Bir Salınım basınçlı perfüzyon Aygıt Sıçan karaciğerinin decellularization Prosedürü
Summary
The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.
Abstract
Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.
Introduction
Decellularization ve Recellularization vitro 1'de işlevsel ve çoklu organ üretilmesini sağlayabilir. Kaldırma hücreleri ile antijenik madde ile (ör., DNA, a-Gal epitopları), bir organdan, olmayan ya da daha az immünojenik hücre dışı matris (ECM) elde edilebilir. Bu matris, bir organ, üç boyutlu mikroanatomisinin korur ve farklı, muhtemelen ksenogeneik kökenli 2 hücreleri ile yeniden popüle için ideal bir biyolojik matris olarak görev yapabilir. Bu durumda, bir hücresizleştirilmiş sıçan karaciğer matrisi insan karaciğer hücreleri ile yeniden doldurulur edilebilir. Bu insanlaştırılmış mikro-karaciğer hastalıkları (örn., Doğumsal metabolik hastalıklar, viral hastalıklar veya maligniteler) veya preklinik ilaç testi 3 araştırma için bir ex vivo modeli olarak hizmet verebilir.
Sıçan karaciğer perfüzyon decellularization için çeşitli protokoller zaten 4-13 yayınlanmıştır. Tüm protokollerde, decellularleştirilmesi kanüllü portal ven aracılığıyla alkali iyonik veya non-iyonik deterjanlar perfüzyon ile elde edilmiştir. Bizim bilgimize göre, biz portal ven ve / veya sıçan hepatik arter 14 üzerinden seçici perfüzyon ile sıçan karaciğer decellularization bildiren ilk gruptu. Karaciğer farklı vasküler sistemlerinin seçici perfüzyon etkinleştirilmesi hücre yeniden popüle önemli bir rol oynayabilir, bundan başka, daha decellularization sonuçlar etkinleştirmek olabilir.
Burada ayrıntılı çalışmada, karaciğer titreşen basınç koşullarında perfüzyon sağlayan bir ısmarlama tescilli perfüzyon cihazında perfüze edildi. Bu basınç koşulları karaciğer fizyolojik solunum bağımlı perfüzyon taklit: in situ, karaciğer hareketi solunum sırasında karaciğer perfüzyon üzerinde doğrudan etkisi vardır diyaframın copula altında asılı. İlham, özellikle optimize diyaframın düşürülmesi ve karaciğerde sıkma yol açarhepato-venöz çıkış, oysa son karaciğer yükselmesi ve portal venöz girişi 15 optimize karın içi basıncının düşürülmesi yol açar.
Amacımız salınan basınç koşulları karın içi koşullar ex vivo taklit ederek sıçan karaciğer perfüzyon decellularization homojenliği üzerinde bir etkisi olup olmadığını araştırmaktır. decellularization sürecinin homojenliği perfüzyon decellularization bir hafife bir faktör olabilir. Bilinen tüm maddeler ECM karaciğer decellularization neden değişiklikler için kullanılır. Diğer alanlarda zaten tamamen decellularized oysa kötü perfüze alanlarda hücreler, ECM içinde kalır. Geri kalan hücrelerin çözmek için, perfüzyon süresi ya da basınç iyi perfüze alanlara daha fazla değişiklik neden yükselmiş olması gerekir. Bu nedenle, decellularization deterjanlar organ içindeki homojen dağıtılmalıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sıçan karaciğer hasat ve decellularization sunulan tekniği kolayca tekrarlanabilir olmasına rağmen, dikkate bazı kritik adımlar vardır:
Kan pıhtılaşmasını aktive edecek ve karaciğer içinde kan pıhtısı oluşumuna neden olabilir, çünkü karaciğer hasat için hazırlık sırasında, şiddetli kanama önlemek için önemlidir. Bizce, bu portal ven yoluyla perfüzyon sırasında hepatik arter yoluyla kan akışını önlemek için portal ven kanülasyonu önce doğrudan abdo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to gratefully thank Steffen Lippert, Khalid Aliyev, Korinna Jöhrens and Katharina Struecker for their help during this project.
Materials
| Self built arterial cannula | |||
| Portex Non Sterile Polyethene Tubing | SIMS Portex | REF 800/110/100 | 0,28mm ID 0,61mm OD |
| Portex Non Sterile Polyethene Tubing | SIMS Portex | REF 800/110/200 | 0,58mm ID 0,96m OD |
| Venodrop Safe butterfly catheter | Fresenius Kabi | 3275851 | 21 G |
| portal vein cannula | |||
| Periphereal Venous Catheter | BD | 393224 | BD Venflon Pro 20G |
| three-way stopcock | smiths medical | 888-101RE | |
| surgery | |||
| Cotton Sticks | Hecht-Assistent | 4302 | |
| Cotton Pads | Shaoxing Zhengde Surgical dressing | 13H118-03 | |
| Gauze Bandage | Hubei Haige Medical Instruments | 14388 | |
| Ringer Solution | Fresenius Kabi | 13 HKP022 | 1000ml |
| 10ml Syringe | Braun | 4606108V | 10ml/ Luer Solo |
| 5ml Syringe | Braun | 4606061V | 5ml /Luer Solo |
| Suture (Silk 6/0) | Resorba | H1F | LOT 105001.81 |
| medical drape | Shaoxing Zhengde Surgical dressing | D0613011 | |
| surgical instruments | |||
| needle holder | Geuder | 17570 | |
| micro-forceps | Inox-Electronic | 91150-20 | |
| micro-scissors | Martin | 11-740-11 | |
| micro-forceps | S&T | 112314 | |
| Clamp | Aesculap | BH111R | |
| scissors | F S T | 14501-14 | |
| surgical forceps | Aesculap | BD 557 | |
| Decellularisation | |||
| Respirator | Resmed | 14.24.11.0004 | SmartAIR ST |
| Perfusion Device | Charite, medical engineering laboratory | custome-made device | decellularisation device |
| peristaltic pump ismatec reglo ICC | IDEX | ISM4408 | 4-channel |
| heidelberger extension 75 cm | Fresenius Kabi | 2873 | 75 cm |
| MS/CA pump-segment | IDEX | IS 3510 | MS/CA/click'n'go/POM-C |
| CA 2-stopper tube | Pharmed | BPT NSF-51 | |
| bubble trap | custome-made item | ||
| Luer Lock hose connector | Neolab | No. 02-1887 | |
| Detergents | |||
| SDS pellets | Carl Roth | CN30.4 | 2,5 kg |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.1 | 10l |
| PBS | Gibco | 14190-094 | DPBS |
| staining | |||
| Eosin 1% | Morphisto | 10177 | |
| Mayer hematoxylin | AppliChem | A4840 | |
| gomori staining | Morphisto | 11104 | |
| AlcainBlue-PAS staining | Morphisto | 11388 | |
| Direct Red 80 | Sigma Aldrich | 365548 |
References
- Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. Liver support strategies: cutting-edge technologies. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
- Wang, X., et al. Decellularized liver scaffolds effectively support the proliferation and differentiation of mouse fetal hepatic progenitors. J Biomed Mater Res A. , (2013).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16, 814-820 (2010).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
- Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell transplantation. 20, 753-766 (2011).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
- Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue engineering. Part C, Methods. 17, 677-686 (2011).
- De Kock, J., et al. Simple and quick method for whole-liver decellularization: a novel in vitro three-dimensional bioengineering tool. Archives of toxicology. 85, 607-612 (2011).
- Park, K. M., Woo, H. M. Systemic decellularization for multi-organ scaffolds in rats. Transplantation proceedings. 44, 1151-1154 (2012).
- Shirakigawa, N., Ijima, H., Takei, T. Decellularized liver as a practical scaffold with a vascular network template for liver tissue engineering. J Biosci Bioeng. , (2012).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver Int. 33, 448-458 (2013).
- Struecker, B., et al. Improved rat liver decellularization by arterial perfusion under oscillating pressure conditions. J Tissue Eng Regen Med. , (2014).
- Struecker, B., et al. Porcine Liver Decellularization Under Oscillating Pressure Conditions: A Technical Refinement to Improve the Homogeneity of the Decellularization Process. Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).
