Visualisering av miniSOG Tagged DNA Repair Proteiner i kombinasjon med Electron Spektroskopiske Imaging (ESI)

Summary

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Abstract

Grensene for optisk oppløsning og utfordringen med å identifisere spesifikke protein populasjoner i transmisjonselektronmikroskopi har vært hindringer i cellebiologi. Mange fenomener kan ikke forklares ved in vitro-analyse i forenklet system og trenge ytterligere strukturell informasjon in situ, særlig i området mellom 1 nm og 0,1 nm, for å bli fullt ut forstått. Her elektron spektroskopiske imaging, en transmisjonselektronmikroskopi teknikk som tillater samtidig kartlegging av fordeling av proteiner og nukleinsyrer, og et uttrykk tag, miniSOG, kombineres for å studere struktur og organisering av DNA dobbel tråd pause reparasjon foci.

Introduction

Til tross for de betydelige fremskritt i lysmikroskopi over de siste ^år 1, cellebiologer fortsatt lider av et gap i oppløsning. Dette begrenser forståelsen av struktur-funksjon relasjoner i fundamentale cellulære prosesser som innebærer koordinert samspill mellom makromolekylære komplekser (f.eks i kromatin remodellering, DNA-reparasjon, RNA transkripsjon og DNA replikasjon). Selv om transmisjonselektronmikroskop (TEM) s tilveiebringe den ønskede oppløsning, har det vært vanskelig å definere disse prosessene strukturelt på grunn av manglende evne til å merke spesifikke proteiner og samtidig være i stand til å bestemme den biokjemiske sammensetningen av de visualiserte strukturer. I fravær av interne membraner for å skille kjernestrukturer, har kjernen vært spesielt vanskelig. Elektron spektroskopiske imaging (ESI) løser noen av disse begrensningene ved å tillate samtidig deteksjon og differensiering av DNA, RNA, og protein baserte atomstrukturer ^2-5.

Electron spektroskopiske bildebehandling:

For å kartlegge elementære distribusjoner med høy følsomhet og oppløsning i elektronmikroskop, kan man bruke en avbildning spektrometer som velger elektroner som har blitt uelastisk spredt gjennom samhandling med indre skall elektroner av et element i prøven ^6. Fordi element-spesifikke energimengder går tapt som følge av ionisering av atomer i prøven, kan disse elektroner separeres og visualisert ved bruk av et spektrometer som er festet til den elektronmikroskop. Således analyse av spekteret for de elektroner som har interaksjon med prøven avslører kvalitativ og kvantitativ informasjon om elementsammensetningen av prøven ^7. Elektroner som ikke mister energi når de passerer gjennom prøven er funnet i "null-tap peak" av elektron energitapspektrum. Den mengde av disse elektronene er relatert til masse, tetthet og tykkelse for prøven, og består av elektroner som passerer gjennom prøven uten å kollidere med prøven eller å miste energi under passasje gjennom prøven. Denne informasjonen kan være nyttig for absolutt mengdebestemmelse av antallet av atomer av et spesifikt element som er tilstede i prøven ^8.

Siden biologisk materiale består hovedsakelig av lette elementer som dårlig avbøyer elektronene i den innfallende strålen av TEM, farvemetoder ved hjelp av tungmetall-salter har til å bli brukt for å generere kontrast i prøven. Mangelen på spesifisitet for de fleste av disse kontrastmidler og manglende evne til å visualisere mer enn en flekk der spesifisitet er mulig har begrenset verdi av konvensjonell elektronmikroskopi i studiet av kjernen. ESI har betydelige fordeler fremfor konvensjonelle TEM, særlig for studiet av strukturer av cellekjernen.Det er mulig å utnytte den fosfor-rike karakter av DNA- og RNA-inneholdende makromolekylære komplekser for å skille nukleoprotein komplekser fra proteinkomplekser og å løse forskjellige nukleoprotein komplekser basert på deres tetthet av nukleinsyrer. Det gjenværende biologiske materialet kan avbildes på grunnlag av dens overflod av nitrogen. Kartlegging bare disse to elementene og analyse av deres utbredelse og relativ overflod innenfor ulike anatomiske strukturer gir oss mye informasjon om kjernen. For eksempel, er det lett å identifisere kromatin og ribosomene i kartet som representerer fosfor overflod. Den interchromatin plass, pore atomkomplekser, og atom legemer, på den annen side, kan lett oppdages i nitrogenkartbildet.

Mini singlet oksygen generator system (miniSOG)

Mens ESI representerer en kraftfull teknikk for å studere in situ kromatinstruktur fordi det tars Fordelen med de karakteristiske prosenter i elementsammensetningen mellom fosfor og nitrogen, elementsammensetningen vanligvis ikke kan brukes for å diskriminere mellom forskjellige populasjoner av proteinkomplekser. Antistoffer merket med små gullpartiklene i nanometer har blitt mye brukt for å kartlegge plasseringen av individuelle molekyler. Siden gull partikkel er vanligvis festet til et sekundært antistoff, vil den vises i en omkrets på omtrent 20 nm rundt detektert av det primære antistoff epitop. I post-embedding prøver, kan antistoffer bare gjenkjenne epitoper som er eksponert på overflaten av seksjonene. Mens det er mulig å påvise nærværet av et antigen og relatere den til en viss anatomisk struktur av cellen, er informasjonen som er innhentet er ufullstendig, fordi de fleste av de epitoper blir skjult av harpiks. Pre-innebygging teknikker, som benytter tilsvarende protokoller som dem som anvendes for fluorescens mikroskopi, gi tilgang til antigener i helehele dybden av prøven, men permeabilization trinnene som er nødvendige for å tillate antistoffet å trenge inn i cellen vanligvis krever fjernelse av lipid-membraner og fjerne komponenter som ikke kan fastsettes av aldehyder. Videre er det foretrukne aldehyd fiksativ for ultra bevaring, glutaraldehyd, ødelegger ofte epitoper, og følgelig er paraformaldehyd vanligvis nødvendig. Dette er mindre effektiv ved protein-proteintverrbinding. En annen ulempe med antistoffer som er merket med en gull nanopartikkel er at gull er et meget elektron-tette materiale som skaper en sterk kontrast som kan skjule interessante strukturelle detaljer av prøven, som har svakere kontrast.

Fremveksten av den grønne fluorescerende protein (GFP) som uttrykte protein tag har endret bruk av fluorescens mikroskopi for å svare på spørsmål i cellebiologi. Tagging et protein med en liten fluorescent domene tillater kartlegging av sin distribusjon in vivo </em> uten behov for permeabilization prosedyrer som kan endre strukturen. For å oversette den elegante prinsippet om å bruke protein koder for å kartlegge proteinfordelinger i en celle til elektronmikroskopi, ble et system som trengs som er i stand til å produsere et signal nær strukturen av interesse og generere kontrast i TEM. Polymerisert diaminobenzidin er en flekk som ofte brukes i histologi å påvise antistoff binding. Denne beis er vanligvis avsatt ved hjelp av pepperrot-peroksidase (HRP) konjugert til et sekundært antistoff. Selv om reaksjonen gir et pålitelig resultat, er HRP ikke er katalytisk aktiv i cytosol av celler ^9. Reaksjonsproduktene av HRP kan også diffundere bort fra stedet til generasjon, slik at oppløsningen er dårligere enn den nanogold ^måten 10. For å omgå disse problemene, ble flash / ReAsH system utviklet ^11. Den består av rekombinante fusjonsproteiner som innehar en tetracysteine ​​motiv. Dette motivet tillater binding aven biarsenic fluorophore. Når opphisset, er det bundne Flash eller ReAsH stand til å generere svært reaktive singlet oksygen og dermed photoconvert diaminobenzidin (DAB) i en polymer som utfelles umiddelbart på stedet av de merkede proteiner. DAB polymer kan farges med osmiumtetroxyd, som er elektron tett og kan således anvendes for å kartlegge fordelingen av det rekombinante fusjonsprotein i TEM.

I 2011, Shu et al. ¹⁰ presenterte miniSOG system, som består av en liten 106 aminosyrer fusjonssignal avledet fra et flavoprotein med Arabidopsis som er fluorescerende og i stand til å lage mange singlet oksygenradikaler når eksitert med 448 nm blått lys. Disse singlet oksygenradikaler kan brukes til foto oksidere diaminobenzidin til å danne polymerer på og nær overflaten av den merkede protein, noe som er betydelig nærmere enn en immun merkede antistoffer ^11. Mens flash / ReAsH systemet krever bringe fluorkrom og diaminobenzidin inn i cellene før gjør photoconversion, det miniSOG systemet kun krever diaminobenzidin og lys, og i tillegg er omtrent dobbelt så effektiv ved polymerisering av diaminobenzidin. Her er miniSOG ansatt i kombinasjon med ESI for å kartlegge ultrastructure av DNA-reparasjon foci.

DNA-reparasjon foci (DRF)

Ureparert DNA dobbelttrådbrudd utgjør en alvorlig trussel mot celle siden de kan føre til trans og tap av genetisk informasjon. I sin tur kan dette føre til begynnende alderdom, kreft og celledød. Mange proteiner som er involvert i DNA dobbel tråd bryte reparasjon akkumuleres i foci som sammen rundt en DNA dobbel tråd bryte ^12-14. Selv om deres funksjon er ikke kjent, de representerer området i kjernen som inneholder DNA dobbel tråd pause og er stedet for DNA dobbel tråd pause reparasjon.

DNA-reparasjon foci (DRF) har vært preget av fluorescens mikroskopi og de ​​tjener som biomarkører for DNA-skader ^12,15. De er massiv i forhold til størrelsen av den dobbelte tråd-brudd, og ble betraktet som relativt homogent før de senere super-oppløsning mikroskopistudier viste noen tegn på under compartmentalization av molekyler i hver fokusere ^16. For å forstå hvordan disse områdene er organisert, er det nødvendig å visualisere alle de underliggende biologiske strukturer i forhold til hverandre. Dette kan ikke oppnås ved fluorescens mikroskopi, men er mulig ved elektronmikroskopi ^17,18. Her blir det beskrevet en metode som kombinerer elektronspektroskopiavbildning med miniSOG metode for å illustrere potensialet for denne kombinerte metode for å utforske den ultra av DNA dobbel tråd pause reparasjon.

Protocol

1. generasjon miniSOG Cell-linjer Grow U2OS (humant osteosarkom) celler i en 35 mm skål inneholdende 2 ml av lavt glukose Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), som er supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO2 atmosfære. Transfektere cellene når de er 80% konfluent ved lipofeksjon med renset transfeksjon kvalitet (A269 / 280-forholdet 1,8-2,0) plasmidkonstruksjoner som inneholder sekvensene for miniSOG og mCherry tagget reparasjon av …

Representative Results

ESI Sammenligning av ESI bilder av kjernen (figur 1) med de konvensjonelle TEM bilder (f.eks Figur 7-1) viser en dramatisk økning i anatomiske strukturer som kan være lett skilles. De kromatin rygger vises i gult, og det er ganske lett å identifisere chromocenters i museceller. Nucleoli lett kan skilles fra kromatin ved sin runde struktur og annen farge, fordi de formonterte ribosomer som allerede inneholder store mengder protein…

Discussion

ESI kan tjene som et utmerket verktøy for å undersøke ulike tilstander av kromatin og ribonucleoproteins i kjernen, fordi det er i stand til å spesifikt kartlegge områder som er rike på fosfor. Det forsterker dypt mengden detaljer som kan oppnås ved et elektronmikroskop, og er ikke avhengig av ikke-spesifikke kontrast metoder. En ulempe ved ESI er at den krever tynnere partier enn konvensjonell TEM på samme akselererende spenning. Dette kan løses ved å jobbe med seriesnitt eller bruke tomographic metoder ^…

Materials

35 mm glass bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C
Gridded 35 mm glass bottom dishes	MatTek	P35G-2-14-CGRD	not made for immersion objectives
LR White: acryl resin	emsdiasum	14381
LR White accelerator	emsdiasum	14385
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets	Sigma	D5905
Slim Bar Grids 300 Mesh	SPI	1161123
Tungsten-Point Lab Pen	emsdiasum	41148
Osmium Tetroxide	emsdiasum	19100
Carbon Coater 208carbon	Cressington
Ultra microtome Leica EM UC6	Leica
Photoshop CS5	Adobe		might even work with older versions
Digital Micrograph V.2.30	Gatan		might even work with older versions
Hoechst 33342	Sigma	H-1399
Effectene	Quiagen
MiniSOG-Constructs	Tsien-Lab		tsienlab@yahoo.com
MDC1 miniSOG mCherry
53BP1 miniSOG mCherry
Rad52 miniSOG mCherry
cesium 137 radiation source "MARK 1"	(J.L. Shepherd & Associated)
ImageJ/FiJi	open source		http://fiji.sc/Fiji
2 ml Eppendorf tubes	Fisherbrand	05-408-146
Diamond Knife ultra 35°	Diatome
Trimming Knife ultratrim	Diatome
Sodium cacodylate trihydrate	emsdiasum	12300	Caution Toxic!
Glutaraldehyde EM Grade 8%	emsdiasum	16020	Caution Toxic!
Sodium phosphate dibasic	emsdiasum	21180
Sodium phosphate monobasic	emsdiasum	21190
Paraformaldehyde	emsdiasum	19202
Osmium tetroxide 4% solution	emsdiasum	19150
Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M	Zeiss
Hydrochloric Acid	Fisherbrand	A142-212
Sodium Hydroxide Solution 10M	Fluka	72068
Oxygen	Medigas
3-Amino-1,2,4-triazole	Sigma	A8056
Potassium cyanide	Sigma	207810	Caution Toxic!
Ethanol	emsdiasum	15058	Caution Toxic!
Razor blade Single Edge Carbon Steel	emsdiasum	71960	Caution Sharp!
DMEM	Sigma	D 5546
FBS	lifetechnologies	16000-044
G418	lifetechnologies	11811-023
DMSO	Sigma	D2650
Transmission Electron Microscope 200 kV	JEOL	2100
GIF Tridiem 863 Energy filter	Gatan