Visualisation immunohistochimique de l'hippocampe Neuron Activité Après l'apprentissage spatial dans un modèle de souris de troubles neurodéveloppementaux

Summary

Nous décrivons un protocole d'immunohistochimie pour étudier le profil d'activation des neurones de l'hippocampe après exposition à une tâche spatiale d'apprentissage dans un modèle de souris caractérisé par des déficits cognitifs d'origine neurologique du développement. Ce protocole peut être appliqué sur les deux modèles génétiques souris ou pharmacologiques, caractérisée par des déficits cognitifs.

Abstract

Induction de la kinase extracellulaire régulée phosphorylée (pERK) est une lecture moléculaire fiable de l'activation neuronale apprentissage dépendant. Ici, nous décrivons un protocole d'immunohistochimie pERK d'étudier le profil de l'activation des neurones de l'hippocampe après exposition à une tâche spatiale d'apprentissage dans un modèle de souris caractérisé par des déficits cognitifs d'origine neurologique du développement. Plus précisément, nous avons utilisé un marquage pERK pour étudier l'activation neuronale suivante labyrinthe aquatique de Morris (MWM, une tâche d'apprentissage de l'hippocampe-dépendante classique) dans Engrailed-2 KO (En2 ^{– / -)} chez la souris, un modèle de troubles du spectre autistique (TSA). Par rapport à de type sauvage (WT) contrôles, En2 ^{– / –} souris ont montré d'importants déficits d'apprentissage spatial dans le MWM. Après MWM, des différences significatives dans le nombre de neurones pERK-positives ont été détectées dans les sous-champs spécifiques de l'hippocampe En2 ^{– / –} souris, par comparaison aux animaux WT. Ainsi, notre protocole robuste peut détecter des différences danspERK neurones positifs associés à une altération de l'apprentissage de l'hippocampe-dépendante dans un modèle murin de la TSA. Plus généralement, notre protocole peut être appliqué à étudier le profil de l'activation des neurones de l'hippocampe dans les deux modèles génétiques souris ou pharmacologiques, caractérisé par des déficits cognitifs.

Introduction

Ces troubles neurologiques incluent un groupe de troubles tels que le syndrome de Down, le syndrome de l'X fragile (FXS), le syndrome de Rett, la neurofibromatose, la sclérose tubéreuse et ASD, dans lequel le développement et la maturation du système nerveux central (SNC) est perturbé tôt au cours de large et hétérogène la période prénatale ^1. Ces dysfonctionnements cérébraux développement peuvent causer profonds effets à long terme sur la fonction motrice, la langue, l'apprentissage et le processus de la mémoire. Une pléthore de facteurs génétiques et environnementaux ont été impliqués dans la pathogenèse de troubles neurologiques du développement au cours des dernières années ^2,3. Même si les mécanismes moléculaires sous-jacents le phénotype clinique demeurent inconnues, les résultats mentionnés ci-dessus ont permis le développement de plusieurs modèles de souris de ces troubles. les déficits de mémoire et d'apprentissage ont été identifiés dans un certain nombre de ces modèles de souris tels que TSC1 ^+/-, TSC2 ^+/-,Nf1 ^+/- et En2 ^{– / –} souris ^2,4-7. Un défi important dans le domaine des troubles du développement neurologique est l'identification des processus cellulaires et moléculaires qui sous-tendent la mémoire et le dysfonctionnement d'apprentissage. Les voies de signalisation activées sélectionnés pendant l'apprentissage ou de la mémoire peuvent induire la transcription de gènes spécifiques et finalement conduire à la synthèse de novo des protéines. Gènes précoces immédiats (IEG) activation et de protéines dépend modifications synaptiques sont induites rapidement dans les neurones du cerveau en réponse à l'activité neuronale et la formation comportementale ^8,9.

Les déficits dans les voies de signalisation impliquant neurofibromine ont été associés à des troubles d'apprentissage dans les troubles du développement neurologique. Neurofibromin est le produit du gène NF1, dont la mutation entraîne la neurofibromatose de type 1, un syndrome génétique complexe caractérisé par des tumeurs du système nerveux, des retards et du comportement moteur et cognitif disabilités ^10. hétérozygote Souris pour Nf1 suppression restreinte aux neurones inhibiteurs présentent des déficits dans la phase précoce de la potentialisation à long terme (LTP), ainsi que l'apprentissage spatial compromis dans MWM ^5,11,12. Fait intéressant, la carence Nf1 dans ce modèle de souris conduit à une activation excessive de signalisation Ras dans les interneurones inhibiteurs au cours de l'apprentissage, entraînant une augmentation de la phosphorylation de ERK et enfin à une amélioration de la libération de GABA anormale de ces neurones ^5.

Basé sur ces résultats, la visualisation de l'activité neuronale après tâches comportementales représente un moyen de reconstruire circuits spécifiques impliqués dans les maladies neurologiques du développement. Le protocole d'immunohistochimie décrit ici vise à évaluer et quantifier les niveaux de phosphorylation ERK hippocampe suivantes MWM dans un modèle de souris de TSA à des déficits cognitifs. MWM est largement utilisée pour étudier l'hippocampe apprentissage spatial et la mémoire dépendante chez les rongeurs ^13,14 </sjusqu'à>. Nous décidons d'utiliser la phosphorylation de ERK comme lecture moléculaire de l'apprentissage de l'hippocampe tâche dépendante, puisque ERK a été démontré qu'ils ont un rôle essentiel dans l'apprentissage et la formation de la mémoire ^15. En outre, la voie ERK est nécessaire pour l'expérience de la plasticité du cortex visuel de développement ^16. Enfin, les souris dépourvues de l'une des deux isoformes ERK (ERK2) dans le spectacle CNS marqués anomalies dans les comportements cognitifs, émotionnels et sociaux ^17, indiquant que la signalisation ERK pourrait jouer un rôle essentiel dans la pathogenèse de troubles neurodéveloppementaux tels que l'ASD.

Nous avons utilisé Engrailed 2 KO (En2 ^{– / -)} chez la souris comme modèle de troubles du développement neurologique. En2 ^{– / –} souris montrent des caractéristiques anatomiques et comportementales "ASD-like", y compris la perte des interneurones du cerveau antérieur ^18, réduction de l'expression de gènes liés ^ASD-19, une diminution de la sociabilité et de la flexibilité cognitive altérée ^6,7,20. Learni spatialeng et troubles de la mémoire, telles que celles détectées dans MWM, sont particulièrement robuste dans En2 ^{– / –} souris ^6,7 et pourraient être pertinentes pour les troubles cognitifs observés chez les patients TSA ^21. En outre, nous avons montré que l'apprentissage spatial facultés affaiblies dans MWM est associée à l'expression de neurofibromine réduite et l'augmentation des niveaux Perk dans le hile En2 ^{– / –} souris adultes ^7. Ici, nous présentons le protocole détaillé pour la caractérisation immunohistochimique de pERK suivante MWM dans ce modèle de souris de TSA.

Protocol

Toutes les expériences ont été effectuées en conformité avec la directive européenne 2010/63 / UE et ont été approuvés par le ministère italien de la Santé. 1. Animal Care, du logement et de traitement Effectuer tous les protocoles expérimentaux utilisant des souris en conformité avec les lignes directrices de la protection des animaux respective. Maintenir les animaux dans un 12 hr cycle lumière / obscurité avec de la nourriture et de l'eau ad lib…

Representative Results

Le protocole décrit ici a été conçu pour visualiser, par immunohistochimie, l'expression d'un marqueur de l'activité des neurones de l'hippocampe après MWM spécifique dans un modèle de souris de troubles du développement neurologique. Toutes les données expérimentales présentées ici ont été prises à partir de notre récent travail 7. Mâle et femelle WT et En2 – / – littermates appariés pour l'âge adulte (3-5 mois; poids = 25-35 g) obtenues à partir de croisem…

Discussion

Ici, nous fournissons un protocole d'immunohistochimie pERK pour révéler l'activation neuronale suivante MWM en En2 souris ^{– / -,} un modèle de souris de troubles du développement neurologique. Diminution des niveaux de pERK ont été détectées dans le sous-champ CA3 de En2 ^{– / –} mutants par rapport à WT. A la différence de ce qui est observé dans le sous-champ CA3, une augmentation générale des neurones pERK-positifs a été détecté dans les deux à la place hile et GCL de En2 …

Materials

EthoVision XT 8	Noldus Information Technology		This software platform is not a requirement – there are many other behavioral softwares on the market.
Tempera Paint	Giotto – Fila Group Company		White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze.
Vibratome	Leica	VT1200	Equivalent models from other companies can be used.
24 well plate	Sigma	CLS3524
100% ethanol	Fisher Scientific	A406-20	Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting.
Xylene	VWR	66004-950	Toxic – to be used under hood. Change xylene every month depending on use.
Sodium Azide	Sigma	S2002
PBS	Sigma	P3813-10PAK
ddH2O
Triton X-100	Sigma	T-8787
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009-100ML
Normal Goat Serum	Abcam	G9023-10ML
ABC kit Vectastain	Vector Laboratories	PK-6100	Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix.
DAB peroxidase substrate	Vector Laboratories	SK-4100	Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix.
pERK antibody	Cell Signaling Technologies	4370	Dilution 1:500
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody	Vector Laboratories	BA-1000	Dilution 1:250
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879
Coverslips	Fisher	12-548-B
DPX	Sigma	317616	Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used.
Microscope	Zeiss	Axio Imager.M2	Equivalent microscope can be used.
Adobe Photoshop	Adobe Systems, San Jose, CA		To assemble images.
Image J software	National Institute of Health		Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/
SigmaPlot 11.0	Systat Software Inc. (USA)		Equivalent softwares for statistical analysis can be used.
Prism 6	GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA)		Equivalent softwares for statistical analysis can be used.