكل بؤر يبدو أن إعادة تنظيم مرور الوقت. يظهر القيمة النسبية للبروتين 53BP1 في التركيز على زيادة بينما يأخذ لونين موقف أكثر هامشية.
منذ تظهر 53BP1 بؤر أيضا في الخلايا بأنها "بؤر خفي" في الخلايا G1 في مواقع تحت تكرار غير المشع-د DNA 26،27، تم تصويرها أيضا تلك البؤر. ويبدو أن هذه البؤر خفي الى الميناء على كميات عالية من البروتين نسبة إلى بؤر الإشعاع المستحث وتظهر بنية منتظمة للاهتمام من لونين.
وهكذا، تصور إصلاح الحمض النووي مكونات البؤر باستخدام طريقة miniSOG يساعد على تحديد مناطق الحمض النووي من التلف وخريطة توزيع الموسومة البروتين إصلاح نسبة إلى لونين.
الشكل 1. نظرة عامة على الهياكل التي يمكن ملاحظتها في صورة ESI الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
(A) صورة ESI على فأرة الحاسوب الليفية الجنينية. وتحيط التلال لونين (الأصفر) من خلال جبلة النواة (السماوي) يملأ س interchromatinالآس. ويحيط النواة التي المغاير الطرفية وchromocenters (أسفل اليسار) التي تقطعها المجمعات المسام النووية (السماوي). والأنوية يمكن فصلها بشكل واضح لونها. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن كمية البروتين مقارنة الحمض النووي هو أعلى في بنية نويي مما هو عليه في لونين هذا. خارج النواة، الميتوكوندريا وريبوسوم (الغنية في حمض النووي) ويمكن التعرف عليها بسهولة.
(B) صورة من نواة وcentrosomes (انظر السهام)، والتي يمكن أن ينظر إليها على أنها جسيمات الغنية بالبروتين جوفاء في الجانب الأيسر العلوي من الصورة.
القسم (C) الصليب من خلال لوحة الطورية. وقد محاذاة الكروموسومات الطورية مكثف للغاية للقرص الذي يمتد من الزاوية العليا اليسرى إلى الزاوية اليسرى السفلى. تركيزات عالية من النيتروجين واضحة على سطح بعض الكروموسومات. هذه المناطق هي kinetochores (انظر السهام).
(الصف العلوي) الصورتين الأولى في الصف تظهر الخرائط نسبة من الفوسفور والنيتروجين. الصورة الأخيرة في الصف العلوي وتظهر هذه الخرائط عنصري فرضه في مساحة اللون RGB. تمثل الهياكل الصفراء البروتينيات، مما يعكس وجود كل من الفوسفور والنيتروجين. (الصف السفلي) وتظهر الصورة الأولى الخريطة الفوسفور، الذي يكشف في المقام الأول توزيع الحمض النووي في العينة. يظهر في الصورة الوسطى توزيع المنضب الحمض النووي / stru سلبي ctures. تم حساب ذلك عن طريق طرح خريطة الفوسفور من الخريطة النيتروجين. يظهر في الصورة اليمنى السفلى دمج لخريطة الحمض النووي وخريطة البروتين في لون الفضاء مطروح. وينبغي استخدام هذا المركب اللون للمساعدة في تحديد الهياكل الفردية وتصنيفها كما البروتين النووي أو لا البروتين النووي. وينبغي جمع معلومات كمية عن وفرة الفوسفور والنيتروجين بصريا من الفوسفور الصافي وصافي النيتروجين خرائط اللون الرمادي أو من المركبات الناتجة عن استخدام الألوان المضافة، كما هو الحال في الصف العلوي. 
الشكل 2. إنشاء متعددة الألوان ESI الصورة 
الرقم 3. الليزر أشعة الصغيرة من الخلايا U2OS التعبير عن ثابت MDC1-miniSOG-mCherry. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم تضخيم (II) المنطقة، التي أبرزها الساحة الخضراء في جيم وأظهرت في وضع انتقال طبيعي (IIA) وESI (بنك الاستثمار الدولي). يظهر جنة التحقيق المستقلة تراكب الصورة ESI مع الإشارة المسار الضرر. تم الحصول على إشارة الضرر تتبع من قبل العتبة الصورة العليا.
(III) أمثلة على هيكل الليزر الجزئي لونين -irradiated والكروماتين خارج منطقة التي تضررت الليزر.
الرقم 4. الليزر أشعة الصغيرة من الخلايا معربا عن ستابلي 53BP1-miniSOG-mCherry. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
العمود الأيسر: (A) الإسفار، (B) TEM التقليدية و(C) ESI صورة الجزئي ليزر نفس المشع النواة.
العمود الأيمن: (D) التقليدية TEM، (E) ESI و (F) تراكب الصورة ESI مع الإشارة miniSOG التي كانت مجزأة العتبة من (D) (راجع الخطوة 6.10)
-together.within صفحة = "دائما"> 
الرقم 5. U2OS خط خلية التعبير عن ثابت Rad52-miniSOG-mCherry والتي تضررت من الليزر الجزئي التشعيع. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
(A) تراكب من صورة مضان مع انخفاض التكبير TEM صورة تظهر ليزر microirradiated U2OS النواة مع المسار الضرر في أسفل اليسار.
(B) متحد البؤر مضان التمثيلية صورة مجهرية من الصغر ليزر معرضا للاشعاع نواة هويشت الملون (الأزرق) معربا عن Rad52-miniSOG-mCherry يظهر نمط مميز من بؤر صغيرة على طول المسار الضرر (إشارة حمراء).
(C) التقليدية TEM، (D) ESI،
(G) ESI صورة أخرى نواة U2OS التعبير عن ثابت Rad52-miniSOG-mCherry يظهر الضرر مسار الليزر التي يسببها في سياق نواة بأكملها.
الرقم 6. خلايا U2OS التعبير عن ثابت 53BP1-miniSOG-mCherry مع المشع 2 غراي وثابتة بعد 30 دقيقة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
(I) أ) تظهر صورة الإسفار بؤر 53BP1 الناجم عن أشعة غاما. ب) التي تنتقل صورة الخفيفة بعد بلمرة ضوئية المنشأ. ج) ربوتكأerlay من مضان مع صورة الخفيفة المرسلة. د) صورة انخفاض التكبير TEM (الشريط الأسود هو شريط شبكة TEM). ه) تراكب للصورة الفلورسنت مع انخفاض تكبير الصورة TEM.
التركيز (II) الأضرار التي تحمل علامة النجمة في الصورة الخفيفة التي تنتقل عن طريق تسجيلها في TEM العادي ووضع ESI. أ) صفر الخسارة، ب) ESI، ج) الفوسفور، د) البروتين ه) تراكب ESI والإشارة مجزأة من الصورة صفر الخسارة.
التركيز (III) الأضرار التي تحمل علامة الصليب في صورة مضان سجلت في TEM العادي ووضع ESI. أ) صفر الخسارة، ب) ESI، ج) الفوسفور، د) البروتين ه) تراكب ESI والإشارة مجزأة من الصورة صفر الخسارة.
الرقم 7. التغييرات في هيكل بؤر بين بؤر بعد أوقات مختلفة من الإشعاع. < / قوي> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
خلايا U2OS 53BP1 miniSOG mCherry تتعرض ل6 جراى من أشعة جاما الثابتة بعد 3H (1A-E، FJ) و6H (2A-E، FJ) على التوالي. 3 يدل على غير المشععة نواة U2OS 53BP1 miniSOG mCherry يظهر التركيز خفي (AE). وتعرض الصور ESI بالترتيب ESI (الحمض النووي والبروتينات)، وحمض النووي (وحدها) والبروتين (وحدها)، ESI (الحمض النووي والبروتينات) + مجزأة إشارة miniSOG.
الرقم 8. بؤر DNA-إصلاح ما زالت واضحة في وضع الإرسال التقليدية عندما تم حذف آخر التثبيت مع رباعي أكسيد الأوزميوم. arge.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
سامسونج القسم (50 نانومتر) من نواة U2OS يظهر اثنين 53BP1 بؤر من عينة لم يخضع للمعالجة مع رباعي أكسيد الأوزميوم. (A) في وضع TEM التقليدية، فمن الممكن أن نرى مواقع الملون من البوليمر DAB حتى من دون تعزيز النقيض من وصمة عار المعادن الثقيلة. (B) على النقيض من بؤر يمكن تعزيزه عن طريق أخذ الصور صفر الخسارة (تصفية بعيدا عن الإلكترونات التي الأصل من الأحداث تشتت الجمع).
الرقم 9. تحديد من نافذة الإعدادات المثلى الطاقة لالفوسفور رسم الخرائط
(A) عنصري نسبة خريطة المسجلة لالفوسفور مع آخر الحافة على 155 فولت وقبل حافة عند 120 فولت.
محتوى "> (B) نسبة عنصري خريطة سجلت لالفوسفور مع آخر الحافة على 175 فولت وقبل حافة عند 120 فولت.(C) حساب الخرائط نسبة الفوسفور من نافذة ما قبل حافة ثابتا عند 120 فولت فقدان الطاقة ومتغير ما بعد حافة النافذة بدءا من فقدان الطاقة 140-200eV من أجل تحديد تركيبة هذا هو الأفضل في المقابل. الفرق كثافة من ألمع وdimmestpixel في خط المسح الذي يمتد على مدى نفس الفوسفور الغنية والفوسفور منطقة فقيرة يظهر أعلى القيم المقابل (المدى الديناميكي) عندما تم اختيار صورة ما بعد الحافة من 175 فولت فقدان الطاقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ESI يمكن أن تكون بمثابة أداة ممتازة لفحص حالات مختلفة من لونين وribonucleoproteins في النواة لأنه قادر على خريطة المناطق التي هي غنية في الفوسفور على وجه التحديد. وهو يعزز بشكل كبير من كمية التفاصيل التي يمكن الحصول عليها عن طريق المجهر الالكتروني وليس اعتمادا على الأساليب المتناقضة غير محددة. عيب واحد من ESI هو أنه يتطلب أقسام أرق من TEM التقليدية في نفس الجهد المتسارع. يمكن التغلب على ذلك من خلال العمل مع مسلسل أقسام أو باستخدام أساليب تصوير الشعاعي الطبقي 28.
على الرغم من أن الكثير من المعلومات التي يمكن الحصول عليها من خلال النظر في توزيع الفوسفور والنيتروجين، والمثير للاهتمام أن تكون أيضا قادرة على رسم خريطة للتوزيع بعض البروتينات. مع أسلوب عرض في هذه الورقة، وقد تبين أن ESI يمكن الجمع بين الأساليب التي تستند إلى البلمرة في مواقع محددة من diaminobenzidine. على الرغم من أن هذه الطريقة لا يضيف فوليرة لبنانية لون جديد لESI، فمن الواضح أنه من المفيد أن خريطة توزيع بروتين. وينطبق هذا بشكل خاص على البروتينات التي تتفاعل مع لونين. إذا تحتاج إلى دراسة لتصور السكان البروتين أكثر من واحد، وطرق وضع العلامات باستخدام immunogold لا يزال من الممكن استخدامها عند تطبيقه كما التضمين قبل التلوين، قبل التأكسد الضوئي 9. بالمقارنة مع خطوط الخلايا مستقرة، transfections عابرة يكون العيب أن مستويات التعبير يمكن أن تختلف بشكل كبير بين الخلايا، وبالتالي يجعل من الصعب العثور على خلايا متعددة معربا عن كميات مماثلة من البروتين الكلمات الدلالية. ولذلك، فمن المستحسن إنشاء خطوط الخلايا مستقرة. ومع ذلك، فمن الممكن أن نحكم على القيمة النسبية للبروتين التعبير باستخدام التصوير مضان وتحديد الخلايا مع التعبير وسيط التالية ترنسفكأيشن عابر.
على الرغم من أن miniSOG الانصهار البطاقة هي فلوري نفسها، العائد من الكم هو أسوأ بكثير من GFP (0.37 مقابل 0،6) 10. لpurpبيئة نظام تشغيل المجهر مترابط، إضافة الفلورسنت العلامة بروتين إضافية مثل mCherry يسمح التصوير في الخلايا الحية دون إنتاج الأكسجين القميص الذي يحدث مع miniSOG الإثارة. مستوى التعبير من البروتينات miniSOG الموسومة، وكمية الأكسجين في المنطقة العازلة التي تحتوي على DAB، ودرجة الحموضة يمكن أن يؤثر أيضا على سرعة التأكسد الضوئي. في بعض الأحيان يمكن أن يكون مشكلة للغاية لتحقيق متجانسة التأكسد الضوئي في المنطقة ذات الاهتمام بسبب الاعتماد ضوء رد الفعل التأكسد الضوئي. لفترة طويلة صور للأكسدة يمكن أن يؤدي إلى تلطيخ غير محددة وترسب الكثير من المعادن الثقيلة في العينة، والتي يمكن أن تعقد الكشف عن إشارات عنصر محدد من ESI. عملية التأكسد الضوئي وقتا طويلا جدا بحيث عادة ما تكون ملطخة عادة إلا منطقة صغيرة جدا تحتوي على عدد قليل من الخلايا على ساترة.
لقد أظهرنا مزيج من miniSOG الموسومة البروتينات مع ESI باستخدام أحادي الطبقة من تمسكا هو جين تاورجل خط الخلايا السرطانية. من حيث المبدأ، يمكن أن الأسلوب أيضا أن تطبق على أي عينة أخرى (الخميرة والبكتيريا والأنسجة، والجنين) طالما أنه من الممكن للتعبير عن البروتين miniSOG الموسومة عند مستويات معقولة والشفافية طالما وانتشار الأكسجين وDAB هو عالية بما فيه الكفاية للسماح مناسبة الصورة للأكسدة وتلطيخ بالتالي متجانسة. لخلايا تعليق، سيكون من المفيد لإصلاح الموقع من الخلايا على زلة غطاء باستخدام مادة لاصقة مثل بولي-L-يسين. للحصول على عينات سمكا، والأهداف مع الفتحة العددية أقل تحقيق إضاءة أكثر تجانسا ولكن يستغرق وقتا أطول لالصور أكسدة.
قدمنا استخدام البروتينات الانصهار miniSOG الموسومة أقرب إلى البروتوكول الأصلي الذي نشرته شو وآخرون 10 ممكن - بما في ذلك استخدام رباعي أكسيد الأوزميوم. هناك أنه يمكن ملاحظة ذلك، وبصرف النظر عن إيداع تفضيلي على DAB البوليمرات والأغشية، ويظهر رباعي أكسيد الأوزميوم بعض التفاعلات وترسب على معظم المواد البيولوجية في العينة (10 الشكل 3). رباعي أكسيد الأوزميوم لديه حافة عنصري في 45 فولت. هذه إشارة والبلازمونات لها يمكن فرضه على فقدان الطاقة الإلكترون الطيف مثل سمك الزيادات العينة والإلكترونات واحدة تخضع لعدة أحداث فقدان الطاقة أثناء مرورها من خلال العينة. هذا يمكن أن تحد من جودة الفوسفور الخرائط الأساسية إذا تستخدم عالية أوسو 4 التركيزات في إعداد العينات. التركيزات التي استخدمناها هنا، والتي هي أقل بكثير مما كانت تستخدم سابقا 10، سمحت توليد خرائط جيدة الجودة الفوسفور. في تجربة تستخدم الموسومة miniSOG البروتينات التي تطالب أعلى أوسو 4 تركيزات، وأفضل التركيز الذي لا يزال يسمح الفوسفور جيدا خريطة خلق يجب أن تحدد تجريبيا.
لقد وجدنا أن البوليمر DAB التي تشكل في بؤر إصلاح الحمض النووي هو sufficieكثيفة ntly أن ينظر في وضع TEM التقليدية (أو في وضع صفر الخسارة مع تباين أفضل) حتى عندما تم حذف بعد التثبيت مع رباعي أكسيد الأوزميوم (انظر الشكل 8). كان تقسيم الإشارات التي تم تسجيلها بهذه الطريقة قوية مثل استخدام العينات التي تم التعامل معها الأوسيميوم. اعتمادا على البروتين النووي الذي يجب أن تصور، وحجم الهياكل أنها تشكل وضرورة تصور أنظمة غشاء، واستخدام رباعي أكسيد الأوزميوم قد لا تكون ضرورية، وسوف حذفها إزالة إمكانات اخفاء التوقيع عنصر الفوسفور.
بالمقارنة مع غيرها من المطبوعات باستخدام ESI 18،29،30 استخدمنا إعدادات مختلفة لما قبل وما بعد حافة الصور من أجل توليد خرائط نسبة عنصري مع أقل قدر من الضوضاء. لقد تحدد تجريبيا الإعدادات المعروضة في مخطوطة (انظر الشكل 9). الإعدادات المختارة حول حواف ينبغي أن يؤدي إلى تصحيح ايلىالخرائط الذهنية ما لم النوافذ جمع ومتداخلة مع عناصر أخرى موجودة في العينة. في حالتنا، يمكن أن يكون مثل الكبريت عنصر. حيث أن تركيز الكبريت (الذي يحدث في ميثيونين الأحماض الأمينية والسيستين) منخفض جدا، ويسهم في خريطة محسوبة فقط في كمية لا تذكر، ونحن نعتقد أن أفضل نسبة S / N التي حصلنا عليها باستخدام الإعدادات المستخدمة هنا تفوق المساوئ التي قد تنشأ من آثار الكبريت في العينة.
إنا أنزلناه في التركيب الدقيق للDRFs في قرارات نانومتر باستخدام بروتينات إصلاح الحمض النووي MDC1، 53BP1 وRad52 جنبا إلى جنب مع تقنيات ESI وTEM. تم حل تنظيم لونين والأفراد DSB البروتين إصلاح التعريب باستخدام هذا النهج. وقد أظهرت التعريب في مجالات غنية آفات الحمض النووي DNA التالية الليزر الدقيقة التشعيع والميل للبروتينات إصلاح لملء الفراغ بين التلال لونين. في حالة Rad52، الذي جيش التحرير الشعبى الصينىيس دورا في إعادة التركيب مثلي، وتشكيل هيئة تشبه هياكل كروية النووية على طول المسار التي تضررت من الليزر يمكن ملاحظة وكان هذا على النقيض من الأخرى اثنين من البروتينات التي تم اختبارها. عندما يتم تطبيق الأضرار التي أشعة جاما، شكلت 53BP1 بؤر حول لونين التالفة. يبدو أن التكوين النسبي والموقف من لونين والبروتين في بؤر لتغيير مع مرور الوقت. العلاقة بين هذه البروتينات والكروماتين التالفة وكذلك التغييرات في تنظيم الكروماتين وتكوين الهيئات النووية يمكن بكل يسر وسهولة الحصول عليها باستخدام تقنية ESI حين brightfield المجهري التقليدي باستخدام اليورانيوم والرصاص وكلاء المتناقضة لا يمكن تقييم هذه الخصائص مباشرة. وهكذا، تظهر هذه التقنية إمكانية كبيرة لدراسة العلاقات هيكل وظيفة، ولا سيما بالنسبة للعمليات تعمل على الحمض النووي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Gridded 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-2-14-CGRD | not made for immersion objectives |
| LR White: acryl resin | emsdiasum | 14381 | |
| LR White accelerator | emsdiasum | 14385 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets | Sigma | D5905 | |
| Slim Bar Grids 300 Mesh | SPI | 1161123 | |
| Tungsten-Point Lab Pen | emsdiasum | 41148 | |
| Osmium Tetroxide | emsdiasum | 19100 | |
| Carbon Coater 208 carbon | Cressington | ||
| Ultra microtome Leica EM UC6 | Leica | ||
| Photoshop CS5 | Adobe | might even work with older versions | |
| Digital Micrograph V.2.30 | Gatan | might even work with older versions | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H-1399 | |
| Effectene | Quiagen | ||
| MiniSOG-Constructs | Tsien-Lab | tsienlab@yahoo.com | |
| MDC1 miniSOG mCherry | |||
| 53BP1 miniSOG mCherry | |||
| Rad52 miniSOG mCherry | |||
| cesium 137 radiation source "MARK 1" | (J.L. Shepherd & Associated) | ||
| ImageJ/FiJi | open source | http://fiji.sc/Fiji | |
| 2 ml Eppendorf tubes | Fisherbrand | 05-408-146 | |
| Diamond Knife ultra 35° | Diatome | ||
| Trimming Knife ultratrim | Diatome | ||
| Sodium cacodylate trihydrate | emsdiasum | 12300 | Caution Toxic! |
| Glutaraldehyde EM Grade 8% | emsdiasum | 16020 | Caution Toxic! |
| Sodium phosphate dibasic | emsdiasum | 21180 | |
| Sodium phosphate monobasic | emsdiasum | 21190 | |
| Paraformaldehyde | emsdiasum | 19202 | |
| Osmium tetroxide 4% solution | emsdiasum | 19150 | |
| Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Hydrochloric Acid | Fisherbrand | A142-212 | |
| Sodium Hydroxide Solution 10M | Fluka | 72068 | |
| Oxygen | Medigas | ||
| 3-Amino-1,2,4-triazole | Sigma | A8056 | |
| Potassium cyanide | Sigma | 207810 | Caution Toxic! |
| Ethanol | emsdiasum | 15058 | Caution Toxic! |
| Razor blade Single Edge Carbon Steel | emsdiasum | 71960 | Caution Sharp! |
| DMEM | Sigma | D 5546 | |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | |
| G418 | Life Technologies | 11811-023 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Transmission Electron Microscope 200 kV | JEOL | 2100 | |
| GIF Tridiem 863 Energy filter | Gatan |
References
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).
- Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. Stoichiometric analysis of protein- and nucleic acid-based structures in the cell nucleus. Micron (Oxford, England: 1993). 30, 151-157 (1999).
- Michael J Hendzel, F. M. B., Bazett-Jones, D. P. Direct Visualization of a Protein Nuclear Architecture. Molecular biology of the cell. 10, 2051 (1999).
- Ottensmeyer, F. P., Andrew, J. W. High-resolution microanalysis of biological specimens by electron energy loss spectroscopy and by electron spectroscopic imaging. Journal of ultrastructure research. 72, 336-348 (1980).
- Leapman, R. D., Ornberg, R. L. Quantitative electron energy loss spectroscopy in biology. Ultramicroscopy. 24, 251-268 (1988).
- Simon, G. T. Electron spectroscopic imaging. Ultrastructural pathology. 11, 705-710 (1987).
- Egerton, R. Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , Springer. (2011).
- Aronova, M. A., Kim, Y. C., Zhang, G., Leapman, R. D. Quantification and thickness correction of EFTEM phosphorus maps. Ultramicroscopy. 107, 232-244 (2007).
- Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. Chimeric molecules employing horseradish peroxidase as reporter enzyme for protein localization in the electron microscope. Methods in enzymology. 327, 35-45 (2000).
- Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS biology. 9, e1001041 (2011).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science (New York, NY). 296, 503-507 (2002).
- Fernandez-Capetillo, O., Celeste, A., Nussenzweig, A. Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors. Cell cycle (Georgetown, Tex). 2, 426-427 (2003).
- Haaf, T., Golub, E. I., Reddy, G., Radding, C. M., Ward, D. C. Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 2298-2302 (1995).
- Maser, R. S., Monsen, K. J., Nelms, B. E., Petrini, J. H. hMre11 and hRad50 nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 17, 6087-6096 (1997).
- Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA repair. 9, 1219-1228 (2010).
- Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. Journal of cell science. 125, 3529-3534 (2012).
- Dellaire, G., Kepkay, R., Bazett-Jones, D. P. High resolution imaging of changes in the structure and spatial organization of chromatin, gamma-H2A.X and the MRN complex within etoposide-induced DNA repair foci. Cell cycle (Georgetown, Tex). 8, 3750-3769 (2009).
- Kruhlak, M. J., et al. Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks. The Journal of Cell Biology. 172, 823-834 (2006).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor protocols. 2010, (2010).
- Zeyda, M., Borth, N., Kunert, R., Katinger, H. Optimization of sorting conditions for the selection of stable, high-producing mammalian cell lines. Biotechnology progress. 15, 953-957 (1999).
- Dellaire, G., Nisman, R., Bazett-Jones, D. P. Correlative light and electron spectroscopic imaging of chromatin in situ. Methods in enzymology. , 375-456 (2004).
- Campbell, S., Ismail, I. H., Young, L. C., Poirier, G. G., Hendzel, M. J. Polycomb repressive complex 2 contributes to DNA double-strand break repair. Cell cycle. 12, 2675-2683 (2013).
- Mortusewicz, O., et al. Recruitment of RNA polymerase II cofactor PC4 to DNA damage sites. J Cell Biol. 183, 769-776 (2008).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173, 195-206 (2006).
- Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Frontiers in genetics. 4, 135 (2013).
- Lukas, C., et al. 53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress. Nature. 13, 243-253 (2011).
- Harrigan, J. A., et al. Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells. The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).
- Aronova, M. A., et al. Reprint of 'Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST). J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).
- Fussner, E., et al. Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming. The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).
- Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin. Cell cycle. 10, Georgetown, Tex. 308-322 (2011).
