Abstract
光学分解能透過型電子顕微鏡における特定のタンパク質の集団を同定する課題には限界が細胞生物学における障害となっています。多くの現象は、簡略化システムインビトロ分析により説明と完全に理解されるために、特に1nmから0.1μmの間の範囲内で、 その場で追加の構造情報を必要とすることはできません。ここで、電子分光イメージング、タンパク質および核酸の分布の同時マッピングを可能にする、透過電子顕微鏡法、および発現タグ、miniSOGは、DNA二本鎖切断修復巣の構造と組織を研究するために組み合わされます。
Introduction
近年1以上の光学顕微鏡の大幅な進歩にもかかわらず、細胞生物学者は、まだ解像度のギャップに苦しんでいます。これは、巨大分子複合体の協調相互作用を伴う基本的な細胞プロセスにおける構造と機能の関係の理解を制限する（例えば、クロマチンリモデリング、DNA修復、RNA転写およびDNA複製で）。透過電子顕微鏡（TEM）は、必要な分解能を提供だが、それはまた、視覚化構造の生化学的組成を決定することができる一方で、特定のタンパク質を標識するために、構造的にできないので、これらのプロセスを定義するために挑戦してきました。核構造を区別するのに役立つ内部の膜が存在しない場合には、核が特に困難となっています。電子分光イメージング（ESI）は、DNA、RNA、およびPROTの同時検出および区別を可能にすることにより、これらの制限のいくつかを解決しますEINベースの核構造2-5。
電子分光イメージング。
電子顕微鏡での高感度と分解能で元素の分布をマッピングするためには、非弾性的に試料6の要素の内殻電子との相互作用を介して散乱された電子を選択画像分光計を使用することができます。エネルギーの要素固有の量が試料中の原子のイオン化の結果として失われるので、これらの電子は、電子顕微鏡に取り付けられた分光計を用いて分離し、可視化することができます。このように、試料と相互作用した電子のスペクトルの分析は、 試料 7の元素組成に関する定性的および定量的情報を明らかにする。試料を通過する際にエネルギーを失わない電子は、電子エネルギー損失の「ゼロ損失ピーク」に見出されますスペクトル。これらの電子の存在量は、試料の質量、密度および厚さに関係し、試料に衝突または試料を通過する間にエネルギーを失うことなく、試料を通過する電子から構成されています。この情報は、試料8中に存在する特定の元素の原子数の絶対的な定量化のために有用であり得ます。
生物学的サンプルは不十分TEMの入射ビーム中の電子を偏向する光素子の大部分から構成されているため、重金属塩を使用する染色方法は、試料のコントラストを生成するために適用されなければなりません。これらの造影剤の多くの特異性および特異性が可能な複数の染色を可視化することができないことがないことは、核の研究において、従来の電子顕微鏡の値を制限しています。 ESIは、特に細胞核の構造の研究のために、従来のTEMを超える大きな利点を持っています。これは、タンパク質複合体の核タンパク質複合体を区別するために、および核酸のそれらの濃度に基づいて、種々の核タンパク質複合体を解決するためのDNA-及びRNAを含む高分子複合体のリンが豊富な性質を利用することが可能です。残りの生物学的物質は、窒素の存在量に基づいて画像化することができます。異なる解剖学的構造内のマッピングだけでこの2つの要素とそれらの分布と相対量の分析は、核に関する多くの情報を提供してくれます。例えば、それは、クロマチンとリン存在量を示すマップでリボソームを同定することは容易です。 interchromatin空間、核膜孔複合体、および核小体は、一方で、簡単に窒素マップ画像で検出することができます。
ミニ一重項酸素発生システム（miniSOG）
それが取るので、ESIは、 その場でのクロマチン構造で勉強するための強力な技術を表していますリンと窒素の元素組成における特性の比の利点は、元素組成は、通常、タンパク質複合体の異なる集団の間で区別するために使用することができません。ナノメートル範囲の小さな金粒子で標識された抗体は、広く、個々の分子の位置をマッピングするために使用されてきました。金粒子は、通常、二次抗体に結合しているので、一次抗体によって検出されるエピトープの周囲に約20nmの円周内に表示されます。埋め込み後の試料では、抗体は、セクションの表面に露出されるエピトープを検出することができます。それは、抗原の存在を証明し、細胞の特定の解剖学的構造に関連することが可能であるがエピトープの大部分が樹脂によって覆い隠されているので、得られた情報は、不完全です。全体を通して、抗原へのアクセスを許可し、蛍光顕微鏡検査のために使用されるものと同様のプロトコルを使用する技術を、事前に埋め込みサンプルの全体の深さが、典型的には脂質膜の除去を必要とアルデヒドで固定することができない成分を除去する抗体が細胞に侵入することを可能にするために必要とされる透過化のステップ。また、超微細構造の保存のための好適なアルデヒド固定液、グルタルアルデヒドは、一般的にエピトープを破壊し、その結果、パラホルムアルデヒドは、一般的に必要とされます。これは、タンパク質 - タンパク質架橋にあまり効果的です。金ナノ粒子で標識された抗体の別の欠点は、金が弱いコントラストを有するサンプルの興味深い構造の詳細を隠すことができ、強いコントラストを作成し、非常に電子密度の高い材料であることです。
発現したタンパク質タグとして緑色蛍光タンパク質（GFP）の出現は、細胞生物学の質問に答えるために、蛍光顕微鏡の使用を変えてきました。小さ な蛍光ドメインを有するタンパク質をタグ付けすることは、生体内でその分布のマッピングを可能にしますセル 9の細胞質ゾルに触媒活性ではありません。その解像度はナノゴールド法10よりも悪いようにHRPの反応生成物も生成部位から離れて拡散することができます。これらの問題を回避するために、フラッシュ/ ReAsHシステムが11を開発しました。これは、テトラシステインモチーフを保有する組換え融合タンパク質で構成されています。このモチーフは、との結合ができますbiarsenic蛍光団。励起されると、結合したFlashやReAsHは、標識タンパク質の現場ですぐに沈殿するポリマーへの反応性の高い一重項酸素を生成するので、photoconvertジアミノベンジジン（DAB）することができます。 DABポリマーは、電子密度で四酸化オスミウムで染色することができ、TEMでの組換え融合タンパク質の分布をマッピングするために使用することができます。
2011年には、シュウら 10は、蛍光灯や448 nmの青色光で励起されたとき、多くの一重項酸素ラジカルを生成することが可能であるシロイヌナズナのフラビンタンパク質由来の小さな106アミノ酸の融合タグで構成されていminiSOGシステムを発表しました。それらの一重項酸素ラジカルは11免疫標識された抗体よりもかなり近いタグタンパク質の表面に近くポリマーを形成する光酸化ジアミノベンジジンを使用することができます。フラッシュ/ ReAsHシステムは、フルオロをもたらす必要があるがクロムと光変換を行う前に、細胞へのジアミノベンジジン、miniSOGシステムのみジアミノベンジジン、光を必要とし、加えて、ジアミノベンジジンを重合で約2倍の効果があります。ここで、miniSOGはDNA修復フォーカスの超微細構造をマッピングするために、ESIと組み合わせて使用されます。
DNA修復巣（DRF）
彼らは転座と遺伝情報の損失につながることができますので、未修復のDNA二本鎖切断は、細胞への深刻な脅威をもたらします。今度は、これが老化、癌、及び細胞死をもたらすことができます。 DNA二本鎖切断修復に関与している多くのタンパク質は、DNA二本鎖切断12-14の周りに組み立てる病巣に蓄積します。それらの機能は不明であるが、それらは、DNA二本鎖切断を含み、DNA二本鎖切断修復の部位である、核内の部位を表します。
DNA修復FOC私（DRF）は、蛍光顕微鏡によって特徴付けられており、それらはDNA損傷12,15のためのバイオマーカーとして役立ちます。これらは、二本鎖切断のサイズに大量の相対的であり、最近の超解像顕微鏡研究は、それぞれ16を集中内の分子のサブ区画のいくつかの証拠を明らかにまで比較的均質と考えられました。これらの部位は組織化されている方法を理解するために、互いに対して基礎となる生物学的構造のすべてを可視化することが必要です。これは、蛍光顕微鏡検査によって達成さが、電子顕微鏡17,18を介して可能であることはできません。ここでは、この方法は、DNA二本鎖切断修復の超微細構造を探索するために、この組み合わせアプローチの可能性を示すためにminiSOG法により電子分光イメージングを組み合わせることが記載されています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
miniSOG細胞株の1世代
- 5％CO 2の加湿インキュベーター中、37℃で、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充した低グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の2 mlを含む35 mmディッシュにU2OS（ヒト骨肉腫）細胞を増殖させます雰囲気。
- 彼らはminiSOGとmCherryをのための配列を含むプラスミド構築物をトランスフェクション試薬19の製造業者のプロトコルに従って修復タンパク質をタグ付けされた精製されたトランスフェクションの質（A269 / 280比1.8〜2.0）でリポフェクション80％コンフルエントである場合には細胞をトランスフェクション。 miniSOG発現プラスミドは、ツィン・ラボから注文することができます。http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
- ソート蛍光活性化細胞によってminiSOGとmCherryをタグで組換えタンパク質を発現する細胞は、2日後にトランスフェクションをソートします。細胞を回収20を過剰発現している細胞を回避するために、中間蛍光強度を持ちます。
- 培養10％FBSおよび選択剤G418（ジェネティシン）0.6 / mlのが補充されるDMEM培地10ml中で10cmのディッシュ上の陽性細胞。
- 目に見えるコロニーがプレート上に出現した後、mCherryを陽性コロニーのための画面が倒立蛍光顕微鏡を使用して、恒久的なマーカーで（プレートの底部に）自分の周りの円を描きます。低倍率の空気対物レンズ（例えば、10倍）を使用して、慎重にコロニーを掻き、ゆっくりと滅菌千μlのピペットチップにそれらを吸引することにより、無菌技術を使用してクローンを選択します。
- 選択したコロニーを展開し、10％のジメチルスルホキシドを補っステップ1.1で説明した成長培地を用いて、それらの一部を下に凍結。無菌の18×18 mm 2のカバースリップ上に成長しており、それらを暴露することによってDRF形成のための細胞をテスト放射線の2 Gyの。安定miniSOG mCherryをを発現して照射された細胞は、mCherryをを画像化するためのフィルタが設定され使用して蛍光顕微鏡で可視化したときに修復タンパク質は、DSBは典型的な焦点パターン特性を示さなければならないタグ付け。
2.細胞培養
- 安定miniSOGとmCherryをを表現する文化U2OS細胞は、ステップ1.1に概説された条件の下で修復タンパク質をタグ付け。 2mlのDMEMを含む35ミリメートル直径のガラスボトムディッシュに80％コンフルエントに細胞を増殖させます。プラスチックや使用されるプラスチックにカバースリップを添付接着剤が使用される樹脂の水溶液とアルコール溶液に耐性と耐性であることを確認してください！
- 実験を行う前に、関心領域を識別するために、蛍光顕微鏡を用いて滅菌ダイヤモンドペンを用いてスクラッチすることにより異所性タンパク質を発現する細胞を含む約1mm 2の小領域の輪郭を描きます。あるいは、ガラス底皿tを使用帽子はカバーガラスに内蔵されたプリエッチングされたグリッドシステムとカバーガラスが含まれています。
注：ESIおよび蛍光顕微鏡写真21を組み合わせ 、高品質な相関顕微鏡を使用している場合は、カバーガラスの厚さは、油浸対物レンズとの互換性があることを確認してください。これは、厚さ1.5号（0.16〜0.18ミリメートル）を持っている必要があります。領域は、エッジ付近で発生する可能性がある樹脂の重合の問題を回避するために、TEMで検査するために皿の中央に近いエリアを選択してください（ポイント4.10から4.13を参照）。
3. DNA損傷誘導
- 、ガンマ線を用いて細胞を照射放射線様薬剤を使用するか、（18,22または 23に記載されているように、 例えば ）共焦点顕微鏡にレーザーマイクロ照射による損傷を誘発。
- この例では、405nmのゾルを用いたセシウム137線源またはレーザmicroirradiateでガンマ線照射の2及び6 Gyを用いて細胞を照射します0.5 / mlのヘキストで20分間細胞を感作した後、共焦点顕微鏡のid固体レーザ。
4.サンプル調製
- 0.1Mのカコジル酸ナトリウム緩衝液中または暗所で室温で30分間、0.1 Mリン酸緩衝液pH 7.4中の4％パラホルムアルデヒド注意1mlで細胞を固定してください。
注意：パラホルムアルデヒドとカコジル酸ナトリウムは有毒です！手袋を着用し、適切に有害物質を廃棄してください。 - 4ミリリットルの0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液pH 7.4のリン酸緩衝液pH 7.4で細胞を2回洗浄します。
- 2ミリリットルの50mMグリシンで固定した細胞を治療、5 mMのアミノトリアゾールと30分間、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液または0.1 Mリン酸緩衝液（pH 7.4）中の10mMシアン化カリウムの注意（pH値をチェック！）未ブロックするために、アルデヒド基とは、バックグラウンドを増加させることができ、ヘム基によって生成された活性酸素種を抑制する。
注意：シアン化カリウムは非常に有毒です！ W耳の手袋は、ボンネットの下で働くと十分に有害物質を廃棄してください。それはpHが検証され、正確であることが重要であるので、反応は、pHに非常に敏感です。 - 相関顕微鏡法が所望される場合、倒立蛍光顕微鏡上で2Dまたは3Dのステップ2.2で選択された領域を記録します。
- 2ミリリットルのマイクロチューブに10 mgのジアミノベンジジン塩酸塩錠を配置することによって、1 mg / mlのジアミノベンジジン塩酸注意溶液を調製します。蒸留H濃塩酸（11.65 M）の2 Oおよび20μlの980μlを添加し、溶液が淡褐色半透明になるまで混ぜます。 7.0と7.6の間のpHに水酸化ナトリウムでpHを調整しながらの1mg / mlの最終濃度になるように0.1 Mリン酸または0.1Mのカコジル酸ナトリウム緩衝液中にこの溶液を希釈液（pH 7.4を推奨）。
注意：ジアミノベンジジンが有毒です！手袋を着用し、適切に有害物質を廃棄してください。 - 光酸化のために、Replace、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液またはリン酸緩衝液中1 mg / mlのジアミノベンジジン塩酸溶液2 mlのバッファー。光からこの溶液を保護し、酸素の溶解度を増加させるために4 O Cに氷上で冷却します。 （溶液中に挿入し、酸素ボンベに接続されたホースを使用）溶液に酸素をバブリングすることによって酸素を含む溶液を飽和。再びのpHを確認し、必要に応じて調整してください。
注：これは、pHが7.0およびpH 7.6の間であることを光酸化反応のために非常に重要です。 - 慎重に40倍油浸対物レンズを備えた倒立蛍光顕微鏡上に固定された細胞を用いた料理をマウントして、関心のある領域に移動します。 GFPまたはCFPのためのフィルターキューブを使用して青色光とminiSOGタグエキサイト。 MiniSOGは473 nmの10で肩を448 nmで励起最大値を有します。
- でも緑miniSOG蛍光ヘクタール後に照明を続行完全に消失し、重合ジアミノベンジジンの茶色の光酸化物は、透過光路に出てくるまでです。酸化生成物は、細胞の大部分に表示されている場合には、光酸化を停止するために、蛍光照明をオフにします。
注：光酸化は、対物レンズ、フィルタ透過波長と効率、および照明源に応じて数分かかることがあります。 - Postfixの0.1 Mカコジル酸ナトリウムのpH7.4の緩衝液または30分間、リン酸緩衝液pH7.4中の2％グルタルアルデヒドの1 mlの細胞。
- 0.1Mのカコジル酸ナトリウム緩衝液pH 7.4または0.1でMリン酸緩衝液pH 7.4で20分間0.1％-0.5％の四酸化オスミウムを用いて細胞の膜を修正。
注：これは、膜を安定化するために必要な四酸化オスミウムの可能な限り低い濃度を使用することをお勧めします。重合DAB沈殿物はESI、強いによって直接検出することができ、窒素の高い密度を有するためオスミウム染色はminiSOGタグ化タンパク質を識別し、ESIにとって有害であるかもしれない必要はありません。四酸化オスミウムは毒性が非常に強いです！ヒュームフードで作業し、適切に有害廃棄物を処分します。 - 30％、50％、70％、90％、98％、100％エタノールステップ（各5分）を用いて、エタノールシリーズを通して、細胞を脱水します。その後、1で細胞をインキュベートする：100％エタノールおよびアクリル樹脂（LRホワイト）の1ミックス100に少なくともさらに4時間、細胞をインキュベートする前に、細胞への浸透を容易にするために4時間シェーカー上に皿を置き％アクリル樹脂（LRホワイト）。
- 樹脂を重合させるためには、カミソリの刃とコートアクリル樹脂アクセラレータとの縁で標識した2ミリリットルのマイクロチューブの蓋を遮断。アクセラレータだけ縁をカバーし、チューブ内に流れないことを確認してください。その後、慎重にパスツールピペットを用いて、LRホワイト樹脂で約2/3のチューブを埋めます。樹脂が接触ウィットに入らないように注意してくださいHリムの加速器！
- 皿に細胞を浸透させた樹脂を外し、チューブの幅はほぼ完全に皿のガラス覆われた観察窓をいっぱいにするように直立マイクロチューブの上に逆さに皿を置きます。
- その後、チューブとカバーガラスを密閉チューブ内の樹脂は、現在のセルを覆うようにチューブを反転させる加速器のために1〜2分待ってください。
- 60℃のオーブンの中にチューブでシャーレを置き、12時間のためにそれを治します。
- ブロックが硬化されると、オーブンから添付樹脂充填マイクロチューブでシャーレを削除し、皿からマイクロチューブを分離します。液体窒素と熱水中で凍結融解サイクルによる分離を促進します。
- ガラスボトムディッシュを捨て、慎重にブロックを除去するために、かみそりの刃でマイクロチューブを切断してオープン。
- 永久的なマーカーでブロックにラベルを付けます。
- トライにカミソリの刃を使用します以前にダイヤモンドやタングステンペンでマークされた領域が含まれています（または目的の細胞の領域が含まれています）1ミリメートル2地域が、何も残らないようにブロックをm個。
- 、ウルトラミクロトームでブロックをマウントトリミングナイフでブロックをトリミングし、ダイヤモンドナイフを用いて、約50nmの超薄切片を切りました。
- 高透過300メッシュのグリッド上のセクションをピックアップ。これらのグリッドは非常に小さいグリッドバーを持っているので、興味のある領域での少ないセルをカバー。
- コート炭素の約0.2〜0.4ナノメートルとグリッド上のセクションでは、TEMの電子ビームの下でそれらの安定化を助けるためにカーボンコーターを用いて。
5.電子顕微鏡
- エネルギーフィルタを装備していたTEMにグリッドをロードします。製造者の指示に従って顕微鏡及びエネルギーフィルタをチューニングした後、低倍率モード（通常伝送）のセクション上の細胞を検査し、比較しますそれら（ステップ4.4で得られた）ときに適切なデータを蛍光します。
- 興味深い機能（DNA損傷トラックまたはDNA修復フォーカス）と核が発見されると、エネルギーフィルタリングモードに切り替えて、厚さマップを記録します。
注：この手順は、ゼロ損失とフィルタ処理されていない画像の記録が含まれています。 0.3までの厚さはフリーパス（入射ビームの電子の30％は、試料によって散乱されます）は、良好な元素マップを生成するのに十分薄いことを意味します。 - 使用顕微鏡のエネルギーフィルタを制御するソフトウェアを使用して、要素のリンと窒素のレコード比マップ。また、20 eVでのスリット幅と、120 eVのエネルギー損失で20 eVのプリエッジ画像のスリット幅を175 eVのエネルギー損失でリン地図ポストエッジ画像を記録します。窒素マップ、また、35 eVでのスリット幅を有する358 eVでの35 eVのプリエッジ画像のスリット幅を有する447 eVのに記録後エッジ画像については。
注：画像形成された要素の内容以来（ホスホオルス及び窒素）が（約1％）、より良い信号対雑音比を有する画像を生成するために、「3ウィンドウ法」上の「比画像」（定性元素マップ）（元素マップを定量化）を選択し、相対的に低いです。
6.画像処理
- （例えば、デジタル顕微鏡写真）を取得写真のファイル形式を扱うことができる画像処理ソフトウェアに元素比マップを開きます。マップを重ね合わと揃えた後、RGB画像のグリーンチャンネルに赤チャネルへの窒素マップとリンマップをコピーします。
- タグ付き画像ファイル形式（TIFF）ファイルとして合成画像をエクスポートします。 層 （例えば、フォトショップ）を使用することができ、画像処理ソフトで画像を開きます。
- 8ビット・データ・セット（0〜255）に画像内の最小値および最大値を再スケーリングすることにより、各チャネルのダイナミックレンジを調整します。
- 使用した窒素マップ（のリン含有量を差し引きますタンパク質の分布を示す定性マップを生成するために「レイヤー」ウィンドウ）。
- 「インデックスカラー」に、前のステップで作成した核酸（リン）のマップとタンパク質（窒素）を変換した核酸分布を示すマップのCMYK色空間とシアンルックアップテーブルに黄色のルックアップテーブルを作成します非核地図を表示します。色は、二つの要素間の最大コントラストマップを生成するように選択されます。
- 新しいイメージを作成し、異なる層としてリンとタンパク質の分布を示すマップをインポートします。お互いに重畳された両方の層を表示するには「スクリーン」透明度モードを使用してください。
- ステップ5.2で取得したゼロ損失画像を開きます。この画像は、従来のTEM像のように見えるだけで、試料に衝突することなく、試料を透過した電子を含んで記録された領域の画像を表しています。エクスポートTIFF画像としてこの画像。
- フォトエディタでエクスポートゼロ損失の画像を開き、元素マップを示す画像の最上層にコピーします。 「スクリーン」透明度モードを使用して画像の位置を合わせます。
- 必要に応じて、閾値セグメントにゼロ損失画像miniSOGに由来する信号。上記のように別の層として得られる画像を追加します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ESI
従来のTEM像と核（ 図1）のESIの画像を比較すると（例えば、 図7-1）を容易に識別することができる解剖学的構造の劇的な増加を明らかにしています。クロマチンリッジは黄色で表示され、それがマウス細胞中でchromocentersを識別することは非常に簡単です。予め組み立てられたリボソームは既にリンが豊富でRNAに加えて、窒素に富んでいるタンパク質を大量に含むので、核小体が容易に、そのラウンドの構造と異なる色でクロマチンと区別することができます。周辺クロマチンは、核の境界線上に薄い層として存在し、核膜孔は、周辺のクロマチンを中断窒素リッチな構造と見ることができます。多くの場合、ラミナは、周辺クロマチンの外側に非常に薄い青色層と見ることができます。細胞質中のリン缶が豊富で、多くの小さな粒子見られます。これらは、核外にそれらのサイズ、量および位置に基づいてリボソームとして同定することができます。 interchromatin空間は、クロマチンとの間に位置するタンパク質の豊富な領域とみなすことができます。これは、リボ核タンパク質粒子およびリボ核顆粒のクラスタなどの小さな黄色信号、（ 図2）の豊富な核小体と地域が含まれています。後者は、顆粒クラスタinterchromatinと呼ばれ、特徴プレmRNAスプライシングに必要なタンパク質で富化されている。 図1B、C及びDは、有糸分裂染色体、中心体、ミトコンドリアおよびセントロメアのような他の公知の構造の外観を示す図です。 図2では 、原料元素比マップから着色された合成画像を生成するために使用されるステップを要約します。リンマップ（緑）、RGB色空間内の窒素マップ（赤）（上段）をマージする、試料中のこれらの元素の量をよりよく評価することを可能にします。 HoweveR、CYMK色空間におけるタンパク質マップ（シアン）、リンマップとマージ（黄色）を得窒素マップから核酸含有構造の寄与を枯渇させるためにリン信号を減算する核タンパク質のより明確な視覚的表現を提供します非核タンパク質（下段）。これは、データがより簡単に技術に慣れていない人によって解釈することができます。
MDC1、53BP1とRAD52を発現しているレーザーmicroirradiated細胞
これによりレーザー損傷トラックのユーザ定義のサイズ、形状及び位置に、レーザーmicroirradiated細胞中のDAB沈着の領域がminiSOGシステムを使用する際に、TEMで見つけるのは非常に簡単です。低倍率の伝送モード（ すなわち 、従来の明視野TEM）で撮影した画像は、特徴的なダメージトラックを明らかにし、埋め込 みの前に、蛍光顕微鏡を用いて記録されたデータと比較することができます。相関顕微鏡が意図されている場合、それは簡単に識別し、単一の核の再配置を可能にするため、これは特に便利です。 （ 図2-4）。
最初の例（ 図3）は安定してMDC1 miniSOG-mCherryを発現しているU2OSを細胞株を示しています。レーザ微小照射実験では、miniSOGとmChrerryタグを含むMDC1の動員（データは示さず）、このタンパク質のGFPタグ付きバージョンに非常に類似していました。 DNA損傷誘導後、細胞を1時間を固定し、TEM用のサンプルを調製し、MDC1ダメージトラックが簡単に（蛍光データに非常によく一致した核全体の暗い縞として通常のTEMモードでの超薄切片で同定されました図3-5）。タンパク質の分布を見ると、窒素信号の明らかな増加は、レーザ損傷を受けたサイトで観察することができました。なお、これは主に、重合diamiによって引き起こされていることをここで指摘しなければなりません窒素に富んでいるとminiSOGの信号を増幅nobenzidineは、むしろ単にダメージトラックで修復タンパク質の蓄積を通じよりも、修復タンパク質をタグ付け。ダメージトラックでの構造の核の残りの部分でクロマチン構造を比較すると明らかな差を示しています。損傷したクロマチンは（それは、図3の破線内に示されている）より核質の太い畝で発生する非照射クロマチン、とは対照的に脱凝縮表示されます。ダメージトラックの中では、核酸からMDC1-miniSOGタンパク質が豊富でなく、自由である（ 図3 II2、第IIb、IIcのとIIIa族の矢印で強調された）核小体（200-300 nm）をも観察することができました。それは、この技術なしでクロマチンのない構造として、これらの核小体を定義することが非常に困難であろう。また、MDC1の既知の生化学によって予測されていない損傷サイトへの複雑さのレベルを追加示唆しています。
ntent ">以前はMDC1トランスフェクト細胞における損傷を記載したように、非常に類似の結果を観察することができる。の光酸化により生成された信号を同一の条件を使用して作成された53BP1のダメージトラック（ 図4）を見るとminiSOGは混んでいましたし、クロマチンのひだの間のスペースを埋め。重染色された核小体は、（ 図4のD、E、Fの矢印で強調表示）を観察することができました。RAD52-GFP構築物を用いた実験から、RAD52、小さな明るいmicrocompartementsをレーザー誘発損傷のトラックに沿って24を形成することが知られています。従来の光学顕微鏡の分解能の限界に起因し、それは彼らが損傷を受けたDNAにどのように関係するか大きなこれらの構造が実際にあるとどのように不明でした。構成的にRAD52-miniSOG-mCherryをを表現するレーザ照射U2OS核のTEM像を見ると、これらの機関の大きさは、平均値（150〜250ナノメートル）にあることが測定されました。それはさらに驚くべきことは、ESIとこれらの巣を見て。前の例とは対照的に、RAD52-miniSOG-mCherryを病巣は、損傷のトラックに沿って、かなり異なって編成されているように見えるとタンパク質で構成され、その内部では検出核酸を持っていないされている小型の核体のような構造であるように見えます。私たちの組み合わせminiSOGおよびESIのアプローチを用いて得られた被災地での核酸/タンパク質の関係を見に基づいて、我々は、DNA修復は病巣の表面ではなく内部で行うことができることを示唆しています。
図5に示すの下側の画像は、3-IIIを図のようになります。損傷領域でのクロマチンはそれ以上の非照射領域におけるクロマチン（赤ダッシュで概説された領域を参照）に比べて脱凝縮しているようです。
ガンマ照射された細胞
レーザーマイクロ照射はquicklするための便利なツールですがDNA損傷の部位への動員のための蛍光タグが含まれているY試験タンパク質は、複雑な損傷（二本鎖切断、一本鎖切断、基本ダメージと、cyclopyrimidineダイマー）25を大量に作成します。より直接的にDNA二本鎖切断の周りに形成する区画を調べるために、我々は、ガンマ線照射に細胞を曝露することによって、個々のDSBの周りに形成DRFSを調べました。
安定53BP1-miniSOG-mCherryをを表現するU2OS細胞は、ガンマ線照射の2 Gyのに暴露し、照射後半時間を固定しました。核質全体に分布する大型の巣の特徴的なパターンは、（ 図6Ia）を観察することができました。ジアミノベンジジンの光酸化した後、蛍光mCherryを信号が蛍光顕微鏡写真に位置していた位置に新興ダークスポットは、電子顕微鏡写真（ 図6Ibおよびc）に見ることができました。これらのスポットは、画像をTEMと相関させることができそれは、（ 図6Idおよびe）低倍率で撮影しました。直径約1〜1.5ミクロンであるように思われ、これらの病巣のESI画像は、興味のある構造を示しました。クロマチンの薄いストランドは約2倍の厚さの53BP1タンパク質が散在しているように見えました。
他の実験では、細胞は、放射線のより高い量に曝露された、より大きな病巣を発生し、超薄切片（ 図7）でそれらを配置容易にするために、（それぞれ3時間及び6時間後）後の時点で固定されています。私たちは別々に核タンパク質とタンパク質をマッピングすることが可能であるため、ESIは病巣の構造が時間をかけて再編成するように見えることが明らかになりました。焦点の53BP1タンパク質の相対量は、クロマチンが複数の周辺位置をとりながら増加すると思われます。
53BP1病巣もアンダー複製のサイトで、G1細胞の「不可解な巣」のような非照射細胞に表示されますので、D DNA 26,27は 、それらの焦点は、また、画像化しました。これらの不可解な病巣は、放射線誘発性病巣へのタンパク質の相対的な高量を抱いているようだとクロマチンの興味深い規則的な構造を示しています。
したがって、miniSOG法を用いたDNA修復フォーカスの成分を可視化するDNA損傷の領域を識別し、タグ付けされたクロマチンに修復タンパク質の相対分布をマッピングするのに役立ちます。
ESIの画像で観察することができる構造の図1.概要 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
（A）マウス胚性線維芽細胞のESIイメージ。クロマチン尾根（黄色）が核質（シアン）interchromatin SPをいっぱいに囲まれてエース。核が核膜孔複合体（シアン）によって中断された周辺ヘテロクロマチンとchromocenters（左下）に囲まれています。核小体は明らかにそれらの色によって分離することができます。これはクロマチンであるよりも、核酸へのタンパク質の量は、核小体の構造に高いという事実によるものです。核の外では、（核酸が豊富）ミトコンドリアおよびリボソームは容易に識別することができます。
（B）核の画像と画像の左上中空タンパク質に富む粒子として見ることができる中心体（矢印を参照）。
中期板を介して、（C）断面図。高度に凝縮中期染色体は、左下隅に左上隅からまたがるディスクに整列しています。窒素の高濃度は、いくつかの染色体の表面に表示されます。これらの領域は、動原体（矢印を参照）です。
（上段）の行の最初の二つの絵は、リンと窒素の比率マップを示しています。上段の最後の画像は、RGB色空間で重ね合わせ、これらの元素のマップを示しています。黄色の構造は、リンと窒素の両方の存在を反映して、核を表します。 （下段）は、最初の画像は、主に、試料中の核酸の分布を明らかにリンマップを示しています。真ん中の写真は、核酸枯渇/陰性STRUの分布を示しています ctures。これは、窒素マップからリンマップを減算することにより算出しました。右下の写真は、核酸マップと減色空間におけるタンパク質マップのマージを示しています。このカラー合成は、個々の構造の同定を補助し、核タンパク質、核タンパク質として分類するかどうかを使用すべきです。リンと窒素豊富に定量的な情報はネットリン、純窒素グレースケールマップから、またはそのような一番上の行のような添加剤の色を使用して生成された複合材料から視覚的に収集する必要があります。 
多色ESI画像の作成 図2 
安定MDC1-miniSOG-mCherryをを発現しているU2OS細胞の図3.レーザーマイクロ照射。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
IC内の緑の四角で強調（II）の領域は、通常の送信モード（IIa）およびESI式（IIb）に拡大して示しました。 IIcのダメージトラックの信号とのESI画像のオーバーレイを示しています。ダメージトラック信号は、上の画像を閾値処理することにより得ました。
（III）は、レーザ微細構造の例レーザー損傷を受けた領域の外側-irradiatedクロマチンとクロマチン。
安定53BP1-miniSOG-mCherryを発現細胞の図4のレーザーマイクロ照射。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
左の列：（A）蛍光、（b）は従来の TEM及び核を照射同じレーザーマイクロの（C）ESIイメージ。
右の列：（D）従来のTEM、（E）ESIおよび（D）の閾値化によってセグメント化されたminiSOG信号とESIの画像の（F）オーバーレイ（ステップ6.10を参照してください）
図5. U2OS細胞株を安定RAD52-miniSOG-mCherryをを表現し、レーザーマイクロ照射により損傷を受けた。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
左下のダメージトラックとmicroirradiatedレーザーU2OS核を示す低倍率のTEM像と蛍光画像の（A）オーバーレイ。
レーザーマイクロの（B）代表共焦点蛍光顕微鏡画像は、ヘキスト染色した核（青）ダメージトラック（赤信号）に沿って小さな病巣の特徴的なパターンを示すRAD52-miniSOG-mCherryをを表現照射しました。
（C）従来のTEM、（D）ESI、
全核の文脈におけるレーザ誘起損傷トラックを示す安定RAD52-miniSOG-mCherryをを表現する別のU2OS核の（G）のESIイメージ。
安定53BP1-miniSOG-mCherryをを表す図6. U2OS細胞は、2 Gyの照射をし、30分後に固定されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
（I）a）の蛍光画像は、ガンマ線照射によって誘発される53BP1病巣を示します。 B）光重合後の光の画像を送信します。 C）Ovと透過光画像と蛍光のerlay。 d）の低倍率のTEM画像が（ブラックストライプ）がTEM格子バーです。低倍率のTEM像と蛍光画像のe）のオーバーレイ。
通常のTEMおよびESIモードで記録された透過光画像にアスタリスクで標識した（II）被害の焦点。 a）は、ゼロ損失、b）のESI、C）リン、d）のタンパク質E）オーバーレイESIおよびゼロ損失画像からセグメント化された信号。
通常のTEMおよびESIモードで記録された蛍光画像で十字で標識した（III）被害の焦点。 a）は、ゼロ損失、b）のESI、C）リン、d）のタンパク質E）オーバーレイESIおよびゼロ損失画像からセグメント化された信号。
照射の異なる時間後の焦点間巣構造図7.変更。< / strong>の、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
U2OS 53BP1 miniSOG mCherryを細胞がそれぞれ3時間（1A-E、FJ）および6時間（2A-E、FJ）の後 、固定ガンマ線照射の6 Gyのにさらされます。図3は、不可解なフォーカス（AE）を示す未照射U2OS 53BP1 miniSOG mCherryを核を示しています。 ESIの写真は、注文ESI（核酸およびタンパク質）、核酸（単独）、タンパク質（単独）、ESI（核酸およびタンパク質）に提示+ miniSOG信号をセグメント化されています。
四酸化オスミウムで後固定を省略した場合、図8のDNA修復巣はまだ従来の透過モードで表示されます。 arge.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
四酸化オスミウムで処理しなかったサンプルから2 53BP1巣を示すU2OS核の超薄切片（50 nm）と。（A）は、従来の TEMモードでは、それもとのコントラストを向上させることなく、DABポリマーによって染色されたサイトを参照することが可能です重金属染色（B）病巣のコントラストがさらに、（複数の散乱イベントからの全ての電子源を離れてフィルタリング）ゼロロスの画像を撮影することによって高めることができます。
マッピングリンのための最適なエネルギーウィンドウの設定図9.決意
（A）120 eVので155 eVのでポストエッジにリンとプレエッジのために記録された元素比マップ。
コンテンツ"> 120 eVので175 eVのでポストエッジにリンとプレエッジのために記録された（B）元素比マップ。（C）120 eVのエネルギー損失とは対照的に最良である組み合わせを決定するために、140-200eVエネルギー損失に至るまでの可変ポストエッジウィンドウで一定プレエッジ窓からリン比マップを計算します。同じリン金持ちとリン貧しい地域の上にまたがるラインスキャンで最も明るいの強度差とdimmestpixelは175 eVのエネルギー損失の後のエッジ画像が選択された最も高いコントラスト値（ダイナミックレンジ）を示しています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ESIは、それが具体的にリンが豊富な領域をマッピングすることが可能であるため、核内でクロマチンとリボの異なる状態を調べるための優れたツールとして機能することができます。それは深く、電子顕微鏡によって得ることができる詳細の量を増大し、非特異的な対照的な方法に依存していません。 ESIの1つの欠点は、同じ加速電圧で、従来のTEMより薄いセクションを必要とすることです。これは、連続切片での作業や断層撮影法28を使用することによって克服することができます。
多くの情報は、リンと窒素の分布を見ることによって得ることができるが、それはまた、特定のタンパク質の分布をマッピングできることが重要です。本論文で提示された方法では、ESIは、ジアミノベンジジンの部位特異的重合に基づいている方法と組み合わせることができることを実証しました。この方法は、FUを追加しませんがESIにLLの新色は、それがタンパク質の分布をマッピングすることが明らかに便利です。これは、クロマチンと相互作用するタンパク質に当てはまります。研究は、二つ以上のタンパク質の集団を可視化する必要がある場合は前の光酸化9に、予め埋め込 み染色として適用される場合、免疫を用いた標識方法を引き続き使用することができます。安定な細胞株と比較して、一過性トランスフェクションは、発現レベルは、細胞間で有意に変化するので、それはハードタグ付きタンパク質の同量を発現する複数のセルを検索することを可能にすることができないという欠点を有しています。そのため、安定した細胞株の作成が推奨されます。しかし、蛍光イメージングを用いて、タンパク質発現の相対量を判断し、一過性トランスフェクション後の中間体の式を有する細胞を選択することが可能です。
miniSOG融合タグは、それ自体蛍光性であるが、その量子収率は、GFP（0.37対0.6）10よりも大幅に悪化しています。パープについてmCherryをのような追加の蛍光タンパク質タグを追加相関顕微鏡のOSEは、miniSOG励起で発生する一重項酸素を生じることなく生きた細胞内イメージングを可能にします。 miniSOGタグ付きタンパク質の発現レベルは、DABを含む緩衝液中の酸素量、およびpHがまた、光酸化の速度に影響を与えることができます。時にはそれがあるため、光酸化反応の光依存性の関心領域内に均一な光酸化を達成するのは非常に問題となる可能性があります。長時間の光酸化は、非特異的染色およびESIことによって、要素固有の信号の検出を複雑にすることができますサンプルでも多くの重金属の堆積につながることができます。光酸化プロセスは非常に時間がカバーガラスには、いくつかの細胞を含む通常は非常に小さい領域が正常に染色されるようにかかります。
我々はminiSOGの組み合わせが付着HUの単層を使用して、ESIを有するタンパク質をタグ付けが示されています人間の癌細胞株。原則として、この方法は、それが妥当なレベルでminiSOG標識タンパク質及び限り透光及び酸素の拡散を表現することが可能であり、DABは、任意の他のサンプル（酵母、細菌、組織、胚）にも適用することができ適切な光酸化、従って、均一な染色を可能にするのに十分に高いです。懸濁細胞の場合、それは、ポリ-L-リジン等の接着剤を用いてカバースリップ上の細胞の位置を固定することが有利であろう。厚い試料の場合、低い開口数の目標は、より均質な照明を実現しますが、光酸化するために時間がかかります。
私たちは、シュウらによって公表された元のプロトコルに近いminiSOGタグ融合タンパク質の使用を提示している可能な限り10 - 。四酸化オスミウムの使用を含むが。そこ離れ優先DABポリマー及び膜に付着から、四酸化オスミウムは、いくつかの反応性を示すことが観察できたと試料中の生物学的物質のほとんどの堆積（10 図3）。四酸化オスミウムは、45 eVので元素エッジを有します。この信号は、そのプラズモンは試料を通過する間に、複数のエネルギー損失事象を受ける検体が増加し、単一電子の厚さの電子エネルギー損失スペクトルに重ね合わせることができます。高濃度のOsO 4は、試料調製において使用される場合、これは、リン元素マップの品質を制限することができます。 10以前に使用されたものよりも有意に低い我々がここで使用した濃度は、良質のリンマップの生成を可能にしました。高いのOsO 4の濃度を要求するタンパク質をタグ付けminiSOGを用いた実験では、まだ良いリンマップの作成 を可能にする最良の濃度は、経験的に決定する必要があります。
我々は、DNA修復に焦点を形成DABポリマーがsufficieであることを見出しました四酸化オスミウムで後固定を省略した場合でも、従来のTEMモード（またはより良いコントラストがゼロロスモード）で見ることがntly稠密（ 図8参照）。このように記録された信号のセグメント化は、オスミウムで処理したサンプルを使用してのように堅調に推移しました。可視化されなければならない核タンパク質、それが形成構造物の大きさや膜系を可視化する必要性に応じて、四酸化オスミウムを使用する必要はないかもしれないし、その省略は、リンの元素シグネチャーをマスクする可能性を除去します。
ESI 18,29,30を使用して、他の出版物に比べて、我々は、ノイズの最小量の元素比マップを生成するために、前後のエッジ画像に異なる設定を使用しています。私たちは、経験的に原稿に提示した設定を決定した（ 図9参照）。エッジの周りに選択した設定が正しいELEにつながるはずコレクションウィンドウない限りメンタルマップは、試料中に存在する他の要素と重複しています。私たちのケースでは、硫黄は、このような要素である可能性があります。 （アミノ酸メチオニンおよびシステインで起こる）、硫黄の濃度が非常に低く、ごくわずかな量で計算されたマップに寄与するので、我々は不利な点を上回る、ここで使用される設定を使用して得られた優れたS / N比を信じてそれは、試料中の硫黄の痕跡から生じる可能性があります。
私たちは、ESIおよびTEM技術と組み合わせたDNA修復タンパク質MDC1、53BP1とRAD52を使用して、ナノメートルの解像度でDRFSの超微細構造を明らかにしました。クロマチンと個々のDSB修復タンパク質局在化の組織は、このアプローチを使用して解決されました。クロマチンのリッジとの間の空間を充填するレーザーマイクロ照射DNAおよび修復タンパク質の傾向を以下のDNA損傷に富むドメインにおけるそれらの局在を示しました。 RAD52の場合、ナンプラーでYS相同組換えにおける役割、レーザー損傷したトラックに沿って核体のような球状構造の形成を観察することができ、これは、他の2つのテストのタンパク質と対照的でした。損傷がガンマ線照射によって適用されたとき、53BP1が損傷クロマチン周囲に病巣を形成しました。病巣内クロマチンとタンパク質の相対組成および位置は、時間の経過とともに変化しているようです。これらのタンパク質および損傷したクロマチンならびにクロマチンの組織化及び核小体の組成の変化との関係は、すべて容易に薬剤が直接これらの特性を評価することができない対照的なとしてウラニウム、鉛を用いた従来の明視野顕微鏡に対し、ESI法を用いて得ることができます。したがって、この技術は、特に、DNAに作用するプロセスのための構造 - 機能関係の研究のための高い可能性を示しています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Gridded 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-2-14-CGRD | not made for immersion objectives |
| LR White: acryl resin | emsdiasum | 14381 | |
| LR White accelerator | emsdiasum | 14385 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets | Sigma | D5905 | |
| Slim Bar Grids 300 Mesh | SPI | 1161123 | |
| Tungsten-Point Lab Pen | emsdiasum | 41148 | |
| Osmium Tetroxide | emsdiasum | 19100 | |
| Carbon Coater 208 carbon | Cressington | ||
| Ultra microtome Leica EM UC6 | Leica | ||
| Photoshop CS5 | Adobe | might even work with older versions | |
| Digital Micrograph V.2.30 | Gatan | might even work with older versions | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H-1399 | |
| Effectene | Quiagen | ||
| MiniSOG-Constructs | Tsien-Lab | tsienlab@yahoo.com | |
| MDC1 miniSOG mCherry | |||
| 53BP1 miniSOG mCherry | |||
| Rad52 miniSOG mCherry | |||
| cesium 137 radiation source "MARK 1" | (J.L. Shepherd & Associated) | ||
| ImageJ/FiJi | open source | http://fiji.sc/Fiji | |
| 2 ml Eppendorf tubes | Fisherbrand | 05-408-146 | |
| Diamond Knife ultra 35° | Diatome | ||
| Trimming Knife ultratrim | Diatome | ||
| Sodium cacodylate trihydrate | emsdiasum | 12300 | Caution Toxic! |
| Glutaraldehyde EM Grade 8% | emsdiasum | 16020 | Caution Toxic! |
| Sodium phosphate dibasic | emsdiasum | 21180 | |
| Sodium phosphate monobasic | emsdiasum | 21190 | |
| Paraformaldehyde | emsdiasum | 19202 | |
| Osmium tetroxide 4% solution | emsdiasum | 19150 | |
| Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Hydrochloric Acid | Fisherbrand | A142-212 | |
| Sodium Hydroxide Solution 10M | Fluka | 72068 | |
| Oxygen | Medigas | ||
| 3-Amino-1,2,4-triazole | Sigma | A8056 | |
| Potassium cyanide | Sigma | 207810 | Caution Toxic! |
| Ethanol | emsdiasum | 15058 | Caution Toxic! |
| Razor blade Single Edge Carbon Steel | emsdiasum | 71960 | Caution Sharp! |
| DMEM | Sigma | D 5546 | |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | |
| G418 | Life Technologies | 11811-023 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Transmission Electron Microscope 200 kV | JEOL | 2100 | |
| GIF Tridiem 863 Energy filter | Gatan |
References
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).
- Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. Stoichiometric analysis of protein- and nucleic acid-based structures in the cell nucleus. Micron (Oxford, England: 1993). 30, 151-157 (1999).
- Michael J Hendzel, F. M. B., Bazett-Jones, D. P. Direct Visualization of a Protein Nuclear Architecture. Molecular biology of the cell. 10, 2051 (1999).
- Ottensmeyer, F. P., Andrew, J. W. High-resolution microanalysis of biological specimens by electron energy loss spectroscopy and by electron spectroscopic imaging. Journal of ultrastructure research. 72, 336-348 (1980).
- Leapman, R. D., Ornberg, R. L. Quantitative electron energy loss spectroscopy in biology. Ultramicroscopy. 24, 251-268 (1988).
- Simon, G. T.
- Egerton, R. Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , Springer. (2011).
- Aronova, M. A., Kim, Y. C., Zhang, G., Leapman, R. D. Quantification and thickness correction of EFTEM phosphorus maps. Ultramicroscopy. 107, 232-244 (2007).
- Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. Chimeric molecules employing horseradish peroxidase as reporter enzyme for protein localization in the electron microscope. Methods in enzymology. 327, 35-45 (2000).
- Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS biology. 9, e1001041 (2011).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science (New York, NY). 296, 503-507 (2002).
- Fernandez-Capetillo, O., Celeste, A., Nussenzweig, A. Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors. Cell cycle (Georgetown, Tex). 2, 426-427 (2003).
- Haaf, T., Golub, E. I., Reddy, G., Radding, C. M., Ward, D. C. Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 2298-2302 (1995).
- Maser, R. S., Monsen, K. J., Nelms, B. E., Petrini, J. H. hMre11 and hRad50 nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 17, 6087-6096 (1997).
- Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA repair. 9, 1219-1228 (2010).
- Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. Journal of cell science. 125, 3529-3534 (2012).
- Dellaire, G., Kepkay, R., Bazett-Jones, D. P. High resolution imaging of changes in the structure and spatial organization of chromatin, gamma-H2A.X and the MRN complex within etoposide-induced DNA repair foci. Cell cycle (Georgetown, Tex). 8, 3750-3769 (2009).
- Kruhlak, M. J., et al. Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks. The Journal of Cell Biology. 172, 823-834 (2006).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor protocols. 2010, (2010).
- Zeyda, M., Borth, N., Kunert, R., Katinger, H. Optimization of sorting conditions for the selection of stable, high-producing mammalian cell lines. Biotechnology progress. 15, 953-957 (1999).
- Dellaire, G., Nisman, R., Bazett-Jones, D. P. Correlative light and electron spectroscopic imaging of chromatin in situ. Methods in enzymology. , 375-456 (2004).
- Campbell, S., Ismail, I. H., Young, L. C., Poirier, G. G., Hendzel, M. J. Polycomb repressive complex 2 contributes to DNA double-strand break repair. Cell cycle. 12, 2675-2683 (2013).
- Mortusewicz, O., et al. Recruitment of RNA polymerase II cofactor PC4 to DNA damage sites. J Cell Biol. 183, 769-776 (2008).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173, 195-206 (2006).
- Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Frontiers in genetics. 4, 135 (2013).
- Lukas, C., et al. 53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress. Nature. 13, 243-253 (2011).
- Harrigan, J. A., et al. Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells. The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).
- Aronova, M. A., et al. Reprint of 'Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST). J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).
- Fussner, E., et al. Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming. The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).
- Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin. Cell cycle. 10, Georgetown, Tex. 308-322 (2011).
