Summary

Procedimento para Decelularização de fígados de rato em uma Perfusão dispositivo oscilante pressão

Published: August 10, 2015
doi:

Summary

The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

Abstract

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

Introduction

Descelularização e recelularização pode permitir a geração de órgãos funcionais, transplantáveis ​​in vitro 1. Ao remover as células e material antigénico (por exemplo., ADN, epítopos alfa-Gal) de um órgão, a matriz extracelular ou menos não-imunogénico (ECM) pode ser obtido. Esta matriz conserva a microanatomy tridimensional de um órgão e podem servir como a biomatriz ideal para o repovoamento com células de uma origem diferente, possivelmente xenogénico 2. Assim, uma matriz de fígado de rato descelularizado poderia ser repovoada com células de fígado humano. Este micro-fígado humanizado poderia servir como um modelo ex vivo para a pesquisa sobre doenças (por exemplo., Doenças metabólicas, doenças virais inatos ou neoplasias) ou para testes pré-clínicos farmacêutica 3.

Vários protocolos diferentes para perfusão de fígado de rato decellularization já foram publicados 4-13. Em todos os protocolos, decellularção foi conseguida por perfusão de detergentes iónicos ou não-iónicos alcalinas através da veia portal canulada. Para o melhor de nosso conhecimento, fomos o primeiro grupo a relatar rato decellularization fígado por perfusão seletiva através da veia portal e / ou o rato artéria hepática 14. Activar a perfusão selectiva dos diferentes sistemas vasculares no fígado pode permitir melhores resultados decelularização e, além disso, podem desempenhar um papel importante no repovoamento celular.

No estudo detalhado aqui, fígados foram perfundidos em um dispositivo de perfusão proprietária feitos sob medida, permitindo a perfusão sob condições de pressão oscilantes. Estas condições de pressão imitar a perfusão fisiológica respiratória dependente do fígado: in situ, o fígado paira sob a cópula do diafragma, cujo movimento durante a respiração tem um impacto direto sobre a perfusão hepática. Inspiração conduz especificamente a redução do diafragma e apertando do fígado, optimizandosaída hepato-venoso, enquanto que leva a expiração do fígado elevação e abaixamento da pressão intra-abdominal para optimizar o fluxo venoso portal-15.

O nosso objectivo foi avaliar se a condições de pressão oscilante tem um impacto sobre a homogeneidade de fígado de rato descelularização perfusão intra-abdominais, imitando as condições ex vivo. A homogeneidade do processo de descelularização pode ser um fator subestimado na perfusão descelularização. Todos os agentes conhecidos utilizado para a descelularização fígado provocam alterações nas ECM. Células em áreas mal perfundidos permanecer dentro da ECM, ao passo que outras áreas já estão completamente descelularizados. Para se dissolver as células restantes, a duração ou a pressão de perfusão deve ser elevada, fazendo com que mais alterações às áreas bem perfundidos. Assim, detergentes para a descelularização deve ser distribuído de forma homogénea dentro do órgão.

Protocol

Os animais foram mantidos no Centro de Medicina Experimental (FEM, Charité, de Berlim, Alemanha), e todos os protocolos experimentais foram revistos e aprovados pela Secretaria de Estado da Saúde e Assuntos Locais (LAGeSo, Berlim, Alemanha; Reg. No. 0365 O / 11). Colheita 1. Fígado Preparação pré-cirúrgica Use uma placa de cortiça para fixação. Coloque uma cortina médico sobre a placa. Usando quatro agulhas, fixar uma máscara de inalação na placa de cortiça…

Representative Results

A homogeneidade e, assim, a eficácia de diferentes protocolos de decelularização foram avaliadas por observação macroscópica, análise histológica e análise do conteúdo de ADN permanecendo dentro do fígado descelularizados matrizes. Além disso, a carcaça corrosão foi realizada para visualizar a microanatomia intacta de fígados após a descelularização. Macroscopia Durante decellularization, fígados tornar Lucent, indicando a remoção de conteúd…

Discussion

Embora a técnica apresentada para a colheita de fígado de rato e descelularização é facilmente reprodutível, existem certos passos críticos a serem considerados:

Durante a preparação para a colheita do fígado, é importante para evitar o sangramento grave, porque ele vai activar a coagulação do sangue e podem conduzir à formação de coágulos sanguíneos dentro do fígado. Em nossa opinião, é vantajoso entalhar a aorta abdominal directamente antes da canulação da veia porta…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to gratefully thank Steffen Lippert, Khalid Aliyev, Korinna Jöhrens and Katharina Struecker for their help during this project.

Materials

Self built arterial cannula
 Portex Non Sterile Polyethene Tubing SIMS Portex REF 800/110/100 0,28mm ID 0,61mm OD
 Portex Non Sterile Polyethene Tubing SIMS Portex REF 800/110/200 0,58mm ID 0,96m OD
Venodrop Safe butterfly catheter Fresenius Kabi 3275851 21 G
portal vein cannula
Periphereal Venous Catheter BD 393224 BD Venflon Pro 20G
three-way stopcock smiths medical 888-101RE
surgery
Cotton Sticks Hecht-Assistent 4302
Cotton Pads  Shaoxing Zhengde Surgical dressing 13H118-03
Gauze Bandage Hubei Haige  Medical Instruments 14388
 Ringer Solution Fresenius Kabi 13 HKP022 1000ml
10ml Syringe Braun 4606108V 10ml/ Luer Solo
5ml Syringe Braun 4606061V 5ml /Luer Solo
Suture (Silk 6/0) Resorba H1F LOT 105001.81
medical drape Shaoxing Zhengde Surgical dressing D0613011
surgical instruments
needle holder Geuder 17570
micro-forceps Inox-Electronic 91150-20
micro-scissors Martin 11-740-11
micro-forceps S&T  112314
Clamp Aesculap BH111R
scissors F S T  14501-14
surgical forceps Aesculap BD 557
Decellularisation
Respirator Resmed 14.24.11.0004 SmartAIR ST
Perfusion Device Charite, medical engineering laboratory custome-made device decellularisation device
peristaltic pump ismatec reglo ICC IDEX ISM4408  4-channel
heidelberger extension 75 cm  Fresenius Kabi 2873 75 cm
MS/CA pump-segment IDEX IS 3510  MS/CA/click'n'go/POM-C
CA 2-stopper tube Pharmed BPT NSF-51
bubble trap  custome-made item
Luer Lock hose connector Neolab No. 02-1887
Detergents
SDS pellets Carl Roth  CN30.4  2,5 kg
Triton X-100 Carl Roth  3051.1  10l
PBS  Gibco 14190-094 DPBS
staining
Eosin 1% Morphisto 10177
Mayer hematoxylin AppliChem A4840
gomori staining Morphisto 11104
AlcainBlue-PAS staining Morphisto 11388
Direct Red 80  Sigma Aldrich 365548

References

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Cite This Article
Hillebrandt, K., Polenz, D., Butter, A., Tang, P., Reutzel-Selke, A., Andreou, A., Napierala, H., Raschzok, N., Pratschke, J., Sauer, I. M., Struecker, B. Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device. J. Vis. Exp. (102), e53029, doi:10.3791/53029 (2015).

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