Abstract
Grensene for optisk oppløsning og utfordringen med å identifisere spesifikke protein populasjoner i transmisjonselektronmikroskopi har vært hindringer i cellebiologi. Mange fenomener kan ikke forklares ved in vitro-analyse i forenklet system og trenge ytterligere strukturell informasjon in situ, særlig i området mellom 1 nm og 0,1 nm, for å bli fullt ut forstått. Her elektron spektroskopiske imaging, en transmisjonselektronmikroskopi teknikk som tillater samtidig kartlegging av fordeling av proteiner og nukleinsyrer, og et uttrykk tag, miniSOG, kombineres for å studere struktur og organisering av DNA dobbel tråd pause reparasjon foci.
Introduction
Til tross for de betydelige fremskritt i lysmikroskopi over de siste år 1, cellebiologer fortsatt lider av et gap i oppløsning. Dette begrenser forståelsen av struktur-funksjon relasjoner i fundamentale cellulære prosesser som innebærer koordinert samspill mellom makromolekylære komplekser (f.eks i kromatin remodellering, DNA-reparasjon, RNA transkripsjon og DNA replikasjon). Selv om transmisjonselektronmikroskop (TEM) s tilveiebringe den ønskede oppløsning, har det vært vanskelig å definere disse prosessene strukturelt på grunn av manglende evne til å merke spesifikke proteiner og samtidig være i stand til å bestemme den biokjemiske sammensetningen av de visualiserte strukturer. I fravær av interne membraner for å skille kjernestrukturer, har kjernen vært spesielt vanskelig. Elektron spektroskopiske imaging (ESI) løser noen av disse begrensningene ved å tillate samtidig deteksjon og differensiering av DNA, RNA, og protein baserte atomstrukturer 2-5.
Electron spektroskopiske bildebehandling:
For å kartlegge elementære distribusjoner med høy følsomhet og oppløsning i elektronmikroskop, kan man bruke en avbildning spektrometer som velger elektroner som har blitt uelastisk spredt gjennom samhandling med indre skall elektroner av et element i prøven 6. Fordi element-spesifikke energimengder går tapt som følge av ionisering av atomer i prøven, kan disse elektroner separeres og visualisert ved bruk av et spektrometer som er festet til den elektronmikroskop. Således analyse av spekteret for de elektroner som har interaksjon med prøven avslører kvalitativ og kvantitativ informasjon om elementsammensetningen av prøven 7. Elektroner som ikke mister energi når de passerer gjennom prøven er funnet i "null-tap peak" av elektron energitapspektrum. Den mengde av disse elektronene er relatert til masse, tetthet og tykkelse for prøven, og består av elektroner som passerer gjennom prøven uten å kollidere med prøven eller å miste energi under passasje gjennom prøven. Denne informasjonen kan være nyttig for absolutt mengdebestemmelse av antallet av atomer av et spesifikt element som er tilstede i prøven 8.
Siden biologisk materiale består hovedsakelig av lette elementer som dårlig avbøyer elektronene i den innfallende strålen av TEM, farvemetoder ved hjelp av tungmetall-salter har til å bli brukt for å generere kontrast i prøven. Mangelen på spesifisitet for de fleste av disse kontrastmidler og manglende evne til å visualisere mer enn en flekk der spesifisitet er mulig har begrenset verdi av konvensjonell elektronmikroskopi i studiet av kjernen. ESI har betydelige fordeler fremfor konvensjonelle TEM, særlig for studiet av strukturer av cellekjernen.Det er mulig å utnytte den fosfor-rike karakter av DNA- og RNA-inneholdende makromolekylære komplekser for å skille nukleoprotein komplekser fra proteinkomplekser og å løse forskjellige nukleoprotein komplekser basert på deres tetthet av nukleinsyrer. Det gjenværende biologiske materialet kan avbildes på grunnlag av dens overflod av nitrogen. Kartlegging bare disse to elementene og analyse av deres utbredelse og relativ overflod innenfor ulike anatomiske strukturer gir oss mye informasjon om kjernen. For eksempel, er det lett å identifisere kromatin og ribosomene i kartet som representerer fosfor overflod. Den interchromatin plass, pore atomkomplekser, og atom legemer, på den annen side, kan lett oppdages i nitrogenkartbildet.
Mini singlet oksygen generator system (miniSOG)
Mens ESI representerer en kraftfull teknikk for å studere in situ kromatinstruktur fordi det tars Fordelen med de karakteristiske prosenter i elementsammensetningen mellom fosfor og nitrogen, elementsammensetningen vanligvis ikke kan brukes for å diskriminere mellom forskjellige populasjoner av proteinkomplekser. Antistoffer merket med små gullpartiklene i nanometer har blitt mye brukt for å kartlegge plasseringen av individuelle molekyler. Siden gull partikkel er vanligvis festet til et sekundært antistoff, vil den vises i en omkrets på omtrent 20 nm rundt detektert av det primære antistoff epitop. I post-embedding prøver, kan antistoffer bare gjenkjenne epitoper som er eksponert på overflaten av seksjonene. Mens det er mulig å påvise nærværet av et antigen og relatere den til en viss anatomisk struktur av cellen, er informasjonen som er innhentet er ufullstendig, fordi de fleste av de epitoper blir skjult av harpiks. Pre-innebygging teknikker, som benytter tilsvarende protokoller som dem som anvendes for fluorescens mikroskopi, gi tilgang til antigener i helehele dybden av prøven, men permeabilization trinnene som er nødvendige for å tillate antistoffet å trenge inn i cellen vanligvis krever fjernelse av lipid-membraner og fjerne komponenter som ikke kan fastsettes av aldehyder. Videre er det foretrukne aldehyd fiksativ for ultra bevaring, glutaraldehyd, ødelegger ofte epitoper, og følgelig er paraformaldehyd vanligvis nødvendig. Dette er mindre effektiv ved protein-proteintverrbinding. En annen ulempe med antistoffer som er merket med en gull nanopartikkel er at gull er et meget elektron-tette materiale som skaper en sterk kontrast som kan skjule interessante strukturelle detaljer av prøven, som har svakere kontrast.
Fremveksten av den grønne fluorescerende protein (GFP) som uttrykte protein tag har endret bruk av fluorescens mikroskopi for å svare på spørsmål i cellebiologi. Tagging et protein med en liten fluorescent domene tillater kartlegging av sin distribusjon in vivo 9. Reaksjonsproduktene av HRP kan også diffundere bort fra stedet til generasjon, slik at oppløsningen er dårligere enn den nanogold måten 10. For å omgå disse problemene, ble flash / ReAsH system utviklet 11. Den består av rekombinante fusjonsproteiner som innehar en tetracysteine motiv. Dette motivet tillater binding aven biarsenic fluorophore. Når opphisset, er det bundne Flash eller ReAsH stand til å generere svært reaktive singlet oksygen og dermed photoconvert diaminobenzidin (DAB) i en polymer som utfelles umiddelbart på stedet av de merkede proteiner. DAB polymer kan farges med osmiumtetroxyd, som er elektron tett og kan således anvendes for å kartlegge fordelingen av det rekombinante fusjonsprotein i TEM.
I 2011, Shu et al. 10 presenterte miniSOG system, som består av en liten 106 aminosyrer fusjonssignal avledet fra et flavoprotein med Arabidopsis som er fluorescerende og i stand til å lage mange singlet oksygenradikaler når eksitert med 448 nm blått lys. Disse singlet oksygenradikaler kan brukes til foto oksidere diaminobenzidin til å danne polymerer på og nær overflaten av den merkede protein, noe som er betydelig nærmere enn en immun merkede antistoffer 11. Mens flash / ReAsH systemet krever bringe fluorkrom og diaminobenzidin inn i cellene før gjør photoconversion, det miniSOG systemet kun krever diaminobenzidin og lys, og i tillegg er omtrent dobbelt så effektiv ved polymerisering av diaminobenzidin. Her er miniSOG ansatt i kombinasjon med ESI for å kartlegge ultrastructure av DNA-reparasjon foci.
DNA-reparasjon foci (DRF)
Ureparert DNA dobbelttrådbrudd utgjør en alvorlig trussel mot celle siden de kan føre til trans og tap av genetisk informasjon. I sin tur kan dette føre til begynnende alderdom, kreft og celledød. Mange proteiner som er involvert i DNA dobbel tråd bryte reparasjon akkumuleres i foci som sammen rundt en DNA dobbel tråd bryte 12-14. Selv om deres funksjon er ikke kjent, de representerer området i kjernen som inneholder DNA dobbel tråd pause og er stedet for DNA dobbel tråd pause reparasjon.
DNA-reparasjon foci (DRF) har vært preget av fluorescens mikroskopi og de tjener som biomarkører for DNA-skader 12,15. De er massiv i forhold til størrelsen av den dobbelte tråd-brudd, og ble betraktet som relativt homogent før de senere super-oppløsning mikroskopistudier viste noen tegn på under compartmentalization av molekyler i hver fokusere 16. For å forstå hvordan disse områdene er organisert, er det nødvendig å visualisere alle de underliggende biologiske strukturer i forhold til hverandre. Dette kan ikke oppnås ved fluorescens mikroskopi, men er mulig ved elektronmikroskopi 17,18. Her blir det beskrevet en metode som kombinerer elektronspektroskopiavbildning med miniSOG metode for å illustrere potensialet for denne kombinerte metode for å utforske den ultra av DNA dobbel tråd pause reparasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generasjon miniSOG Cell-linjer
- Grow U2OS (humant osteosarkom) celler i en 35 mm skål inneholdende 2 ml av lavt glukose Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), som er supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO2 atmosfære.
- Transfektere cellene når de er 80% konfluent ved lipofeksjon med renset transfeksjon kvalitet (A269 / 280-forholdet 1,8-2,0) plasmidkonstruksjoner som inneholder sekvensene for miniSOG og mCherry tagget reparasjon av proteiner i henhold til protokollen fra produsenten av transfeksjon reagens 19. De miniSOG ekspresjonsplasmidene kan bestilles fra Tsien-Lab: http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
- Sorter cellene uttrykker rekombinant protein med miniSOG og mCherry tag ved fluorescens aktivert celle sortering to dager etter transfeksjon. Samle cellermed mellomliggende fluorescensintensiteten for å unngå at celler som overuttrykker 20.
- Culture de positive cellene på en 10 cm plate i 10 ml DMEM-medium som er supplert med 10% FBS og 0,6 ug / ml av seleksjonsmiddel G418 (geneticin).
- Etter synlige kolonier har dukket opp på platene, skjerm for mCherry positive kolonier ved å bruke en invertert fluorescensmikroskop og tegne sirkler rundt dem (på undersiden av platen) med en permanent markør. Bruk en liten forstørrelse luft objektiv (f.eks 10x) og plukke kloner Bruk steril teknikk ved forsiktig skrape koloniene av og langsomt suger dem inn i en steril 1000 mL pipette tips.
- Utvide de valgte kolonier og fryse deler av dem ned ved hjelp av vekstmediet som er beskrevet i trinn 1,1 supplementert med 10% dimetylsulfoksid. Test cellene for DRF dannelse ved å dyrke dem på sterile 18 x 18 mm 2 dekkglass og utsette dem for2 Gy av stråling. De bestrålte celler som stabilt uttrykker en miniSOG mCherry tagget reparasjon protein må vise den typiske samlings mønster karakteristisk for DSB sin når visualisert med en fluorescens mikroskop ved hjelp av et filter-sett for bildebehandling mCherry.
2. Cell Culture
- Kultur U2OS celler som stabilt uttrykker miniSOG og mCherry tagget reparasjon proteiner på de vilkår som er skissert i trinn 1.1. Dyrke celler til 80% konfluens i en 35 mm diameter glassbunn skål inneholdende 2 ml DMEM. Sørge for at limet som fester dekkglass i plast og den anvendte plast er resistent mot vandige og alkoholiske løsninger og bestandig overfor harpiks som brukes!
- Før gjennomføring av forsøket, skissere et lite område på omtrent 1 mm 2 som inneholder celler som uttrykker de ektopiske proteiner ved å skrape med en steril diamant penn ved hjelp av et fluorescensmikroskop for å identifisere regionen av interesse. Alternativt kan du bruke en glassbunn fatet that inneholder en dekkglass med en pre-etset grid system bygget inn i dekkglass.
MERK: Hvis du bruker høy kvalitet samsvarmikros kombinere ESI og fluorescens mikroskopiske bilder 21, sørg for at tykkelsen på dekk er kompatibel med olje nedsenking mål. Den bør ha en tykkelse No. 1,5 (0,16 til 0,18 mm). Velge et område nær sentrum av fatet for regionen som skal undersøkes i TEM for å unngå problemer med polymerisasjon av harpiksen som måtte forekomme i nærheten av kantene (se punkt 04/10 til 04/13).
3. DNA Damage Induksjon
- Bestråle celler med gammastråling, å bruke en radiomime medikament, eller forårsake skade ved laserbestråling av mikro en konfokal mikroskop (for eksempel som beskrevet i 18,22 eller 23).
- I dette eksempel strålebehandling av cellene med 2 og 6 Gy av gammabestråling i en cesium-137 strålingskilde eller laser microirradiate bruke 405 nm solid state laser av et konfokalt mikroskop etter sensibilisering av cellene i 20 minutter med 0,5 ug / ml Hoechst.
4. Prøvepreparering
- Fiksere cellene med 1 ml 4% paraformaldehyd FORSIKTIG i 0,1 M natrium-kakodylat-buffer eller i 0,1 M fosfatbuffer pH 7,4 i 30 minutter ved romtemperatur i mørke.
FORSIKTIG: Paraformaldehyde og natriumkakodylat er giftige! Bruk hansker og kast de giftige stoffer tilstrekkelig. - Vask cellene to ganger med 4 ml av 0,1 M natrium-kakodylat-buffer pH 7,4 eller fosfatbuffer pH 7,4.
- Behandle de fikserte celler med 2 ml av 50 mM glycin, 5 mM aminotriazole og 10 mM kaliumcyanid FORSIKTIG i 0,1 M natrium-kakodylat-buffer eller 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,4) (kontroller pH!) I 30 minutter for å blokkere ikke-omsatt aldehydgrupper og for å undertrykke de reaktive oksygen arter som er generert av hemegrupper, noe som kan øke bakgrunnen.
FORSIKTIG: Kaliumcyanid er ekstremt giftig! Wøret hansker, arbeide under en hette og kast de giftige stoffer tilstrekkelig. Reaksjonen er meget følsom for pH-verdien slik at det er viktig at pH-verdien kontrollert og nøyaktig. - Opptak av området som ble valgt i trinn 2,2 i 2D eller 3D på en omvendt fluorescensmikroskop, hvis korrelerende mikroskopering er ønsket.
- Forbered en 1 mg / ml diaminobenzidin hydroklorid FORSIKTIG løsning ved å plassere en 10 mg diaminobenzidin hydroklorid tablett inn i en 2 ml mikro tube. Legg 980 mL av destillert H2O og 20 pl konsentrert saltsyre (11,65 M) og bland inntil oppløsningen er lysebrun og gjennomskinnelig. Fortynn denne løsning i 0,1 M fosfat eller 0,1 M natrium-kakodylat-buffer til en sluttkonsentrasjon på 1 mg / ml, mens pH justeres med natriumhydroksyd til en pH-verdi mellom 7,0 og 7,6 (pH 7,4 er anbefalt).
FORSIKTIG: Diaminobenzidin er giftig! Bruk hansker og kast de giftige stoffer tilstrekkelig. - For fotooksidasjon, replace buffer med 2 ml av en 1 mg / ml diaminobenzidin hydroklorid oppløsning i 0,1 M natrium-kakodylat-buffer eller fosfatbuffer. Beskytte løsningen mot lys og kjøle den ned på is til 4 o C for å øke løseligheten av oksygen. Mett løsningen med oksygen ved å boble oksygen gjennom løsningen (bruk en slange som er ført inn i oppløsningen, og som er koblet til en oksygenflaske). Sjekk pH på nytt og juster om nødvendig.
MERK: Det er avgjørende for fotooksidasjon reaksjon at pH er mellom pH 7,0 og pH 7,6. - Montere parabolen med de faste celler nøye på en omvendt fluorescens mikroskop utstyrt med en 40x oljeneddyppingsobjektivet objektiv og flytte den til området av interesse. Opphisse miniSOG tag med blått lys ved hjelp av filter kuber for GFP eller CFP. MiniSOG har en maksimal eksitasjon ved 448 nm med en skulder ved 473 nm 10.
- Fortsett med belysning, selv etter den grønne miniSOG fluorescens haer fullstendig forsvunnet, og inntil den brune fotooksidasjon produkt av den polymeriserte diaminobenzidin fremkommer i det utsendte lyset kanalen. Når oksidasjonsproduktet er synlig i de fleste av cellene, slå av fluorescens belysning for å stoppe fotooksidasjon.
MERK: Photo-oksidasjon kan ta opptil flere minutter, avhengig av objektiv, filter overføringsbølgelengder og effektivitet, og belysningskilden. - Postfix cellene med 1 ml av 2% glutaraldehyd i 0,1 M natriumkakodylat pH 7,4 buffer eller fosfatbuffer pH 7,4 i 30 min.
- Fix membraner av cellene med 0,1% -0,5% osmiumtetroksyd i 20 minutter i 0,1 M natrium-kakodylat-buffer pH 7,4 eller 0,1 M fosfatbuffer pH 7,4.
MERK: Det anbefales å bruke lavest mulig konsentrasjon av osmiumtetroksyd nødvendig for å stabilisere membraner. Siden de polymeriserte DAB-utfellinger har en høy tetthet av nitrogen, som kan påvises direkte ved ESI, en sterkosmium farging er ikke nødvendig å identifisere miniSOG-kodede protein, og kan være skadelig for ESI. Osmiumtetroksyd er meget giftig! Arbeid i et avtrekksskap og kast den giftig avfall tilstrekkelig. - Dehydrerer, cellene gjennom en etanolserie ved bruk av 30%, 50%, 70%, 90%, 98% 100% etanol trinn (hver 5 min). Deretter inkuberes cellene i en 1: 1 blanding av 100% etanol og akrylharpiks (LR hvit) og sette formen på en ryster i 4 timer for å lette infiltrasjon inn i cellene før inkubering av cellene i minst 4 timer i 100 % akryl (LR White).
- For å polymerisere harpiksen, avskåret lokket av et merket 2 ml mikrosentrifugerør med et barberblad og belegge randen med akrylharpiks akselerator. Kontroller at gasspedalen bare dekker felgen og ikke flyter inn i røret. Deretter fylle nøye røret omtrent to tredjedeler med LR Hvit harpiks ved hjelp av en Pasteur pipette. Pass på at harpiksen ikke komme i kontakt viddh gasspedalen på felgen!
- Fjern harpiksen infiltrerte cellene i fatet og sett formen opp ned på den oppreist stående mikrosentrifugerør, slik at bredden av røret fylles nesten helt opp dekket glassobservasjonsvindu av fatet.
- Vent i 1 til 2 minutter for akseleratoren for å forsegle røret og dekkglass, deretter snu røret, slik at harpiksen i røret nå dekker cellene.
- Sett fatet med røret i en ovn ved 60 ° C, og herde den i 12 timer.
- Når blokken er kurert, fjerne fatet med den vedlagte resin fylte mikrosentrifugerør fra ovnen og skille mikrosentrifugerør fra fatet. Muliggjøre separasjon av fryse-tine-sykluser i flytende nitrogen og varmt vann.
- Kast glassbunn fatet og nøye kutte åpne mikrosentrifugerør med et barberblad for å oppheve sperren.
- Merke blokken med en permanent markør.
- Bruke et barberblad for å trim blokken slik at intet annet enn en mm 2 område som inneholder det område som tidligere er merket med diamant eller wolfram penn (eller inneholder området med cellene av interesse) gjenstår.
- Monter blokk i en ultramicrotome, trim blokken med en trimming kniv og kutte ultra-tynne snitt på ca 50 nm ved hjelp av en diamant kniv.
- Plukk opp avsnittene om høy transmisjons 300 mesh nett. Disse nett har veldig små grid barer og dermed dekke færre celler i området av interesse.
- Coat avsnittene om ristene med ca 0,2-0,4 nm av karbon ved hjelp av en karbon-belegger å bidra til å stabil dem under elektronstråle av TEM.
5. Elektronmikroskopi
- Laster gitrene i en TEM som er utstyrt med en energi filter. Etter å ha innstilt mikroskopet og energien filter i henhold til produsentens instruksjoner, inspisere cellene på seksjonene i lav forstørrelse modus (normal sending) og sammenlignedem til fluorescens når det er hensiktsmessig data (oppnådd i trinn 4.4).
- Når en kjerne med interessante funksjoner (DNA skade spor eller DNA-reparasjon foci) er funnet, bytte til energifiltreringsmodus og spille inn en tykkelse kartet.
MERK: Denne prosedyren omfatter innspillingen av en null-tap og en ufiltrert bilde. Tykkelser opp til 0,3 midlere fri veilengde (30% av elektronene i den innfallende strålen blir spredt av prøven) er tynne nok til å skape gode elementkart. - Postgrad kart av elementene fosfor og nitrogen ved hjelp av programvaren som styrer energien filteret i mikroskop. Spill fosfor kart post edge bilder på 175 eV energitap de med en spalte bredde på 20 eV og pre-edge bilder på 120 eV energitap, også med en spalte bredde på 20 eV. For nitrogen maps, plate post edge bilder på 447 eV med en spaltebredde på 35 eV og pre-edge bilder på 358 eV, også med en spalte bredde på 35 eV.
MERK: Siden innholdet i de fotografert elementer (fosfOrus og nitrogen) er relativt lavt (ca. 1%), velg "Ratio Image" (kvalitativ elementært kart) over "3-vinduet metoden" (quantitate elementært kartet) for å generere bilder med et bedre signal til støyforhold.
6. Bildebehandling
- Åpne de elementære ratio kart i et bildebehandlingsprogram som kan håndtere filformatet av de oppkjøpte bilder (f.eks Digital Micrograph). Kopier kartet nitrogen inn i den røde kanalen og fosfor kartet i den grønne kanalen av et RGB-bilde, og deretter sammenligne med og justere kartene.
- Eksportere det sammensatte bildet som en Tagged Image File Format (TIFF-fil). Åpne bildet i et bildebehandlingsprogram som kan bruke lag (for eksempel Photoshop).
- Juster det dynamiske området for hver kanal ved å omskalering minimums- og maksimumsverdiene i bildet til en 8-bits datasett (0 til 255).
- Trekk fra fosforinnholdet fra kartet til nitrogen (ved å bruke"Lag" vindu) for å generere en kvalitativ kart som viser fordelingen av proteinet.
- Konvertere kartene i det nukleinsyre (fosfor) og protein (nitrogen) som ble opprettet i forrige trinn i "begrensede farger" og lage en gul oppslagstabellen i CMYK fargerom for kart som viser nukleinsyre distribusjon og en cyan søketabellen for å vise den ikke-nukleoprotein kartet. Fargene er valgt for å gi maksimal kontrast mellom de to elementkart.
- Opprett et nytt bilde og importere kart som viser fordelingen av fosfor og protein som forskjellige lag. Bruk "screen" åpenhet modus for å se begge lag oppå hverandre.
- Åpne null-tap image ervervet i trinn 5.2. Dette ikonet viser et bilde av den innspilte området som ser ut som en vanlig TEM bilde, men bare inneholder elektroner som har gått gjennom prøven uten å kollidere med prøven. Exportdette bildet som et TIFF-bilde.
- Åpne den eksport null tap bilde i et bilde editor og kopiere den inn i det øverste laget av bildet som viser elementære kartet. Juster bildeposisjonen med "screen" åpenhet modus.
- Eventuelt terskel null-tap bilde for å segmentere signalet som stammer fra miniSOG. Tilsett resulterende bildet som et separat lag som er beskrevet ovenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ESI
Sammenligning av ESI bilder av kjernen (figur 1) med de konvensjonelle TEM bilder (f.eks Figur 7-1) viser en dramatisk økning i anatomiske strukturer som kan være lett skilles. De kromatin rygger vises i gult, og det er ganske lett å identifisere chromocenters i museceller. Nucleoli lett kan skilles fra kromatin ved sin runde struktur og annen farge, fordi de formonterte ribosomer som allerede inneholder store mengder protein, som er rik på nitrogen, i tillegg til den RNA, som er rik på fosfor. Den perifere kromatin befinner seg som et tynt lag på grensen mellom kjernen og nukleære porer kan sees som nitrogenrike strukturer som avbryter den perifere kromatin. Ofte lamina kan sees som et meget tynt blå lag utenfor den perifere kromatin. I cytoplasma, mange små partikler som er rike på fosfor kansees. Disse kan identifiseres som ribosomer basert på deres størrelse, mengde og plassering utenfor kjernen. Den interchromatin plassen kan bli sett på som den proteinrikt område som ligger mellom kromatin. Denne inneholder atom organer og områder som er rike i små gule signaler, for eksempel ribonukleoproteinpartikler og klynger av ribonukleoproteinpartikler granuler (figur 2). De sistnevnte betegnes interchromatin granule klynger, og karakteristisk er anriket på proteiner som kreves for pre-mRNA-spleising. Figur 1B, C og D illustrerer utseendet av andre kjente konstruksjoner, for eksempel mitotiske kromosomer, mitokondrier og centrosomes sentromerer. I figur 2 er fremgangsmåten brukes til å generere farge sammensatte bilder fra de rå elementære forholdskart oppsummert. Sammenslåing kartet fosfor (grønn) og kartet nitrogen (rød) i RGB-fargerommet (øverste rad) gjør en bedre vurdering av mengder av disse elementene i utvalget. However, subtrahere fosfor signal å utarme bidraget fra nukleinsyre holdige strukturer fra kartet nitrogen for å gi kartet protein (cyan) og sammenslåing det med kart fosfor (gul) i CYMK fargerommet gir en mer distinkt visuell representasjon av nucleoprotein og ikke-nucleoprotein (nedre rad). Dette gjør at de data som skal lettere forstås av personer som er kjent med teknologien.
Laser microirradiated celler som uttrykker MDC1, 53BP1 og Rad52
På grunn av den brukerdefinerte størrelse, form og plassering av laser skader spor, regionen DAB deponering i laser microirradiated cellene er meget lett å finne i TEM ved bruk av miniSOG system. Bilder tatt ved lav forstørrelse transmisjonsmodus (dvs. konvensjonell lysfelt TEM) viser de karakteristiske skader spor og kan sammenlignes med data som ble tatt opp med et fluorescensmikroskop før innebygging.Dette er spesielt nyttig dersom korrelerende mikroskopi er beregnet, siden den tillater lett identifisering og flytting av enkeltkjerner. (Figur 2-4).
Det første eksempelet (figur 3) viser et U2OS cellelinje som stabilt uttrykker MDC1 miniSOG-mCherry. I en laser microirradiation eksperiment, rekruttering av MDC1 inneholder miniSOG og mChrerry tags var svært lik GFP-merket versjoner av dette proteinet (data ikke vist). Fikse cellene en time etter at DNA-skade induksjon og forbereder utvalget for TEM ble MDC1 skade sporene lett identifiseres i de ultra-tynne snitt i normal TEM modus som mørke striper på tvers av kjerner, noe som tilsvarte veldig godt til fluorescens data ( Figur 3-5). Når man ser på fordelingen av proteinet, kan en klar økning i nitrogen signal observeres ved laser-skadede områder. Det må her påpekes at dette er hovedsakelig forårsaket av den polymeriserte diami nobenzidine, som er rik på nitrogen og forsterker signalet for miniSOG tagget reparasjon protein, snarere enn utelukkende gjennom oppbygging av reparasjons proteiner i skader spor. Sammenligning av kromatinstruktur i resten av kjernen med strukturen i skaden sporene viser en tydelig forskjell. Den skadede kromatin (som er vist innenfor de stiplede linjer i figur 3) vises mer decondensed i motsetning til kromatin ikke-bestrålt, som forekommer i tykke rygger i nukleoplasma. Innenfor skaden spor, atom organer (200-300 nm) (markert med piler i Figur 3 II2, IIb, IIc og IIIa) som er rike på MDC1-miniSOG protein, men fri fra nukleinsyre kan også observeres. Det ville være svært utfordrende å definere disse kjernefysiske organer som kromatin frie strukturer uten denne teknikken. Det foreslår også et ekstra nivå av kompleksitet til skadesteder som ikke er spådd av den kjente biokjemi MDC1.
ntent "> Ser på skade sporene av 53BP1 (figur 4) som ble opprettet ved hjelp av de samme vilkår som tidligere beskrevet skader i MDC1-transfekterte celler, kan svært like resultater holdes. Signalet som ble produsert av fotooksidasjon av den miniSOG var overfylt og fylt opp plassen mellom foldene av kromatin. sterkt farget atom organer kan også observeres (markert med en pil i figur 4 D, E, F).Fra eksperimenter med Rad52-GFP konstruksjoner, er det kjent at Rad52 vil danne små lyse microcompartements 24 langs en laser-indusert skade spor. På grunn av oppløsning grense på konvensjonelle lysmikroskoper det, har det vært uklart hvor store disse strukturene egentlig er og hvordan de forholder seg til den skadede DNA. Ser på TEM bilde av laser-bestrålt U2OS kjerner konstitutivt uttrykker Rad52-miniSOG-mCherry, ble størrelsen på disse organene målt til å være i gjennomsnitt (150-250 nm). det erenda mer overraskende å se på disse foci med ESI. I motsetning til de foregående eksempler, de Rad52-miniSOG-mCherry foci synes å være for ulikt langs skader spor og synes å være kompakt atomkroppslignende strukturer som består av protein og ikke har noen påvisbare nukleinsyrer i deres indre. Basert på å se på nuklein-syre / protein-forhold på de skadede områder som oppnås med vår samlede miniSOG og ESI tilnærming, foreslår vi at DNA-reparasjon kan finne sted på overflaten av foci heller enn i det indre.
Den nederste bilde i Figur 5 viser resultater i likhet med fig 3-III. Kromatinet i det skadede området synes å være mer decondensed forhold til kromatin i de ikke-bestrålte områder (se område skissert av røde streker).
Gammabestrålt celler
Mens laser mikro-bestråling er et praktisk verktøy for å quickly test proteiner som inneholder et fluorescerende tag for rekrutteringen til områder av DNA-skader, skaper det store mengder kompleks skade (dobbelttrådbrudd, enkelttrådbrudd, basen skade, og cyclopyrimidine dimer) 25. For å studere kamrene som danner rundt DNA dobbelttrådbrudd mer direkte, vi undersøkte DRFs som danner rundt enkelt DSB sin ved å utsette celler til gammastråling.
U2OS celler som stabilt uttrykker 53BP1-miniSOG-mCherry ble utsatt for to Gy av gammastråling og fikset en halv time etter bestråling. Det karakteristiske mønster av store brennpunkter fordelt gjennom nukleoplasma kunne iakttas (fig 6Ia). Etter fotooksidasjon av diaminobenzidin, kan mørke flekker vekst på posisjoner hvor de fluorescente signalene mCherry ble plassert i fluorescens mikrofotografier sees i elektronmikro (fig 6Ib og c). Disse plassene kan være korrelert TEM-bildersom ble tatt ved lav forstørrelse (fig 6Id og e). ESI bilder av disse brennpunktene, noe som syntes å være omtrent 1 til 1,5 mikrometer i diameter, viser en interessant struktur. Tynne tråder av kromatin syntes å være ispedd 53BP1 protein på ca to ganger tykkelsen.
I andre forsøk, ble cellene eksponert for en høyere mengde av stråling og festet ved senere tidspunkter (etter 3 timer og 6 timer, henholdsvis) for å generere større brennpunktene, og lette å finne dem i ultra-tynne snitt (figur 7). Fordi vi er i stand til å kartlegge hver nukleoprotein og protein, avslører ESI at strukturen av foci synes å reorganisere seg over tid. Den relative mengde av 53BP1 protein i fokus synes å øke, mens kromatin tar en mer perifer posisjon.
Siden 53BP1 foci vises også i ikke-bestrålt celler som "kryptiske foci" i G1 celler på nettstedene til under-replikered DNA 26,27, ble disse foci også avbildes. Disse kryptiske foci synes å huse store mengder protein i forhold til stråling induserte foci og vis en interessant vanlig struktur av kromatin.
Således visualisere DNA-reparasjons foci bestanddeler ved hjelp av miniSOG metoden bidrar til å identifisere regioner av DNA-skade og for å kartlegge fordelingen av den merkede reparasjon protein i forhold til kromatin.
Figur 1. Oversikt over strukturer som kan observeres i et ESI bilde Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
(A) ESI bilde av en mus embryonale fibroblast. Kromatin rygger (gul) er omgitt av nukleoplasma (cyan) fylle opp interchromatin spess. Kjernen er omgitt av perifere heterochromatin og chromocenters (nederst til venstre) som blir avbrutt av kjernefysiske pore komplekser (cyan). Den nucleoli kan være klart atskilt med sin farge. Dette skyldes det faktum at mengden av protein i forhold til nukleinsyre er høyere i nukleolært struktur enn det er i kromatin. Utenfor kjernen, kan mitokondrier og ribosomer (rik på nukleinsyre) lett kan identifiseres.
(B) Bilde av en kjerne og centrosomes (se pilene), som kan sees som hule proteinrike partikler i det øvre venstre i bildet.
(C) Tverrsnitt gjennom en metafase plate. De kondenserte metafase kromosomer har justert til en disk som spenner fra øvre venstre hjørne til nedre venstre hjørne. Høye konsentrasjoner av nitrogen er synlige på overflaten av enkelte kromosomer. Disse områdene er de kinetochores (se pilene).
(Øvre rad) De to første bildene i raden viser forholdet kart av fosfor og nitrogen. Det siste bildet i øverste raden viser disse elementære kartene lagret i RGB-fargerommet. Gule strukturer representerer nucleoproteins, som gjenspeiler tilstedeværelse av både fosfor og nitrogen. (Nedre rad) Det første bildet viser kartet av fosfor, noe som først og fremst viser fordelingen av nukleinsyre i prøven. Den midterste bildet viser fordelingen av nukleinsyre-utarmet / negative sliter menn ctures. Det ble beregnet ved å subtrahere fosfor kart fra nitrogen. Den nedre høyre bilde viser en fletting av nukleinsyren kartet og proteinet kartet i subtraktiv fargerommet. Denne farge kompositt skal brukes til å hjelpe til med identifisering av individuelle strukturer, og å klassifisere dem som nucleoprotein eller ikke nukleoprotein. Den kvantitative opplysninger om fosfor og nitrogen overflod bør samles visuelt fra nettet fosfor og netto nitrogen gråtoner kart eller fra kompositter generert ved hjelp av additive farger, for eksempel i den øverste raden. 
Figur 2. Opprettelse av et multi-farge ESI bilde 
Figur 3. Laser micro bestråling av U2OS celler som stabilt uttrykker MDC1-miniSOG-mCherry. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
(II) området, markert med en grønn firkant i Ic ble forstørret og vist i normal modus girkasse (IIa) og ESI (IIb). Lic viser en overlapping av ESI bilde med signal av skaden sporet. Skaden sporet signal ble oppnådd ved den øvre terskelbildet.
(III) Eksempler på strukturen av laser mikro-irradiated kromatin og kromatin utenfor laser skadede området.
Figur 4. Laser micro bestråling av celler som stabilt uttrykker 53BP1-miniSOG-mCherry. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Venstre kolonne: (A) Fluorescens, (B) Konvensjonell TEM, og (C) ESI bilde av de samme laser mikro bestrålte kjerne.
Høyre kolonne: (D) Konvensjonell TEM, (E) ESI og (F) Overlegg av ESI bildet med miniSOG signal som ble segmentert etter thresholding av (D) (se trinn 6.10)
Figur 5. U2OS cellelinje som stabilt uttrykker Rad52-miniSOG-mCherry og skadet av laser-micro-bestråling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
(A) Overlegg av en fluorescens bilde med en lav forstørrelse TEM bilde som viser en laser microirradiated U2OS kjernen med en skade spor nederst til venstre.
(B) Representant confocal fluorescens mikroskopi bilde av en laser mikro bestrålt Hoechst-farget kjerne (blå) uttrykker Rad52-miniSOG-mCherry viser karakteristisk mønster av små foci langs skade spor (rødt signal).
(C) Konvensjonell TEM, (D) ESI,
(G) ESI bilde av en annen U2OS kjerne som stabilt uttrykker Rad52-miniSOG-mCherry viser en laser-induserte skader spor i sammenheng med hele kjernen.
Figur 6. U2OS celler som stabilt uttrykker 53BP1-miniSOG-mCherry bestrålt med 2 Gy og løst etter 30 min. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
(I) a) Fluorescens bilde som viser den induserte gammabestråling 53BP1 foci. b) Fallende lys bildet etter fotopolymerisering. c) Overlay av fluorescens med det utsendte lyset bildet. d) Lav forstørrelse TEM bilde (svart stripe er en TEM grid bar). e) Overlay av fluorescerende bilde med lav forstørrelse TEM bilde.
(II) Skade fokus som er merket med en stjerne i det overførte lys bilde tatt opp i normal TEM og i ESI-modus. a) Null-tap, b) ESI, c) fosfor, d) Protein e) Overlay ESI og segmenterte signalet fra null-tap bilde.
(III) Skade fokus merket med et kors i fluorescens bilde som er tatt i normal TEM og i ESI modus. a) Null-tap, b) ESI, c) fosfor, d) Protein e) Overlay ESI og segmenterte signalet fra null-tap bilde.
Figur 7. Endringer i foci struktur mellom brennpunktene etter ulike tider av bestråling. < / strong> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
U2OS 53BP1 miniSOG mCherry celler eksponert for 6 Gy av gammastråling fast etter 3 timer (1A-E, FJ) og 6h (2A-E, FJ) respektivt. 3 viser en ubestrålt U2OS 53BP1 miniSOG mCherry nucleus viser en kryptisk fokus (AE). ESI bildene er presentert i den rekkefølgen ESI (nukleinsyre og protein), nukleinsyre (alene), protein (alene), ESI (nukleinsyre og protein) + segmenteres miniSOG signal.
Figur 8. DNA-reparasjon foci er fortsatt synlige i vanlig sendemodus når innlegget fiksering med osmiumtetroksyd er utelatt. arge.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ultratynne seksjon (50 nm) av en U2OS kjerne som viser to 53BP1 foci fra en prøve som ikke var behandlet med osmiumtetroksyd. (A) I konvensjonell TEM-modus, er det mulig å se områder farget med DAB polymeren selv uten å øke kontrast med heavy metal flekken. (B) Kontrasten av foci kan bli ytterligere forbedret ved å ta null-tap bilder (filtrere bort alle elektroner som opprinnelse fra flertall spredning hendelser).
Figur 9. Fastsettelse av de optimale energivindusinnstillingene for kartlegging fosfor
(A) Elemental ratio kartet registrert for fosfor med post kanten på 155 eV og pre-edge på 120 eV.
innhold "> (B) Elemental ratio kartet registrert for fosfor med post kanten på 175 eV og pre-edge på 120 eV.(C) Beregning av fosfor-forhold kart fra et konstant forhånds kant vindu ved 120 eV energitap og en variabel etter kant vindu som strekker seg fra 140-200eV energitap for å bestemme den beste kombinasjon som er i kontrast. Intensiteten forskjell på de smarteste og den dimmestpixel i en line-scan som spenner over samme fosfor rik og fosfor fattig region viser høyeste kontrastverdier (Dynamic Range) når en post-edge bilde av 175 eV energitap ble valgt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ESI kan tjene som et utmerket verktøy for å undersøke ulike tilstander av kromatin og ribonucleoproteins i kjernen, fordi det er i stand til å spesifikt kartlegge områder som er rike på fosfor. Det forsterker dypt mengden detaljer som kan oppnås ved et elektronmikroskop, og er ikke avhengig av ikke-spesifikke kontrast metoder. En ulempe ved ESI er at den krever tynnere partier enn konvensjonell TEM på samme akselererende spenning. Dette kan løses ved å jobbe med seriesnitt eller bruke tomographic metoder 28.
Selv om mye informasjon kan fås ved å se på fordelingen av fosfor og nitrogen, er det av interesse å være i stand til også å kartlegge fordelingen av visse proteiner. Med fremgangsmåten som presenteres i denne artikkelen, ble det vist at ESI kan kombineres med fremgangsmåter som er basert på den setespesifikke polymerisering av diaminobenzidin. Selv om denne metoden ikke legge en full ny farge til ESI, er det helt klart nyttig å kartlegge utbredelsen av et protein. Dette gjelder spesielt proteiner som samhandler med kromatin. Hvis en studie må visualisere mer enn ett protein befolkningen, kan merking metoder ved hjelp av en immun fortsatt brukes når den brukes som pre-embedding flekker, før fotooksidasjon 9. Sammenlignet med stabile cellelinjer, transiente transfeksjoner har den ulempe at ekspresjonsnivåene kan variere betydelig mellom cellene, og dermed gjøre det vanskelig å finne flere celler som uttrykker lignende mengder av det kodede protein. Derfor er etablering av stabile cellelinjer anbefalt. Imidlertid er det mulig å bedømme den relative mengden av protein ekspresjon ved hjelp av fluorescens bildebehandling og velger celler med et mellom følgende transient transfeksjon.
Selv om miniSOG fusjon tag er fluorescerende seg selv, er dens kvanteutbytte betydelig verre enn GFP (0,37 vs 0,6) 10. For purpose av samsvarmikroskopi, og legger til en ekstra fluorescerende protein tag som mCherry tillater avbildning i levende celler uten produksjon av singlet oksygen som oppstår med miniSOG eksitasjon. Ekspresjonsnivået av miniSOG-merkede proteiner, kan mengden av oksygen i DAB-inneholdende buffer, og pH påvirker også hastigheten på fotooksidasjon. Noen ganger kan det være ganske problematisk å oppnå homogen fotooksidasjon i området av interesse på grunn av den lette avhengighet av foto-oksidasjonsreaksjonen. Langvarig fotooksidasjon kan føre til ikke-spesifikk farging og avsetning av for mye tungt metall i prøven, noe som kan vanskeliggjøre deteksjon av element-spesifikke signaler ved ESI. Den fotooksidasjon prosessen er ganske tidkrevende, slik at vanligvis bare en meget liten region inneholdende noen få celler på dekkglass blir vanligvis farget.
Vi har vist at kombinasjonen av miniSOG merkede proteiner med ESI ved hjelp av et monolag av et vedheftende human kreftcellelinje. I prinsippet kan fremgangsmåten også anvendes på en hvilken som helst annen prøve (gjær, bakterier, vev, embryo) så lenge det er mulig å uttrykke miniSOG-kodede protein på et rimelig nivå, og så lenge gjennomskinnelighet og diffusjon av oksygen og DAB er tilstrekkelig høy til å tillate skikkelig fotooksidasjon og dermed homogen farging. For suspensjonsceller, ville det være fordelaktig å fastsette plasseringen av celler på et dekkglass ved hjelp av et klebemiddel slik som poly-L-lysin. For tykkere prøver, vil målene med lavere numerisk apertur oppnå en mer homogen belysning, men tar lengre tid å foto oksidere.
Vi har presentert bruken av miniSOG-merkede fusjonsproteiner som i nærheten av den opprinnelige protokoll publisert av Shu et al 10 som mulig -. Herunder bruk av osmiumtetroksyd. Det det kunne observeres at, bortsett fra fortrinnsvis å avsette på DAB-polymerer og membraner, viser osmiumtetroksyd noen reaktivitet ogavsetning på mesteparten av det biologiske materiale i prøven (10 figur 3). Osmiumtetroksyd har en elementær kant på 45 eV. Dette signalet og dets plasmons kan legges over elektronenergitapet spektrum som tykkelsen av prøven øker og enkelt elektroner gjennomgå mange energitapshendelser under passasje gjennom prøven. Dette kan begrense kvaliteten av fosforelementkart ved høye konsentrasjoner OsO 4 blir brukt i prøvepreparering. Konsentrasjonene som vi har brukt her, som er betydelig lavere enn det som tidligere ble brukt 10, tillot generasjon av god kvalitet fosfor kart. I et eksperiment ved hjelp miniSOG tagget proteiner som krever høyere OsO 4 konsentrasjoner, vil den beste konsentrasjonen som fortsatt tillater god fosfor kartet skapelse må bestemmes empirisk.
Vi har funnet at DAB polymeren som dannes ved den DNA-reparasjon foci er sufficiently tett for å bli sett på konvensjonell TEM-modus (eller i null-tap modus med enda bedre kontrast) selv når etterfiksering med osmiumtetroksyd er utelatt (se figur 8). Segmentering av signalene som ble registrert på denne måten ble så robust som ved hjelp av de prøvene som ble behandlet med osmium. Avhengig av kjerneprotein som skal visualiseres, størrelsen av strukturene danner, og nødvendigheten av å visualisere membransystemer, anvendelse av osmiumtetroksid kanskje ikke være nødvendig, og utelatelse vil fjerne muligheten for maskering av elementære signatur av fosfor.
Sammenlignet med andre publikasjoner som bruker ESI 18,29,30 har vi brukt forskjellige innstillinger for pre- og postmoderne bilder for å generere elementære ratio kart med minst mulig støy. Vi har bestemt empirisk innstillingene som er presentert i manuskriptet (se figur 9). De valgte innstillingene rundt kantene bør føre til rette elementale kart med mindre inkasso vinduer er overlappende med andre elementer som er tilstede i prøven. I vårt tilfelle, kan svovel være et slikt element. Ettersom konsentrasjonen av svovel (som oppstår i aminosyrene metionin og cystein) er svært lav, og bidrar til den beregnede kartet bare i en ubetydelig mengde, tror vi at bedre S / N-forhold som vi oppnådd ved hjelp av de innstillinger som brukes her oppveier ulempene som kan oppstå fra spor av svovel i prøven.
Vi avslørte ultrastructure av DRFs på nanometer oppløsning ved hjelp av DNA-reparasjonsproteiner MDC1, 53BP1 og Rad52 kombinert med ESI og TEM teknikker. Organiseringen av kromatin og individuell DSB reparasjon protein lokalisering ble løst ved hjelp av denne tilnærmingen. Sin lokalisering i områder som er rike på DNA-lesjoner etter laserbestråling mikro-DNA og tendensen av reparasjons proteiner for å fylle rommet mellom ryggene kromatin ble vist. I tilfelle av Rad52, som plays en rolle ved homolog rekombinasjon, kan dannelsen av atomkroppslignende sfæriske strukturer langs laser skadede spor observeres, og dette var i motsetning til de to andre testede proteiner. Når skaden er påført av gammastråling, dannet 53BP1 foci rundt den skadede kromatin. Den relative sammensetning og plasseringen av kromatin og protein i brennpunktene synes å endre seg over tid. Forholdet mellom disse proteinene og skadet kromatin samt endringer i organiseringen av kromatin og sammensetning av atom organer kan lett oppnås ved hjelp av ESI teknikk mens konvensjonell lysfelt mikroskopi ved hjelp av uran og bly som kontrasterende midler kan ikke vurdere disse egenskapene direkte. Således, viser denne teknikken høyt potensial for studiet av struktur-funksjonsforhold, særlig for prosesser som virker på DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Gridded 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-2-14-CGRD | not made for immersion objectives |
| LR White: acryl resin | emsdiasum | 14381 | |
| LR White accelerator | emsdiasum | 14385 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets | Sigma | D5905 | |
| Slim Bar Grids 300 Mesh | SPI | 1161123 | |
| Tungsten-Point Lab Pen | emsdiasum | 41148 | |
| Osmium Tetroxide | emsdiasum | 19100 | |
| Carbon Coater 208 carbon | Cressington | ||
| Ultra microtome Leica EM UC6 | Leica | ||
| Photoshop CS5 | Adobe | might even work with older versions | |
| Digital Micrograph V.2.30 | Gatan | might even work with older versions | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H-1399 | |
| Effectene | Quiagen | ||
| MiniSOG-Constructs | Tsien-Lab | tsienlab@yahoo.com | |
| MDC1 miniSOG mCherry | |||
| 53BP1 miniSOG mCherry | |||
| Rad52 miniSOG mCherry | |||
| cesium 137 radiation source "MARK 1" | (J.L. Shepherd & Associated) | ||
| ImageJ/FiJi | open source | http://fiji.sc/Fiji | |
| 2 ml Eppendorf tubes | Fisherbrand | 05-408-146 | |
| Diamond Knife ultra 35° | Diatome | ||
| Trimming Knife ultratrim | Diatome | ||
| Sodium cacodylate trihydrate | emsdiasum | 12300 | Caution Toxic! |
| Glutaraldehyde EM Grade 8% | emsdiasum | 16020 | Caution Toxic! |
| Sodium phosphate dibasic | emsdiasum | 21180 | |
| Sodium phosphate monobasic | emsdiasum | 21190 | |
| Paraformaldehyde | emsdiasum | 19202 | |
| Osmium tetroxide 4% solution | emsdiasum | 19150 | |
| Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Hydrochloric Acid | Fisherbrand | A142-212 | |
| Sodium Hydroxide Solution 10M | Fluka | 72068 | |
| Oxygen | Medigas | ||
| 3-Amino-1,2,4-triazole | Sigma | A8056 | |
| Potassium cyanide | Sigma | 207810 | Caution Toxic! |
| Ethanol | emsdiasum | 15058 | Caution Toxic! |
| Razor blade Single Edge Carbon Steel | emsdiasum | 71960 | Caution Sharp! |
| DMEM | Sigma | D 5546 | |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | |
| G418 | Life Technologies | 11811-023 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Transmission Electron Microscope 200 kV | JEOL | 2100 | |
| GIF Tridiem 863 Energy filter | Gatan |
References
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).
- Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. Stoichiometric analysis of protein- and nucleic acid-based structures in the cell nucleus. Micron (Oxford, England: 1993). 30, 151-157 (1999).
- Michael J Hendzel, F. M. B., Bazett-Jones, D. P. Direct Visualization of a Protein Nuclear Architecture. Molecular biology of the cell. 10, 2051 (1999).
- Ottensmeyer, F. P., Andrew, J. W. High-resolution microanalysis of biological specimens by electron energy loss spectroscopy and by electron spectroscopic imaging. Journal of ultrastructure research. 72, 336-348 (1980).
- Leapman, R. D., Ornberg, R. L. Quantitative electron energy loss spectroscopy in biology. Ultramicroscopy. 24, 251-268 (1988).
- Simon, G. T. Electron spectroscopic imaging. Ultrastructural pathology. 11, 705-710 (1987).
- Egerton, R. Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , Springer. (2011).
- Aronova, M. A., Kim, Y. C., Zhang, G., Leapman, R. D. Quantification and thickness correction of EFTEM phosphorus maps. Ultramicroscopy. 107, 232-244 (2007).
- Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. Chimeric molecules employing horseradish peroxidase as reporter enzyme for protein localization in the electron microscope. Methods in enzymology. 327, 35-45 (2000).
- Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS biology. 9, e1001041 (2011).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science (New York, NY). 296, 503-507 (2002).
- Fernandez-Capetillo, O., Celeste, A., Nussenzweig, A. Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors. Cell cycle (Georgetown, Tex). 2, 426-427 (2003).
- Haaf, T., Golub, E. I., Reddy, G., Radding, C. M., Ward, D. C. Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 2298-2302 (1995).
- Maser, R. S., Monsen, K. J., Nelms, B. E., Petrini, J. H. hMre11 and hRad50 nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 17, 6087-6096 (1997).
- Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA repair. 9, 1219-1228 (2010).
- Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. Journal of cell science. 125, 3529-3534 (2012).
- Dellaire, G., Kepkay, R., Bazett-Jones, D. P. High resolution imaging of changes in the structure and spatial organization of chromatin, gamma-H2A.X and the MRN complex within etoposide-induced DNA repair foci. Cell cycle (Georgetown, Tex). 8, 3750-3769 (2009).
- Kruhlak, M. J., et al. Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks. The Journal of Cell Biology. 172, 823-834 (2006).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor protocols. 2010, (2010).
- Zeyda, M., Borth, N., Kunert, R., Katinger, H. Optimization of sorting conditions for the selection of stable, high-producing mammalian cell lines. Biotechnology progress. 15, 953-957 (1999).
- Dellaire, G., Nisman, R., Bazett-Jones, D. P. Correlative light and electron spectroscopic imaging of chromatin in situ. Methods in enzymology. , 375-456 (2004).
- Campbell, S., Ismail, I. H., Young, L. C., Poirier, G. G., Hendzel, M. J. Polycomb repressive complex 2 contributes to DNA double-strand break repair. Cell cycle. 12, 2675-2683 (2013).
- Mortusewicz, O., et al. Recruitment of RNA polymerase II cofactor PC4 to DNA damage sites. J Cell Biol. 183, 769-776 (2008).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173, 195-206 (2006).
- Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Frontiers in genetics. 4, 135 (2013).
- Lukas, C., et al. 53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress. Nature. 13, 243-253 (2011).
- Harrigan, J. A., et al. Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells. The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).
- Aronova, M. A., et al. Reprint of 'Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST). J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).
- Fussner, E., et al. Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming. The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).
- Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin. Cell cycle. 10, Georgetown, Tex. 308-322 (2011).
