Procedure voor Decellularisatie van Rat Levers in een oscillerende druk perfusie Device
Summary
The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.
Abstract
Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.
Introduction
Decellularisatie en hercellularisatie kunnen in vitro 1 het genereren van functionele, transplanteren organen mogelijk maken. Door het verwijderen van cellen en antigeen materiaal (bv. DNA, a-Gal epitopen) uit een orgaan, de niet- of minder immunogeen extracellulaire matrix (ECM) worden verkregen. Deze matrix behoudt de driedimensionale microanatomie van een orgaan en kan dienen als het ideale biomatrix voor herbevolking met cellen van een andere, eventueel xenogene oorsprong 2. Aldus zou een gedecellulariseerde rattenlever matrix worden herbevolkt met humane levercellen. Dit gehumaniseerd micro-lever zou kunnen dienen als een ex vivo model voor onderzoek naar ziekten (bv., Aangeboren stofwisselingsziekten, virale ziekten of maligniteiten) of voor preklinische farmaceutische testen 3.
Er zijn verschillende protocollen voor rat leverperfusie decellularisatie zijn reeds gepubliceerd 4-13. In alle protocollen, decellularordening werd bereikt door perfusie van basische ionische of niet-ionische detergentia via de canule poortader. Om het beste van onze kennis, waren we de eerste groep om rattenlever decellularisatie rapporteren door selectieve perfusie via de poortader en / of de rat leverslagader 14. Het inschakelen van de selectieve perfusie van verschillende vasculaire systemen in de lever cellen ontdoen betere resultaten stellen en bovendien een belangrijke rol in de cellulaire herbevolking spelen.
In de studie hier beschreven, werden levers geperfundeerd in een op maat gemaakt proprietary perfusie apparaat, waardoor perfusie onder oscillerende druk omstandigheden. Deze druk omstandigheden na te bootsen de fysiologische respiratoire-afhankelijke perfusie van de lever: in situ, de lever hangt onder de copula van het middenrif, waarvan de beweging tijdens de ademhaling heeft een directe invloed op de lever perfusie. Inspiration bijzonder leidt tot verlaging van het membraan en knijpen van de lever, optimaliserenhepato-veneuze uitstroom, terwijl vervaldatum leidt tot verhoging van de lever en het verlagen van de intra-abdominale druk om portal-veneuze instroom 15 optimaliseren.
Ons doel was om te evalueren of oscillerende druk omstandigheden hebben een invloed op de homogeniteit van de rat leverperfusie decellularisatie door het nabootsen van intra-abdominale voorwaarden ex vivo. De homogeniteit van de decellularisatie werkwijze kan een onderschatte factor perfusie ontcelling zijn. Alle bekende middelen die worden gebruikt voor de lever decellularisatie oorzaak veranderingen aan de ECM. Cellen in slecht doorbloede gebieden blijven binnen de ECM, terwijl andere gebieden zijn al helemaal ontceld. Om de resterende cellen ontbinding moet de perfusie duur of de druk verhoogd, waardoor meer wijzigingen van de goed doorbloede gebieden. Zo moet wasmiddelen voor decellularisatie homogeen worden verdeeld binnen het orgaan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel de gepresenteerde techniek rattenlever oogsten en ontcelling gemakkelijk reproduceerbaar, zijn er bepaalde kritische stappen te overwegen:
Tijdens het prepareren van de lever oogsten, is het belangrijk om ernstig bloeden voorkomen omdat bloedstolling wordt geactiveerd en kunnen leiden tot de vorming van bloedstolsels in de lever. Naar onze mening is het voordelig om de abdominale aorta direct incise vóór canulatie van de poortader om bloed instroom via de leverslagader tijdens perfu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to gratefully thank Steffen Lippert, Khalid Aliyev, Korinna Jöhrens and Katharina Struecker for their help during this project.
Materials
| Self built arterial cannula | |||
| Portex Non Sterile Polyethene Tubing | SIMS Portex | REF 800/110/100 | 0,28mm ID 0,61mm OD |
| Portex Non Sterile Polyethene Tubing | SIMS Portex | REF 800/110/200 | 0,58mm ID 0,96m OD |
| Venodrop Safe butterfly catheter | Fresenius Kabi | 3275851 | 21 G |
| portal vein cannula | |||
| Periphereal Venous Catheter | BD | 393224 | BD Venflon Pro 20G |
| three-way stopcock | smiths medical | 888-101RE | |
| surgery | |||
| Cotton Sticks | Hecht-Assistent | 4302 | |
| Cotton Pads | Shaoxing Zhengde Surgical dressing | 13H118-03 | |
| Gauze Bandage | Hubei Haige Medical Instruments | 14388 | |
| Ringer Solution | Fresenius Kabi | 13 HKP022 | 1000ml |
| 10ml Syringe | Braun | 4606108V | 10ml/ Luer Solo |
| 5ml Syringe | Braun | 4606061V | 5ml /Luer Solo |
| Suture (Silk 6/0) | Resorba | H1F | LOT 105001.81 |
| medical drape | Shaoxing Zhengde Surgical dressing | D0613011 | |
| surgical instruments | |||
| needle holder | Geuder | 17570 | |
| micro-forceps | Inox-Electronic | 91150-20 | |
| micro-scissors | Martin | 11-740-11 | |
| micro-forceps | S&T | 112314 | |
| Clamp | Aesculap | BH111R | |
| scissors | F S T | 14501-14 | |
| surgical forceps | Aesculap | BD 557 | |
| Decellularisation | |||
| Respirator | Resmed | 14.24.11.0004 | SmartAIR ST |
| Perfusion Device | Charite, medical engineering laboratory | custome-made device | decellularisation device |
| peristaltic pump ismatec reglo ICC | IDEX | ISM4408 | 4-channel |
| heidelberger extension 75 cm | Fresenius Kabi | 2873 | 75 cm |
| MS/CA pump-segment | IDEX | IS 3510 | MS/CA/click'n'go/POM-C |
| CA 2-stopper tube | Pharmed | BPT NSF-51 | |
| bubble trap | custome-made item | ||
| Luer Lock hose connector | Neolab | No. 02-1887 | |
| Detergents | |||
| SDS pellets | Carl Roth | CN30.4 | 2,5 kg |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.1 | 10l |
| PBS | Gibco | 14190-094 | DPBS |
| staining | |||
| Eosin 1% | Morphisto | 10177 | |
| Mayer hematoxylin | AppliChem | A4840 | |
| gomori staining | Morphisto | 11104 | |
| AlcainBlue-PAS staining | Morphisto | 11388 | |
| Direct Red 80 | Sigma Aldrich | 365548 |
References
- Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. Liver support strategies: cutting-edge technologies. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
- Wang, X., et al. Decellularized liver scaffolds effectively support the proliferation and differentiation of mouse fetal hepatic progenitors. J Biomed Mater Res A. , (2013).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16, 814-820 (2010).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
- Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell transplantation. 20, 753-766 (2011).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
- Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue engineering. Part C, Methods. 17, 677-686 (2011).
- De Kock, J., et al. Simple and quick method for whole-liver decellularization: a novel in vitro three-dimensional bioengineering tool. Archives of toxicology. 85, 607-612 (2011).
- Park, K. M., Woo, H. M. Systemic decellularization for multi-organ scaffolds in rats. Transplantation proceedings. 44, 1151-1154 (2012).
- Shirakigawa, N., Ijima, H., Takei, T. Decellularized liver as a practical scaffold with a vascular network template for liver tissue engineering. J Biosci Bioeng. , (2012).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver Int. 33, 448-458 (2013).
- Struecker, B., et al. Improved rat liver decellularization by arterial perfusion under oscillating pressure conditions. J Tissue Eng Regen Med. , (2014).
- Struecker, B., et al. Porcine Liver Decellularization Under Oscillating Pressure Conditions: A Technical Refinement to Improve the Homogeneity of the Decellularization Process. Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).
