Abstract
광학 해상도 및 투과 전자 현미경에서 특정 단백질 집단을 식별 도전 제한은 세포 생물학에서 장애물왔다. 많은 현상 시스템의 단순화 된 시험 관내 분석에 의해 설명과 완전하게 이해되기 위하여, 특히 1 nm 내지 0.1 ㎛의 범위 사이에, 반응계 내에서 추가 구성 정보를 필요로 할 수 없다. 여기서, 전자 분광 이미징, 단백질 및 핵산의 분포의 동시 맵핑을 허용 투과 전자 현미경 기법 및 식 태그 miniSOG은 DNA 이중 가닥 브레이크 수리 병소의 구조 및 조직을 연구하기 위해 결합된다.
Introduction
최근 몇 년 동안 1 이상의 광학 현미경에서 상당한 발전에도 불구하고, 세포 생물 학자들은 여전히 해상도의 차이로 고통. 이 고분자 복합체 간의 상호 조정을 수반 기본적인 세포 과정의 구조 - 기능 관계의 이해를 제한 (예를 들어, 크로 마틴 리모델링, DNA 수리, RNA의 전사 및 DNA 복제에). 투과형 전자 현미경 (TEM)이 필요한 해상도를 제공이야 있지만, 또한 시각 구조 생화학 적 조성물을 판별 할 수있는 동안 특정 단백질 라벨을 구조적으로 인해 무능력 이러한 프로세스를 정의하는 도전되었다. 핵 구조를 차별화하기 위해, 내부의 막 부재에있어서, 핵은 특히 도전왔다. 전자 분광 영상 (ESI)는 DNA, RNA, 및 PROT의 동시 검출 및 분화를 허용함으로써 이러한 제한 사항 중 일부를 해결핵 구조 2-5 EIN 기반.
전자 분광 영상 :
전자 현미경에서의 높은 감도 및 해상도의 원소 분포를 맵핑하기 위하여, 하나는 비탄 성적 시편 (6) 소자의 내부 쉘 전자와의 상호 작용을 통해 산란 된 전자를 선택 촬상 분광계를 사용할 수있다. 에너지의 원소가 특정 량의 시료 원자의 이온화의 결과로 소실되기 때문에,이 전자를 분리하고, 전자 현미경에 부착 된 분광계를 이용하여 가시화 될 수있다. 따라서, 검체와 상호 작용 한 전자 스펙트럼의 분석 시료 7의 원소 조성에 대한 정량적 정보를 보여준다. 시료를 통과 할 때의 에너지를 잃지 않는 전자는 전자 에너지 손실 "제로 손실의 피크"에서 발견스펙트럼. 이러한 전자 풍부 시험편의 질량, 밀도 및 두께에 관련되고, 시료에 충돌 또는 시험편을 통과하는 동안 에너지를 손실하지 않고 시료를 통과하는 전자가 구성된다. 이 정보는 시료 8의 특정 원소 존재의 원자 수의 절대 정량에 유용 할 수있다.
생물학적 시료는 중금속을 사용하는 대부분의 저조한 TEM 입사 빔 내의 전자를 편향 광 소자, 염색 방법으로 구성되어 있기 때문에 염 샘플 콘트라스트를 생성하기 위해 적용되어야한다. 이들 조영제 및 무능력 대부분 특이성이 가능 하나 이상의 얼룩을 시각화하는 특이성의 결여는 핵의 연구에서, 종래의 전자 현미경의 값을 한정 하였다. ESI 특히 세포 핵의 구조 연구를 위해, 종래의 TEM에 비해 상당한 장점을 갖는다.이는 단백질 복합체로부터 핵 단백질 복합체를 구별하는 핵산들의 밀도에 기초하여 다른 핵 단백질 복합체를 해결하기 위해 DNA- 및 RNA 함유 고분자 복합체 인 풍부한 자연을 활용하는 것이 가능하다. 나머지 생체 물질을 질소의 그 풍부한 기반으로 묘화 될 수있다. 다른 해부학 적 구조 내에서의 분포와 상대 풍요의 매핑 바로이 두 요소와 분석은 핵에 대한 많은 정보를 우리에게 제공한다. 예를 들어, 염색질 및 인을 풍부하게 표현하는 맵 리보솜을 쉽게 식별 할 수있다. interchromatin 공간 핵공 복합체와 핵 체는, 다른 한편으로는, 쉽게 질소 맵 이미지에서 검출 될 수있다.
미니 중항 산소 발생기 시스템 (miniSOG)
ESI는 강력한 기술을 나타낸다는 가지고 있기 때문에 현장 크로 마틴 구조에서 공부하기인 및 질소 원소 사이의 조성 비율의 특성의 장점은, 원소 조성은 일반적으로 단백질 복합체의 여러 집단 구별하는데 사용될 수 없다. 나노 미터 범위의 작은 금 입자로 표지 된 항체는 널리 개별 분자의 위치를 매핑하는데 사용되어왔다. 금 입자는 일반적으로 이차 항체에 부착되어 있기 때문에, 차 항체에 의해 검출 에피토프 주위 약 20nm의 원주 내에 표시한다. 매립 후 샘플에서, 항체는 단 부분의 표면에 노출 된 에피토프를 검출 할 수있다. 그것은, 얻어진 정보를 항원의 존재를 입증하고 셀의 특정 해부학 적 구조에 관련시키는 것이 가능하지만 에피토프의 대부분이 수지에 의해 가려 때문에, 불완전하다. 걸쳐 항원에 대한 액세스를 허용, 형광 현미경에 사용되는 것과 유사한 프로토콜을 사용하는 기술을 미리 매립시료의 전체 깊이 있지만, 일반적 지질막의 제거를 요구하고 알데하이드에 의해 고정 될 수없는 요소를 제거 항체가 세포에 침투하도록 허용해야 투과성으로 단계. 또한, 미세 구조 보존, 글루 타르 알데히드에 대한 선호 알데히드 정착액은, 일반적으로 그 결과, 파라 포름 알데히드는 일반적으로 필요하며, 항원을 파괴하고. 이 단백질 - 단백질 가교에 덜 효과적이다. 금 나노 입자와 함께 표시되어 항체의 또 다른 단점은 금이 약한 콘트라스트가 샘플, 흥미로운 세부 구조를 모호 할 수있는 강한 대비를 생성하는 매우 전자 밀도가 높은 물질 것입니다.
발현 된 단백질 태그와 같은 녹색 형광 단백질 (GFP)의 출현은 세포 생물학의 질문에 대답하기 위해 형광 현미경의 사용을 변형시켰다. 작은 형광 도메인과 단백질에 태그를 지정하면 생체 내에서 유통의 매핑을 할 수 있습니다 (9)의 세포질에 촉매 활성이 아니다. 그들의 해상도 nanogold 방법 10보다 더되도록 HRP의 반응 생성물도 생성 부위에서 멀리 확산 될 수있다. 이러한 문제를 우회하기 위해, 플래시 / ReAsH 시스템 (11)을 개발 하였다. 그것은 tetracysteine 모티브를 가지고 재조합 융합 단백질로 구성되어 있습니다. 이 모티브의 결합을 할 수 있습니다biarsenic 형광. 여기 된 때, 결합 또는 플래시 ReAsH는 태그 단백질의 부위에서 즉시 침전 합체에 고도로 반응성 일 중항 산소 따라서 photoconvert 디아 미노 벤지딘 (DAB)를 생성 할 수있다. DAB 중합체는 전자 밀도가되므로 TEM에서 재조합 융합 단백질의 분포를 매핑하는 데 사용할 수있는 산화 오스뮴으로 염색 할 수있다.
2011 년, 슈 등. (10)는 형광 및 448 nm의 푸른 빛으로 흥분 할 때 많은 중항 산소 라디칼을 생성 할 수있는 애기 장대의 flavoprotein에서 파생 된 작은 106 아미노산 융합 태그로 구성 miniSOG 시스템을 발표했다. 그 중항 산소 라디칼에 immunogold 및 표지 항체 (11)보다 상당히 더 가까운 태그 단백질의 표면 근처의 중합체를 형성하기 위해 광을 디아 미노 벤지딘이 산화하는데 사용될 수있다. 플래시 / ReAsH 시스템은 플루오로 데리고가 필요하지만크롬 광을하기 전에 세포에 디아 미노 벤지딘, miniSOG 시스템은 미노와 빛을 필요로하고 추가로 미노를 중합에서 약 두 배의 효과가있다. 여기서, miniSOG는 DNA 복구 병소의 미세 구조를 매핑하기 위해 ESI와 조합하여 사용된다.
DNA 수리 초점 (DRF)
그들은 전좌 및 유전 정보의 손실을 초래할 수 있기 때문에 복구되지 않은 DNA 이중 가닥 나누기는 세포에 심각한 위협을 제기. 차례로,이 노화, 암, 세포 죽음으로 이어질 수 있습니다. DNA 이중 가닥 브레이크 수리에 관여하는 많은 단백질은 12 ~ 14을 깰 DNA 이중 가닥 주위에 조립 초점에 축적. 그 기능이 알려져 있지 않지만, 그들은 DNA 이중 가닥 나누기를 포함하고 DNA 이중 가닥 브레이크 수리의 사이트입니다 핵의 위치를 나타냅니다.
DNA 수리 FOCI (DRF)는 형광 현미경에 의해 특성화되었다 그들은 DNA 손상 12,15위한 바이오 마커로서 작용한다. 그들은 이중 가닥 브레이크의 크기에 대규모 상대적 최근 슈퍼 해상도 현미경 연구는 각각 16 초점 내 분자의 서브 구획화의 증거를 공개 할 때까지 상대적으로 균일 한 고려되었다. 이러한 사이트가 구성되는 방법을 이해하기 위해서는, 서로에 기초 생물학적 구조의 모든 상대적인 시각화하는 것이 필요하다. 이것은 형광 현미경에 의해 달성되지만 전자 현미경 (17, 18)를 통해 가능하다 할 수 없다. 여기서, 방법은 DNA 이중 가닥 브레이크 수리의 미세 구조를 조사하기 위해,이 접근 방식의 조합의 가능성을 설명하기 miniSOG 방법으로 전자 분광 이미징을 결합한 것이 기재되어있다.
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Protocol
miniSOG 셀 라인의 1 세대
- 5 % CO 2의 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충된다 저 글루코스 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM) 2 ㎖를 함유하는 35mm 접시에 U2OS (인간 골육종) 세포 성장 분위기입니다.
- 그들은 miniSOG 및 mCherry위한 서열을 포함하는 플라스미드 작 제물이 형질 감염 시약 (19)의 제조자의 프로토콜에 따라 복구 단백질 태그 정제 형질 품질 (A269 / 280 비율 1.8 ~ 2.0)와 리포 펙션에 의해 80 % 컨 플루 언트가 될 때 세포를 형질 감염. miniSOG 발현 플라스미드는 첸 - 연구소에서 주문할 수 있습니다 : http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
- 이틀 후 형질을 정렬 형광 활성화 셀 miniSOG과 mCherry 태그 재조합 단백질을 발현 정렬 세포. 세포를 수집20 과발현되는 셀을 방지하기 위해 중간 형광 강도.
- 배양 10 % FBS 및 G418 선택 에이전트 (네티) 0.6 μg의 / ㎖로 보충 된 DMEM 배지 10ml에 10cm 접시에 양성 세포.
- 눈에 보이는 식민지 판에 등장 한 후, mCherry 긍정적 인 식민지를위한 화면이 거꾸로 형광 현미경을 사용하여 영구 마커 (접시의 바닥에) 그들 주위에 원을 그립니다. 낮은 배율 공기 대물 렌즈 (예를 들어, 10 배)를 사용하여 조심스럽게 무균 1,000 μL 피펫 팁으로 그들을 빨아 천천히 떨어져 식민지를 긁적에 의해 멸균 기술을 사용하여 클론을 선택합니다.
- 선택된 콜로니를 확장 및 10 % 디메틸 설폭 사이드와 보충 단계 1.1에 기재된 성장 배지를 사용하여 이들 부품을 동결. 멸균 18 X 18mm 2 커버 슬립에 그들을 성장에 노출시킴으로써 DRF 형성 세포를 테스트방사선의 2 Gy를. 안정적 miniSOG mCherry 발현 조사 세포 mCherry을 이미징 필터 세트하여 형광 현미경으로 가시화 될 때 복구 단백질 DSBs의 전형적인 패턴 초점 특성을 보여야 태그.
2. 세포 배양
- 문화 U2OS 세포를 안정적으로 miniSOG을 표현하고 mCherry 단계 1.1에 설명 된 조건에서 수리 단백질 태그. DMEM 2 ㎖를 함유하는 35mm 직경의 유리 바닥 접시에서 80 % 컨 플루 언시에 셀을 성장한다. 플라스틱 및 사용 된 플라스틱으로 커버 슬립을 부착 접착제가 사용되는 수지 수성 알코올 용액에 대한 내성과 내성이 있는지 확인하십시오!
- 실험을 수행하기 전에, 관심 지역을 식별하기 위해 형광 현미경을 이용하여 무균 다이아몬드 펜으로 긁어서 이소성 단백질을 발현하는 세포가 포함 약 1mm (2)의 작은 영역을 설명합니다. 또한 유리 바닥 접시 (T)를 사용모자는 커버 슬립에 내장 된 사전 에칭 그리드 시스템과 coverslip에 포함되어 있습니다.
참고 : ESI과 형광 현미경 사진 (21)을 결합 고품질의 상호 현미경을 사용하는 경우, 커버 슬립의 두께가 기름 침지 목표와 호환되는지 확인하십시오. 그것은 두께 제 1.5 (0.16-0.18 mm)를 가져야한다. 영역이 에지 근처에서 발생할 수있는 수지의 중합 문제를 방지하기 위해 TEM에서 검사하기 위해 접시의 중앙 부근의 영역을 선택 (점 4.10에서 4.13 사이를 참조).
3. DNA 손상 유도
- 감마 방사선을 조사 세포 radiomimetic 약물을 사용하거나, (18, 22 또는 23에 기재된 바와 같이, 예) 공 초점 레이저 현미경에 마이크로 조사에 의한 손상을 유도한다.
- 이 예에서, 405 nm의 졸을 사용하여 세슘 -137 방사선 소스 또는 레이저 microirradiate에서 감마선 조사의 2 Gy를 6으로 셀을 조사0.5 μg의 / ㎖ 훽스트 (Hoechst)와 20 분 동안 세포를 감작 후 공 초점 현미경의 ID 상태 레이저.
4. 샘플 준비
- 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼 또는 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 0.1 M 인산염 완충액 pH 7.4에서 4 % 파라 포름 알데히드주의 1 ㎖로 세포를 고정한다.
주의 : 파라 포름 알데히드 나트륨 cacodylate는 독성이! 장갑을 착용하고 적절하게 독성 물질을 폐기하십시오. - 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼 pH 7.4 인산염 완충액 pH 7.4의 4 ㎖로 두 번 세포를 씻으십시오.
- 2 ㎖의 50 mM의 글리신과 고정 세포를 치료, 5mM의 aminotriazole 30 분 동안 0.1 M 나트륨 cacodylate 완충액 0.1 M 인산 완충액 (pH 7.4)에 10 mM의 시안화 칼륨주의 (pH를 체크!) 미 차단하기 위해서 알데히드기 및 백그라운드를 증가시킬 수있는, 헴 그룹에 의해 생성 된 활성 산소 종을 억제.
주의 : 칼륨 시아 나이드는 매우 독성이! W귀 장갑, 후드에서 작동하고 적절하게 독성 물질을 폐기하십시오. 그 pH를 확인하고 정확한 것이 중요하므로, 반응의 pH는 매우 민감하다. - 상호 현미경이 필요한 경우, 반전 된 형광 현미경에 2D 또는 3D 단계 2.2에서 선택한 영역을 기록한다.
- 2 ml의 마이크로 원심 튜브에 10 mg의 디아 미노 벤지딘 염산염 태블릿을 배치하여 1 ㎎ / ㎖ 디아 미노 벤지딘 염산염주의 용액을 제조 하였다. 증류수 진한 염산 (11.65 M)의 2 O 20 μL의 980 μL를 추가하고 솔루션은 밝은 갈색 반투명 때까지 섞는다. 7.0와 7.6 사이의 pH를 수산화 나트륨으로 pH를 조정하는 동안 1 ㎎ / ㎖의 최종 농도 0.1 M 인산 나트륨, 0.1 M cacodylate 버퍼에서이 용액을 희석 (PH 7.4이 권장된다).
주의 : 미노는 독성이! 장갑을 착용하고 적절하게 독성 물질을 폐기하십시오. - 광산화, R 용eplace 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼 또는 인산염 버퍼에 1 ㎎ / ㎖ 디아 미노 벤지딘 염산염 용액 2 ㎖와 버퍼. 빛이 용액을 보호하고, 산소의 용해도를 증가시키기 위해 4 O를 C로 얼음에서 식힌. (용액 내에 삽입하고 산소 병에 연결된 호스를 사용) 용액을 통해 산소를 버블 링함으로써 산소를 포화 용액. 다시 pH를 확인하고 필요한 경우 조정합니다.
참고 : pH가 7.0, pH가 7.6 사이에있는 광산화 반응에 매우 중요합니다. - 조심스럽게 40 배 오일 침수 대물 렌즈가 장착 거꾸로 형광 현미경에 고정 된 세포와 접시를 탑재하고 관심 영역으로 이동합니다. GFP 또는 CFP에 대한 필터 큐브를 사용하여 푸른 빛 miniSOG 태그를 자극. MiniSOG는 473 nm의 10에서 어깨와 448 nm에서 여기 최대 있습니다.
- 심지어 녹색 miniSOG 형광 하 후 조명 계속완전히 사라지고 중합 디아 미노 벤지딘의 갈색 광산화 제품 투과광 채널에서 나올 때까지이야. 산화 생성물은 세포의 대부분에서 볼 때, 광산화 정지 형광 조명을 끄.
참고 : 사진 산화 대물 렌즈, 필터 전송 파장과 효율성 및 조명 소스에 따라 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. - 후위 0.1 M 나트륨 cacodylate의 pH가 2 % 글루 타르 알데히드 1 ml의 7.4 버퍼 또는 30 분 동안 인산염 완충액 pH 7.4와 세포.
- 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼 pH 7.4에서 0.1 M 인산염 완충액 pH 7.4에서 20 분 동안 0.1 % -0.5 %의 산화 오스뮴과 세포의 세포막을 고정한다.
주 : 세포막을 안정화하는 데 필요한 산화 오스뮴의 가장 낮은 농도를 사용하는 것이 좋습니다. 중합 DAB 석출물 ESI, 강한 의해 직접 검출 될 수 질소의 높은 밀도를 갖기 때문에오스뮴 염색 miniSOG - 태그 단백질을 확인하고 ESI에 유해 할 수 필요가 없습니다. 산화 오스뮴은 매우 독성이! 흄 후드에서 작업하고 적절하게 유독성 폐기물을 폐기하십시오. - 30 %, 50 %, 70 %, 90 %, 98 % 100 % 에탄올 단계 (각 5 분)를 이용하여 에탄올 시리즈를 통해 탈수 세포. 계속해서, (1)에 세포를 배양한다 : 100 % 에탄올 및 아크릴 수지 (LR 화이트)의 1 믹스 100에서 적어도 다른 4 시간 동안 세포를 배양하기 전에 세포 내로 침투를 용이하게하기 위해 4 시간 동안 진탕 기 상에 요리를 넣어 % 아크릴 수지 (LR 화이트).
- 수지를 중합하기 위하여, 면도날 및 아크릴 수지 코트 가속기 림으로 표지 된 2 ml의 마이크로 원심 튜브의 뚜껑을 잘라. 가속기는 림을 커버 튜브로 유입되지 않도록하십시오. 그 후, 조심스럽게 약 LR 화이트 수지는 파스퇴르 피펫을 사용하여와 3 분의 2를 튜브를 입력합니다. 수지가 접촉 재치로하지 않는주의H 림에 가속!
- 접시에 세포를 침투 수지를 제거하고 튜브의 폭이 거의 완전히 접시의 유리 덮여 관찰 창을 채우도록 똑바로 서 microcentrifuge 관에 거꾸로 접시를 놓습니다.
- 이어서, 튜브 및 커버 슬립을 밀봉 된 튜브에서 수지 이제 셀을 커버하도록 튜브를 반전 가속기 1 분에 2를 기다려.
- 60 ° C의 오븐에 튜브 접시를 배치하고 12 시간 동안 그것을 경화.
- 블록이 경화 될 때, 오븐에서 부착 수지 채워진 마이크로 원심 튜브 접시를 제거하고 접시로부터 마이크로 원심 분리 튜브. 액체 질소와 뜨거운 물에 동결 해동 사이클에 의해 분리를 용이하게합니다.
- 유리 접시 바닥을 조심스럽게 폐기 블록을 제거하기 위해 면도날 microcentrifuge 관을 오픈.
- 영구 마커 블록 레이블.
- 트라이 위해 면도날을 사용하여이전 다이아몬드 또는 텅스텐 펜으로 표시 영역을 포함 (또는 관심있는 셀 영역을 포함) 1mm 2 영역은 아무것도 남아 있지 않도록 블록 m.
- ,을 Ultramicrotome에서 블록을 탑재 트리밍 칼 블록을 잘라 내고 다이아몬드 칼을 사용하여 약 50 나노 미터의 매우 얇은 부분을 잘라.
- 높은 전송 300 메쉬 그리드에 섹션을 선택합니다. 이 그리드는 매우 작은 격자 바 있고, 따라서 관심의 영역에서 적은 수의 세포를 커버한다.
- 탄소 코팅의 약 0.2 ~ 0.4 nm의 TEM의 전자 비임하에 그들을 안정화하기 위해 탄소 코터와 격자에 섹션.
5. 전자 현미경
- 에너지 필터가 장착되어 TEM에 그리드를 넣습니다. 현미경 및 제조자의 지시에 따라 에너지 필터를 조정 한 후, 저배율 모드 부분에 세포 검사 (통상 송신) 및 비교(단계 4.4에서 얻은) 적절한 때 그 데이터를 형광합니다.
- 흥미로운 기능 (DNA 손상 트랙 또는 DNA 수선 병소)와 일단 핵 에너지 필터링 모드로 전환하는 결과와 두께 맵을 기록한다.
주 :이 절차는 제로 손실과 필터링되지 않은 이미지의 기록을 포함한다. 0.3 최대 두께는 자유 경로 (입사 빔의 전자의 30 %가 시료에 의해 산란 얻는다) 좋은 원소 맵을 생성하기에 충분히 얇다을 의미한다. - 사용되는 현미경의 에너지 필터를 제어하는 소프트웨어를 이용하여 요소의 인 및 질소의 레코드 비율 맵. 20 EV의 슬릿 폭 또한, 120 eV의 에너지 손실을 20 eV의 사전 가장자리 이미지의 슬릿 폭과 175 eV의 에너지 손실의 인지도 포스트 에지 영상을 기록한다. 또한 35 EV의 슬릿 폭과 358 eV의 35 eV의 사전 가장자리 이미지의 슬릿 폭과 447 eV의에서 질소지도, 기록 후 에지 이미지하십시오.
주 : 촬상 소자의 콘텐츠 이후 (phosphorus 및 질소) (약. 1 %), 잡음비 신호가 더 나은 이미지를 생성하기 위해 "3 윈도우 법"을 통해 "비 이미지"(질적 원소 맵) (원소 맵을 정량)을 선택 비교적 낮다.
6. 이미지 처리
- (예를 들어, 디지털 현미경 사진)의 획득 된 이미지 파일 형식을 처리 할 수있는 화상 처리 소프트웨어 원소 비율 맵을 연다. 빨강 채널과 RGB 이미지의 녹색 채널에 인지도에 질소 맵을 복사 한 다음 중첩 및지도를 맞 춥니 다.
- 태그가 지정된 이미지 파일 형식 (TIFF) 파일로 합성 이미지를 내 보냅니다. 레이어를 사용하여, 화상 처리 소프트웨어 (예, 포토샵)에 화상을 연다.
- 8 비트 데이터 세트 (0 ~ 255)로 이미지의 최소 및 최대 값을 재조정하여 각 채널의 동적 범위를 조정한다.
- 질소를 이용하여 맵에서 인 함량을 (빼기단백질의 분포를 도시 질적 맵을 생성하기 위해 "레이어"윈도우).
- "인덱스 컬러"에 이전 단계에서 생성 된 핵산 (인)와 단백질 (질소)의 맵을 변환하여 핵산 분포 및 시안 룩업 테이블을 도시 맵 CMYK 색 공간에서 노란색 룩업 테이블을 만들 비 핵 단백질지도를 표시합니다. 색상은 두 원소지도 사이의 최대 대비를 생성하기 위해 선택된다.
- 다른 레이어로 인 단백질의 분포를 보여주는지도를 새로운 이미지를 만들고 가져옵니다. 서로 중첩 양 층을보기 위해 "화면"투명도 모드를 사용한다.
- 단계 5.2에서 획득 한 제로 손실 이미지를 엽니 다. 이 이미지는 기존의 TEM 이미지처럼 보이는 기록 영역의 이미지를 나타내는하지만 시편과 충돌하지 않고 시료를 통과 한 전자를 포함하고 있습니다. 수출TIFF 이미지로이 이미지.
- 사진 편집기에서 내 보낸 제로 손실 이미지를 열고 원소지도를 보여주는 이미지의 최상층에 복사합니다. "화면"투명도 모드를 사용하여 이미지를 맞 춥니 다.
- 선택적으로 임계 값 세그먼트 제로 손실 이미지 miniSOG에서 유래 신호. 상술 한 바와 같이 별도의 레이어로 생성 된 이미지를 추가합니다.
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Representative Results
ESI
종래의 TEM 이미지로 핵 (도 1)의 ESI 이미지를 비교 (예를 들어,도 7-1)은 쉽게 구별 될 수 해부학 적 구조에서 극적인 증가를 보여준다. 염색질 능선은 노란색으로 표시하고 마우스 세포에서 chromocenters를 확인하는 것은 매우 쉽습니다. 사전 조립 리보솜 이미 인이 풍부 RNA에 더하여, 질소 풍부 단백질의 다량을 함유 보낸 핵소체 쉽게 그들의 원형 구조와 다른 색으로 염색질 구별 될 수있다. 핵 및 핵 구멍 테두리에 얇은 층이 주변 염색질 인터럽트 질소가 풍부한 구조로 볼 수있는 바와 같이, 주변 염색질이 존재한다. 종종 박판 염색질은 주변의 외부 매우 얇은 청색 층으로 볼 수있다. 세포질에서, 인이 풍부 많은 작은 입자 수볼 수. 이들은 외부 핵 크기, 풍부와 위치에 따라 리보솜으로 식별 될 수있다. interchromatin 공간 사이에 위치 염색질 단백질이 풍부한 영역으로 볼 수있다. 이는 원자력기구 및 리보 입자와 리보 과립의 클러스터 (그림 2)와 같은 작은 노란색 신호, 풍부한 지역을 포함한다. 후자는 과립 클러스터 interchromatin 불린다과 특징적도 1b, C 및 D는 유사 분열 염색체, 중심체, 미토콘드리아 및 동원체 같은 다른 공지 된 구조의 모양을 나타내고있다. 전 mRNA의 스 플라이 싱에 필요한 단백질을 농축한다. 도 2에서는, 원료 원소 비율 맵에서 색깔의 복합 이미지를 생성하는 데 사용되는 단계들이 요약되어있다. 인 맵 (녹색) 및 RGB 색 공간 (위쪽 열)에서 질소 맵 (적색) 병합 샘플에서 이들 요소의 양의보다 나은 평가를 허용한다. HoweveR, CYMK 색 공간에서 단백질 맵 (시안) 및 인지도를 병합 (황색)을 수득 질소 맵으로부터 핵산 - 함유 구조물의 기여를 고갈 인 신호를 감산하는 핵 단백질의 더욱 뚜렷한 시각적 표현을 제공한다 비 핵 단백질 (아래쪽 열). 이것은 데이터를보다 쉽게 기술에 익숙 개인에 의해 해석 될 수있다.
MDC1, 53BP1과 Rad52을 표현하는 레이저 microirradiated 세포
인해 레이저 손상 트랙 사용자 정의 크기, 형상 및 위치를, 레이저 microirradiated 세포 DAB 증착 영역 miniSOG 시스템을 사용할 때 TEM에 발견하는 것은 매우 쉽다. 저배율 전송 모드 (즉, 통상의 명 시야 TEM)으로 촬영 한 사진 특성 손상 트랙 공개 및 매립에 앞서 형광 현미경으로 촬영 한 데이터와 비교 될 수있다.상호 현미경 의도가있는 경우 쉽게 식별 및 단일 핵의 재배치를 할 수 있기 때문에 이것은 특히 유용합니다. (그림 2-4).
첫 번째 예 (도 3)를 안정적 MDC1 miniSOG-mCherry U2OS 발현 세포주를 나타낸다. 레이저 microirradiation 실험에서, miniSOG 및 mChrerry 태그를 포함한 MDC1 모집 (데이터는 제시하지 않음)이 단백질 GFP - 태그 버전과 매우 유사 하였다. 세포를 DNA 손상 유도 후 1 시간 고정하고 TEM 용 시료를 조제 MDC1 손상 트랙 용이 (형광 데이터에 매우 잘 대응 핵 걸쳐 어두운 줄무늬 정상 TEM 모드 초박형 섹션에서 확인 된 그림 3-5). 단백질의 분포를 살펴보면, 질소 신호의 명확한 증가가 레이저 손상 부위에서 관찰 될 수있다. 그것은이 주로 중합 diami에 의해 발생하는 것이 여기에서 지적되어야한다 질소 풍부하고 miniSOG의 신호를 증폭 nobenzidine 오히려 전적으로 손상 트랙 복구 단백질의 축적을 통해보다 복구 단백질 태그. 손상 트랙의 구조와 핵의 나머지 부분에서 염색질 구조를 비교하면 분명한 차이를 보여준다. 손상된 염색질 (즉,도 3에 점선 내에 도시 됨)보다 두꺼운 핵질 리지 발생 비 조사 염색질, 달리 나타나는 decondensed. 피해 트랙 내에서 핵산에서 MDC1 - miniSOG 단백질이 풍부하지만 무료입니다 (그림 3 II2, IIB, IIc 형과 같이 진행된 화살표로 강조) 원자력기구 (200-300 nm의)도 관찰 할 수있다. 그것은이 기술없이 염색질없는 구조 이러한 핵 몸을 정의하는 것은 매우 어려운 것입니다. 또한 MDC1의 알려진 생화학 의해 예측되지 않은 손상 부위에 복잡성 수준을 추가로 제시한다.
MDC1 형질 감염된 세포에서, 전술 한 손상과 동일한 조건을 사용하여 작성된 53BP1 (도 4)의 손상 트랙 찾고 ntent는 "> 매우 유사한 결과의 광산화 의해 제작되었다. 신호를 관찰 할 수있다 miniSOG은 붐볐다과 염색질의 주름 사이의 공간을 가득 채웠다. 심하게 스테인드 원자력기구는 (그림 4 D, E, F에서 화살표로 강조 표시)을 관찰 할 수있다.Rad52-GFP 구조체 실험으로부터, Rad52 작은 밝은 microcompartements에게 레이저 - 유도 손상에 따른 트랙 (24)을 형성하는 것으로 알려져있다. 기존의 광 현미경의 해상도 한계로 인해, 그것은 그들이 손상된 DNA에 어떻게 관련되는지 큰 이러한 구조는 정말 어떻게 불분명하고있다. 구조적 Rad52-miniSOG-mCherry 발현 레이저 조사 U2OS 핵의 TEM 이미지를 찾고,이 바디의 크기는 평균 (150-250 ㎚)에있는 것으로 측정되었다. 그것은더욱 놀라운은 ESI 이러한 초점 볼 수 있습니다. 이전 실시 예와 대조적으로, Rad52-miniSOG-mCherry 병소가 손상 선로를 따라 매우 다르게 구성 될 것 및 단백질로 구성하고 그 내부에 검출 가능한 핵산이없는 컴팩트 핵 바디 같은 구조로 나타난다. 우리의 결합 miniSOG 및 ESI 접근 수득 손상된 부위에서, 핵산 / 단백질 관계보고에 기초하여, 우리는 DNA 복구는 병소의 표면이 아닌 내부에서 일어날 수 있음을 시사한다.
5는 결과와 유사한 그림의 낮은 이미지는 3-III도합니다. 손상된 위치에서 염색질은 더욱 비 조사 영역에서 염색질 (적색 대시 윤곽 영역을 참조)에 비해 decondensed 것으로 보인다.
감마선 조사 된 세포
레이저 마이크로 조사 quickl 할 수있는 편리한 도구입니다 동안DNA 병변의 사이트에 모집을위한 형광 태그를 포함 Y 테스트 단백질, 그것은 복잡한 손상 (이중 가닥 나누기, 단일 가닥 나누기, 기본 데미지 및 cyclopyrimidine의 이량 체) (25)의 많은 양을 만듭니다. 보다 직접적으로 DNA 이중 가닥 나누기 주위 형성 구획을 연구하기 위해, 우리는 감마선 조사에 세포를 노출시킴으로써 개별 DSBs 주위 DRFs 형성을 조사 하였다.
안정적으로 53BP1-miniSOG-mCherry을 표현 U2OS 세포는 감마선 조사의 2 Gy의 노출 및 조사 후 반 시간을 고정했다. 핵질에 걸쳐 분산 큰 병소의 특성 패턴 (그림 6Ia)을 관찰 할 수있다. 디아 미노 벤지딘의 광산화 후 mCherry 형광 신호는 형광 현미경에 위치 된 위치에서 부상 흑점은 전자 현미경 사진 (도 6Ib 및 C)에서 볼 수있다. 이들 스폿 이미지를 TEM 상관 될 수도그 (그림 (61D) 및 e) 낮은 배율로 촬영되었다. 직경이 약 1.5 μm의 것으로 보였다 이들 병소의 ESI 이미지는 흥미로운 구조를 보였다. 염색질의 얇은 가닥은 약 두 배 두께의 53BP1 단백질 산재 것 같았다.
다른 실험에서, 세포는 방사선의 더 많은 양에 노출 된 이후 시점 큰 초점을 생성하고 초박형 섹션에서 그 위치를 용이하게하기 위해 (3 시간, 6 시간, 각각 후) (도 7)에 고정. 우리는 별도로 핵 단백질과 단백질을 맵핑 할 수 있기 때문에, ESI는 병소의 구조는 시간이 지남에 따라 재구성 나타나는지 알 수있다. 초점 53BP1 단백질의 상대적 양이 염색질이 더 주변 위치를 취하면서 증가가 나타납니다.
53BP1의 초점도에 표시하기 때문에 과소 복제의 사이트에서 G1 세포에서 "애매 초점"등의 세포를 비 조사D DNA (26, 27)는, 그 초점은 몇 군데 있었다. 이 암호 같은 초점은 방사선에 의한 초점에 단백질 상대적으로 많은 양의 항구 것 같습니다과 염색질의 흥미로운 일반 구조를 보여줍니다.
따라서 miniSOG 방법을 이용하여 DNA 수리 병소 성분을 떠올리 DNA 손상 영역을 식별하고 염색질에 태그 복구 단백질의 상대적 분포를 매핑하도록 돕는다.
ESI 이미지에서 관찰 할 수있다 구조의 그림 1. 개요 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
마우스 배아 섬유 아세포의 (A) ESI 이미지. 염색질 능선 (노란색)는 핵질 (시안) interchromatin 특검팀를 작성하여 둘러싸여있다에이스. 핵은 핵 기공 단지 (시안)에 의해 중단되는 주변 이질 염색질 및 chromocenters (왼쪽)으로 둘러싸여 있습니다. 핵소체는 명확하게 자신의 색으로 구분 될 수있다. 이는 핵산 단백질의 상대적 양이 염색질에보다 높은 핵소체 구조로되어 있기 때문이다. 핵 외부 미토콘드리아 및 (핵산 풍부) 리보솜은 쉽게 식별 될 수있다.
화상의 상부 좌측의 빈 단백질 - 풍부 입자로서 알 수있는 핵 및 중심체 (화살표 참조)의 (B) 이미지.
중기 판을 통해 (C) 크로스 섹션. 고도로 응축 중기 염색체는 왼쪽 하단 모서리에 왼쪽 위 모서리에서 걸쳐 디스크에 정렬했다. 질소의 높은 농도는 일부 염색체의 표면에서 볼 수 있습니다. 이 지역은 kinetochores (화살표 참조)이다.
(위의 행)의 행의 처음 두 이미지 인 및 질소의 비율 맵을 보여준다. 상부 행의 마지막 화상은 RGB 색 공간에서 중첩 이들 원소 맵을 보여준다. 황색 구조 인 및 질소 모두의 존재를 반영 nucleoproteins를 나타낸다. (아래쪽 열)의 첫 번째 그림은 주로 샘플 핵산의 분포를 보여준다 인 맵을 보여준다. 중간 화상은 핵산 고갈 / 음극 STRU의 분포를 도시 ctures. 이것은 질소 맵으로부터 인 맵을 빼서 계산 하였다. 하부 우측 화상은 핵산지도 및 감산 컬러 공간에서 단백질 맵의 머지를 도시한다. 이 색 합성 개별 구조의 식별을 돕기 위해 및 핵 단백질로 분류 또는 핵 단백질하지 표기. 인 및 질소 풍부에 정량적 정보는 그물 인 순 질소 그레이 스케일지도에서 또는 맨 위 행에 같은 첨가제 색상을 사용하여 생성 된 복합 재료에서 시각적으로 수집해야한다. 
ESI 다색 화상의 생성도 2 
안정적으로 MDC1-miniSOG-mCherry을 표현 U2OS 세포의 그림 3. 레이저 마이크로 조사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
IC에서의 녹색 사각형으로 강조 (II) 영역은 확대 정상 전송 모드 (IIA) 및 ESI (IIB)에 나타내었다. IIc의 손상은 트랙의 신호 ESI 화상의 중첩을 도시한다. 손상 트랙 신호는 상향 영상을 임계 화에 의해 수득 하였다.
(III), 레이저 마이크로 구조의 예로레이저 손상 영역 외부 -irradiated 염색질과 염색질.
안정적으로 53BP1-miniSOG-mCherry을 발현하는 세포의 그림 4. 레이저 마이크로 조사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
좌측 컬럼 : (A) 형광 (B) 종래의 TEM과 핵을 조사 같은 마이크로 레이저의 (C) ESI 이미지.
오른쪽 열 : (D) 기존의 TEM, (E) ESI와 (D)의 임계 값에 의해 분할 된 miniSOG 신호와 ESI 이미지 (F) 오버레이 (단계 6.10 참조)
안정적으로 Rad52-miniSOG-mCherry을 표현하고 레이저 마이크로 조사에 의해 손상 그림 5. U2OS 세포주. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
하부 왼쪽 손상 트랙 microirradiated 레이저 U2OS 핵을 나타내는 저 배율 TEM 이미지와 형광 화상의 (A) 오버레이.
레이저 마이크로의 (B) 대표 공 초점 형광 현미경 이미지가 손상 트랙 (적색 신호)를 따라 작은 병소의 특성 패턴을 보여주는 Rad52-miniSOG-mCherry을 표현 훽스트 염색 핵 (파란색)를 조사.
(C) 기존의 TEM, (D) ESI,
전체 핵의 맥락에서, 레이저 - 유도 손상 트랙을 도시 안정적 Rad52-miniSOG-mCherry 발현 다른 U2OS 핵의 (G) ESI 이미지.
그림 안정적으로 53BP1-miniSOG-mCherry을 표현 6. U2OS 세포가 2 Gy를 조사하고 30 분 후 고정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
(I)) 형광 화상 감마선 유도 53BP1 병소를 도시. B) 광중합 후 빛 이미지를 전송된다. C) OV투과광 이미지와 형광의 erlay. D) 낮은 배율 TEM 이미지 (블랙 스트라이프)는 TEM 그리드 바있다. 저배율 TEM 화상과 형광 화상의 예) 오버레이.
정상 TEM 및 ESI 모드에 기록 된 투과광 이미지에 별표 (*)로 표시 (II) 피해 초점. ) 제로 손실, B) ESI, C) 인, D) 단백질 E) 오버레이 ESI와 제로 손실 이미지에서 분할 된 신호.
정상 TEM 및 ESI 모드에 기록 된 형광 이미지의 크로스 표지 (III) 피해 초점. ) 제로 손실, B) ESI, C) 인, D) 단백질 E) 오버레이 ESI와 제로 손실 이미지에서 분할 된 신호.
조사의 서로 다른 시간 후 초점 사이의 초점 구조 그림 7. 변경. < / STRONG> 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
U2OS 53BP1 miniSOG mCherry 세포는 3H (1A-E, FJ) 각각 6H (2A-E, FJ) 후 고정 감마선 조사의 6 Gy를 노출. 3은 애매 초점 (AE)를 보여주는 미 조사 U2OS 53BP1 miniSOG mCherry 핵을 보여줍니다. ESI 사진은 순서 ESI (핵산 및 단백질), 핵산 (혼자), 단백질 (혼자), ESI (핵산 및 단백질)에 제시된 + miniSOG 신호를 분할한다.
산화 오스뮴 포스트 고정을 생략하면 그림 8. DNA 수리 초점은 여전히 기존의 전송 모드에서 볼 수 있습니다. arge.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
산화 오스뮴 처리되지 않은 샘플에서 두 53BP1 병소를 도시 U2OS 핵의 얇은 부분 (50 ㎚). (A) 종래의 TEM 모드에서, 심지어는 대조적 향상없이 DAB 중합체 스테인드 사이트를 참조 할 수있다 중금속 얼룩. (B)의 초점 콘트라스트 상기 (복수의 산란 이벤트로부터의 모든 전자 기원을 얻어 여과) 제로 - 손실 이미지를 취함으로써 향상 될 수있다.
맵핑에 대한 최적 인 에너지 창 설정도 9의 결정
(A) 120 eV의에서 155 eV의에서 포스트 가장자리 인 사전 에지 기록 원소 비율의지도.
내용 "> (B) 원소 비율의지도는 120 eV의에서 175 eV의에서 포스트 가장자리 인 사전 에지 기록했다.(C) 120 eV의 에너지 손실 및 콘트라스트의 최선의 조합을 결정하기 위해 140-200eV 에너지 손실에 이르는 가변 포스트 에지 윈도우에서 일정한 프리 에지 창 인 비율 맵을 계산하는 단계를 포함한다. 같은 인 부자 인 가난한 지역 이상에 걸쳐 라인 스캔에서 가장 밝은의 강도 차이 dimmestpixel 175 eV의 에너지 손실의 후 가장자리 사진이 선정되었다 가장 높은 콘트라스트 값 (동적 범위)를 보여줍니다.
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Discussion
ESI는 특별히 인이 풍부 영역을 매핑 할 수 있기 때문에 핵에서 염색질 및 리보의 여러 가지 상태를 조사하기위한 훌륭한 도구 역할을 할 수 있습니다. 이는 근본적으로 전자 현미경에 의해 얻어진 비특이적 대조 방법에 의존하지 수 상세히의 양을 증대시킨다. ESI 하나의 단점은 동일한 가속 전압에서 TEM 종래보다 얇은 부분을 필요로한다는 것이다. 이것은 직렬 섹션 작업 또는 단층 (28)의 방법을 이용하여 극복 될 수있다.
많은 정보는, 인 및 질소의 분포를보고함으로써 얻어 질 수 있지만, 또한, 특정 단백질의 분포를 매핑 할 수있는 관심사이다. 상기 방법은 본 문서에 소개로, 그것은 ESI는 디아 미노 벤지딘의 부위 특이 적 중합에 기반 방법들과 결합 될 수 있음을 입증 하였다. 이 방법은 쿵푸를 추가하지 않지만ESI에 LL 새로운 색상, 그것은 단백질의 분포를 매핑 명확 유용하다. 이 염색질과 상호 작용하는 단백질에 특히 적용됩니다. 연구는 하나 이상의 단백질 집단을 시각화 할 필요가있는 경우 종래 광산화 (9)에 미리 매립 염색법으로서 적용될 때, immunogold를 사용 라벨링 방법이 여전히 사용될 수있다. 안정한 세포주에 비해 일시적 형질 발현 수준은 셀간에 매우 다양하고, 따라서 하드 태깅 된 단백질의 양을 표현하는 유사한 복수의 셀을 찾을 수 있도록 할 수 있다는 단점이있다. 따라서, 안정적인 세포주의 생성을 권장합니다. 그러나, 형광 촬상을 이용하여 단백질 발현의 상대적인 양을 판단하고 일시적인 형질 다음 중간 식 셀을 선택하는 것이 가능하다.
miniSOG 융합 태그 자체 형광 있지만, 양자 수율은 GFP (0.37 대 0.6) (10)보다 훨씬 더 나쁘다. PURP 들어mCherry 같은 추가 형광 단백질 태그를 추가 상호 현미경의 OSE는 miniSOG 여기 발생 일 중항 산소의 생산을하지 않고 살아있는 세포 이미징을 할 수 있습니다. miniSOG 표지 된 단백질의 발현 수준은 DAB - 함유 버퍼 내의 산소의 양, 및 pH는 또한 광 - 산화 속도에 영향을 미칠 수있다. 때로는 때문에 광산화 반응의 광 의존성의 관심 영역에서 균질 광산화를 달성하기 상당히 문제가 될 수있다. 장기간 광산화 비특이적 염색 및 ESI에 의해 소자 별 신호의 검출을 복잡하게 샘플 너무 무거운 금속의 침착으로 이어질 수있다. 광산화 과정은되도록 보통 커버 슬립에 세포를 포함하는 몇 가지 매우 작은 영역은 일반적으로 염색 상당히 소모 시간이다.
우리는 miniSOG의 조합이 부착 후진타오 단층을 사용하여 ESI와 단백질에 태그를 보여 주었다인간 암 세포주. 원칙적으로, 상기 방법은 또한 그것이 miniSOG 태그가 합리적인 수준의 단백질만큼 투명성 및 산소의 확산을 표현하는 것이 가능하고 DAB 그대로 다른 샘플 (효모, 박테리아, 조직, 태아)에 적용될 수있다 적절한 광산화 따라서 균질 염색을 허용하기에 충분히 높다. 현탁 세포를 들면, 폴리 -L- 리신으로 접착제를 사용하여 커버 슬립에서 셀의 위치를 고정하는 것이 유리하다. 두꺼운 샘플의 경우, 낮은 개구와 목표는보다 균일 한 조명을 달성 할 수 있지만, 사진 산화 오래 걸립니다.
. 산화 오스뮴의 사용을 포함하여 - 우리는 가능한 의해 슈 (10) 등 출판 원래 프로토콜에 가깝게 miniSOG 태깅 된 융합 단백질의 사용을 제시 하였다. 거기 떨어져 우선적으로 DAB-폴리머 막에 침착, 산화 오스뮴은 어떤 반응을 보여주고 있음을 관찰 할 수 있으며,시료의 생물학적 물질 (10 그림 3)의 대부분 증착. 산화 오스뮴은 45 eV의에서 원소 우위를 가지고있다. 이 신호와 그 플라즈몬은 시료를 통과하는 동안 다수의 에너지 손실 이벤트를 거쳐 시료 증가 및 단일 전자의 두께와 전자 에너지 손실 스펙트럼에 중첩 될 수있다. OSO 4 높은 농도 시료 제조에 사용되는 경우에, 인 원소 맵의 품질을 제한 할 수있다. 이전 10를 사용한 것보다 상당히 낮다 여기서 우리가 사용한 농도는, 양질 인 맵의 생성을 허용했다. 사용하여 실험에서 miniSOG 높은 OSO 4 농도를 요구 단백질 태그, 여전히 좋은 인 맵을 생성 할 수 있습니다 최고 농도는 경험적으로 결정되어야 할 것이다.
우리는 DNA 복구에 초점에 형성 DAB 폴리머는 sufficie 것으로 나타났습니다산화 오스뮴으로 사후 고정 생략하더라도 (더 나은 콘트라스트 제로 손실 모드) ntly 종래 TEM 모드에서 볼 수 조밀 (도 8 참조). 이러한 방식으로 기록 된 신호의 분할은 오스뮴 처리 한 샘플을 사용하는 것과 같은 강력한이었다. 가시화되어야하는 핵 단백질에 따라서는 형성하는 구조의 크기 및 막 시스템을 시각화 할 필요성은, 산화 오스뮴의 사용은 필요하지 않을 수도 그 생략 인의 원소 서명 마스킹의 가능성을 제거한다.
ESI 18,29,30 출판물 사용에 비해 우리는 노이즈의 적은 양으로 원소 비율 맵을 생성하기 위해 전후 에지 이미지에 대해 다른 설정을 사용했다. 우리는 실험적으로 원고로 표시 설정을 결정했다 (도 9 참조). 가장자리 주위에 선택한 설정은 ELE를 해결하기 위해 연결되어야합니다모음 윈도우 않는 정신지도 샘플에 존재하는 다른 요소들과 중첩된다. 우리의 경우, 황 등의 요소가 될 수있다. (아미노산 메티오닌 및 시스테인 발생) 황 농도가 매우 낮고, 단지 무시할만한 양으로 계산 된 맵에 기여하기 때문에, 우리는 단점 능가 여기에 사용되는 설정을 사용하여 얻어지는보다 S / N 비를 생각 그 샘플에서 황의 흔적에서 발생할 수 있습니다.
우리는 ESI와 TEM 기술과 결합 된 DNA 복구 단백질 MDC1, 53BP1과 Rad52를 사용하여 나노 미터 해상도에서 DRFs의 미세 구조를 한 것으로 밝혀졌습니다. 염색질 및 개별 DSB 수리 단백질 현지화의 조직은이 방법을 사용하여 해결되었습니다. 염색질 리지 사이의 공간을 채우기 위해 마이크로 레이저 조사 DNA 수리 단백질의 경향에 따라 DNA 병변이 풍부한 도메인에서의 지역화 도시 하였다. Rad52의 경우, PLA에서YS 상동 재조합의 역할은, 레이저 손상 핵 트랙을 따라 본체의 구면 형상 구조의 형성이 관찰 될 수 있고, 이는 다른 두 시험 단백질에 대비했다. 손상이 감마선 조사에 의해인가되는 경우, 53BP1 손상된 염색질 주위 병소 형성. 초점에서 염색질 단백질의 상대적 구성과 위치가 시간에 따라 변화하는 것 같다. 이들 단백질 및 염색질의 조직 손상 염색질뿐만 아니라 변화와 핵 바디의 조성 간의 관계는 모든 쉽게 직접 이들 특성을 평가할 수없는 등의 조영제를 우라늄을 사용하고 리드 종래 시야 현미경 반면 ESI 기술을 사용하여 얻을 수있다. 따라서,이 기술은 특히 DNA에 작용하는 프로세스에 대한 구조 - 기능 관계의 연구에 대한 높은 가능성을 나타낸다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Gridded 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-2-14-CGRD | not made for immersion objectives |
| LR White: acryl resin | emsdiasum | 14381 | |
| LR White accelerator | emsdiasum | 14385 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets | Sigma | D5905 | |
| Slim Bar Grids 300 Mesh | SPI | 1161123 | |
| Tungsten-Point Lab Pen | emsdiasum | 41148 | |
| Osmium Tetroxide | emsdiasum | 19100 | |
| Carbon Coater 208 carbon | Cressington | ||
| Ultra microtome Leica EM UC6 | Leica | ||
| Photoshop CS5 | Adobe | might even work with older versions | |
| Digital Micrograph V.2.30 | Gatan | might even work with older versions | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H-1399 | |
| Effectene | Quiagen | ||
| MiniSOG-Constructs | Tsien-Lab | tsienlab@yahoo.com | |
| MDC1 miniSOG mCherry | |||
| 53BP1 miniSOG mCherry | |||
| Rad52 miniSOG mCherry | |||
| cesium 137 radiation source "MARK 1" | (J.L. Shepherd & Associated) | ||
| ImageJ/FiJi | open source | http://fiji.sc/Fiji | |
| 2 ml Eppendorf tubes | Fisherbrand | 05-408-146 | |
| Diamond Knife ultra 35° | Diatome | ||
| Trimming Knife ultratrim | Diatome | ||
| Sodium cacodylate trihydrate | emsdiasum | 12300 | Caution Toxic! |
| Glutaraldehyde EM Grade 8% | emsdiasum | 16020 | Caution Toxic! |
| Sodium phosphate dibasic | emsdiasum | 21180 | |
| Sodium phosphate monobasic | emsdiasum | 21190 | |
| Paraformaldehyde | emsdiasum | 19202 | |
| Osmium tetroxide 4% solution | emsdiasum | 19150 | |
| Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Hydrochloric Acid | Fisherbrand | A142-212 | |
| Sodium Hydroxide Solution 10M | Fluka | 72068 | |
| Oxygen | Medigas | ||
| 3-Amino-1,2,4-triazole | Sigma | A8056 | |
| Potassium cyanide | Sigma | 207810 | Caution Toxic! |
| Ethanol | emsdiasum | 15058 | Caution Toxic! |
| Razor blade Single Edge Carbon Steel | emsdiasum | 71960 | Caution Sharp! |
| DMEM | Sigma | D 5546 | |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | |
| G418 | Life Technologies | 11811-023 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Transmission Electron Microscope 200 kV | JEOL | 2100 | |
| GIF Tridiem 863 Energy filter | Gatan |
References
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).
- Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. Stoichiometric analysis of protein- and nucleic acid-based structures in the cell nucleus. Micron (Oxford, England: 1993). 30, 151-157 (1999).
- Michael J Hendzel, F. M. B., Bazett-Jones, D. P. Direct Visualization of a Protein Nuclear Architecture. Molecular biology of the cell. 10, 2051 (1999).
- Ottensmeyer, F. P., Andrew, J. W. High-resolution microanalysis of biological specimens by electron energy loss spectroscopy and by electron spectroscopic imaging. Journal of ultrastructure research. 72, 336-348 (1980).
- Leapman, R. D., Ornberg, R. L. Quantitative electron energy loss spectroscopy in biology. Ultramicroscopy. 24, 251-268 (1988).
- Simon, G. T. Electron spectroscopic imaging. Ultrastructural pathology. 11, 705-710 (1987).
- Egerton, R. Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , Springer. (2011).
- Aronova, M. A., Kim, Y. C., Zhang, G., Leapman, R. D. Quantification and thickness correction of EFTEM phosphorus maps. Ultramicroscopy. 107, 232-244 (2007).
- Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. Chimeric molecules employing horseradish peroxidase as reporter enzyme for protein localization in the electron microscope. Methods in enzymology. 327, 35-45 (2000).
- Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS biology. 9, e1001041 (2011).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science (New York, NY). 296, 503-507 (2002).
- Fernandez-Capetillo, O., Celeste, A., Nussenzweig, A. Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors. Cell cycle (Georgetown, Tex). 2, 426-427 (2003).
- Haaf, T., Golub, E. I., Reddy, G., Radding, C. M., Ward, D. C. Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 2298-2302 (1995).
- Maser, R. S., Monsen, K. J., Nelms, B. E., Petrini, J. H. hMre11 and hRad50 nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 17, 6087-6096 (1997).
- Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA repair. 9, 1219-1228 (2010).
- Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. Journal of cell science. 125, 3529-3534 (2012).
- Dellaire, G., Kepkay, R., Bazett-Jones, D. P. High resolution imaging of changes in the structure and spatial organization of chromatin, gamma-H2A.X and the MRN complex within etoposide-induced DNA repair foci. Cell cycle (Georgetown, Tex). 8, 3750-3769 (2009).
- Kruhlak, M. J., et al. Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks. The Journal of Cell Biology. 172, 823-834 (2006).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor protocols. 2010, (2010).
- Zeyda, M., Borth, N., Kunert, R., Katinger, H. Optimization of sorting conditions for the selection of stable, high-producing mammalian cell lines. Biotechnology progress. 15, 953-957 (1999).
- Dellaire, G., Nisman, R., Bazett-Jones, D. P. Correlative light and electron spectroscopic imaging of chromatin in situ. Methods in enzymology. , 375-456 (2004).
- Campbell, S., Ismail, I. H., Young, L. C., Poirier, G. G., Hendzel, M. J. Polycomb repressive complex 2 contributes to DNA double-strand break repair. Cell cycle. 12, 2675-2683 (2013).
- Mortusewicz, O., et al. Recruitment of RNA polymerase II cofactor PC4 to DNA damage sites. J Cell Biol. 183, 769-776 (2008).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173, 195-206 (2006).
- Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Frontiers in genetics. 4, 135 (2013).
- Lukas, C., et al. 53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress. Nature. 13, 243-253 (2011).
- Harrigan, J. A., et al. Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells. The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).
- Aronova, M. A., et al. Reprint of 'Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST). J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).
- Fussner, E., et al. Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming. The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).
- Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin. Cell cycle. 10, Georgetown, Tex. 308-322 (2011).
