Introduction
في طب العيون، برزت العلاج الجيني باعتباره طريقة العلاج في retinopathies الموروثة أحادية المنشأ. هناك retinopathies المرتبطة الموروثة الجينات في شبكية العين الظهارة الصبغية (RPE) بما في ذلك يبر amurosis الخلقية 1،2، التهاب الشبكية الصباغي 3، وتنكس المشيمية 4. مجال أبحاث العلاج الجيني تتوسع في كل من الدراسات قبل السريرية والتجارب السريرية باستخدام ناقلات فيروسية مثل فيروس الغدة -associated (AAV)، الفيروسة البطيئة (LV) واتش (الإعلان) 5. النواقل الفيروسية المختلفة لها مع الأجسام مختلفة في شبكية العين. لالعلاج الجيني آمنة وفعالة، ناقلات فيروسية ينبغي اختيار بعناية وفقا لالخلايا المستهدفة والجينات المستهدفة.
مسار توصيل الجينات مهم أيضا لتوصيل الجينات فعالة لاستهداف الخلايا، وبالتالي، فإنه ينبغي اختيار بعناية أيضا. وsubret الأساليب الأكثر شيوعا اثنين للتسليم العين من ناقلات فيروسيةحقن إينال وحقن intravitreal 6. هذا الأخير، حقن intravitreal، وقد استخدم على نطاق واسع لتسليم المخدرات لعلاج اتساع الأوعية الدموية المشيمية في الرطب الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD)، وذمة البقعة الصفراء في اعتلال الشبكية السكري 7. يوفر الطريق Intravitreal تعرض ناقلات فيروسية لشبكية العين الزجاجية والداخلية، ولكن انتشار ناقلات لشبكية العين الخارجي محدودة. من ناحية أخرى، والطريق تحت الشبكية يوفر النقل المباشر للناقلات فيروسية إلى الفضاء المحتمل بين شبكية العين وRPE، الأمر الذي أدى إلى فقاعة محلية. ولذلك، يعتبر الحقن تحت الشبكية حاليا طريقا أكثر كفاءة لاستهداف خلايا مستقبلة للضوء وRPE. من حيث النهج الجراحية، بارس يتم اختيار مسطح كمنطقة آمنة للحقن intravitreal لتجنب الضرر شبكية العين في المرضى من البشر. ببساطة عن طريق تعديل هذا النهج على الفئران، فإننا لا يمكن حقن ناقلات فيروسية subretinally أو intravireally عبر نهج الحوفي.
في هذا الفيديوالمادة، علينا أن نظهر وسيلة سهلة ومريحة للحقن تحت الشبكية من ناقلات فيروسية في الفئران RPE. بعد ثقب واحد في الخلفية لحوف مع 30 G 1/2 إبرة، يتم إدخال إبرة حادة G 33 ميكروليتر تجهيز الحقنة في الفضاء تحت الشبكية عبر موقع ثقب الحوفي. يتم حقن 2 حجم ميكرولتر إلى الفضاء المحتمل بين شبكية العين وRPE إحداث الفقاعات تحت الشبكية - ناقلات فيروسية 1.5. ويمكن تنفيذ هذا الإجراء في إطار رؤية مباشرة باستخدام الميكروسكوب الجراحي. والممارسة المتكررة يضمن النتائج القابلة للتكرار حتى من دون رؤية مباشرة لتشكيل فقاعة. وهذا سوف يساعد الباحثين على إجراء تجارب دقيقة وللوقت لتوصيل الجينات في الفئران تحت الشبكية RPE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للجمعية للبحوث في بيان الرؤية وطب العيون لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث الرؤية، والمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها لجنة رعاية جامعة المؤسسي الحيوان واستخدام سيول الوطنية وسيول الوطنية لجنة السلامة الأحيائية مستشفى الجامعة.
1. إعداد حقن كيت والفيروسية المتجهات
- تحضير حقنة ميكروليتر مجهزة إبرة 33 G حادة تعقيمها باستخدام غاز أكسيد الإيثيلين. تمييع ناقلات فيروسية في برنامج تلفزيوني لعيار كاف في أنبوب الجزئي (أي 1 × 10 6 TU / ميكرولتر). تدفق الحقنة عدة مرات مع ناقلات فيروسية لإزالة أي الفضاء الميت في المحقنة.
2. حقن تحت الشبكية الفيروسية المتجهات
- تخدير الفئران البالغة (أي 6-8 أسابيع من العمر) مع حقن داخل الصفاق من خليط من tiletamiشمال شرق وzolazepam (1: 1، 2.25 ملغ / كغ من وزن الجسم)، وهيدروكلوريد زيلازين (0.7 ملغم / كغم من وزن الجسم) أو نظام التخدير مناسب بديل.
- تمدد التلاميذ مع قطرة العين من فينيليفرين 0.5٪ و 0.5٪ تروبيكاميد.
- تحضير حقنة ميكروليتر عن طريق تحميل مع 1،5-2 ميكرولتر من ناقلات فيروسية.
- فتح الجفن وتبرز العين للكشف عن خط الاستواء للحقن مريحة والتركيز على تحت المجهر التشغيل. الحفاظ على موقف العين يبرز حتى الانتهاء من الحقن، أو النزوح من الإبرة يمكن أن تحدث أثناء الحقن. عقد مقلة العين بقوة، ضع أصابع خارج حافة المدارية.
- تطبيق قطرة من محلول اللزجة العيون إلى سطح القرنية.
- وضع غطاء الشريحة جولة صغيرة على الجزء العلوي من القرنية لتصور شبكية العين.
- ثقب ثقب صغير في مؤخرة طفيفة في حوف باستخدام العقيمة 30 G 1/2 إبرة لحقن تحت الشبكية آخر. جعل ثقب أقل شأنا FOص العين اليمنى، ومتفوقة للعين اليسرى للراحة.
ملاحظة: إذا تم إجراء ثقب في الزمانية أو الأنف، فإنه من الصعب أن تكون مشمولة الجفن بعد الحقن. وينبغي بذل ثقب الأولي قليلا الخلفي لحوف لتجنب الأوعية الحوفي التي تمتد على طول حوف، ويمكن التعرف عليه بسهولة. كن حذرا لتجنب ضرب العدسة مع إبرة في حين جعل ثقب الأولي. لا تضاف شطبة كامل من الإبرة إلى تجنب عدسة ثقب. - وضع إبرة 33 G حادة من ميكروليتر حقنة من خلال ثقب ما قبل ثقب والاقتراب من الإبرة في الفضاء تحت الشبكية حتى هذه النقطة عندما يشعر مقاومة خفيفة.
ملاحظة: بالنسبة للحقن تحت الشبكية، وأفضل زاوية اقتراب الإبرة حوالي 45 درجة ضد طائرة القزحية، وينبغي دفع إبرة حادة من الخلف نحو منطقة بالحليمة. وأشار مربع منقط مسار الإبرة اقترح عبر تجويف الجسم الزجاجي للinjectio تحت الشبكيةن في الشكل 1.
ملاحظة: لن يكون هناك أي مقاومة عندما رأى ثقب (أو تمرير) طبقات الشبكية كما أنها لينة جدا. وبالتالي، فإن الشعور الأول للمقاومة خفيفة يشير إلى أن الإبرة وقد لمست بالفعل طبقة RPE ويجب أن يتوقف إدخال الإبرة. يجب الحرص على عدم اختراق الأنسجة صلبوية مع الضغط المفرط أنه يجب أن توضع الإبرة في الفضاء تحت الشبكية المحتملين. إذا كانت إبرة يثقب الأنسجة صلبوية بالقوة المفرطة، فإنه يدخل في المساحات المدارية المقلة دون مقاومة. (هذه الخطوة الحاسمة)
الشكل 1. الرسم التخطيطي للحقن تحت الشبكية. H & E الملون المقطع العرضي للعين الماوس تصور هياكل مع مسار إبرة لحقن تحت الشبكية ملحوظ (مربع منقط). التكبير: 40X، مقياس شريط: 500 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
- حقن النواقل الفيروسية (أي 1 × 10 6 TU / ميكرولتر) بلطف في الفضاء تحت الشبكية دون الزلزال لتجنب تلف الأنسجة غير المرغوب فيها وسحب الإبرة بلطف. عقد مقلة العين بقوة خلال الحقن كما هو موضح في 2.4.
- نلاحظ تشكيل فقاعة تحت الشبكية بعد الحقن تحت المجهر التشغيل للتأكد من عدم وجود نزيف في شبكية العين.
ويبين الشكل 2. تحت الشبكية Belb تشكيل الشبكية دون نزف. عرض المجهري للbelb تحت الشبكية بعد الحقن تحت الشبكية تحت المجهر التشغيل تشكيل فقاعة ناجحة دون نزيف في شبكية العين.م / ملفات / ftp_upload / 53030 / 53030fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
- بلطف إغلاق الجفن لتغطية موقع الحقن لمنع تسرب الذاتي. عودة الفئران إلى قفص المنزل والحفاظ على قيد الحياة حتى التقييم.
ملاحظة: بعد التعود الباحثون إلى الإجراءات ويتمكنوا من الحصول على نتائج قابلة للتكرار مع إجراءات سريعة من خلال تخطي هذه الخطوات (2.5 و 6 و 10)
3. تقييم فعالية من الجينات التسليم في الشبكية الظهارة الصبغية
- التضحية الفئران في غرفة CO 2. استأصل العينين باستخدام المقص.
- إصلاح العيون في حل بارافورمالدهيد 4٪ عند 4 درجة مئوية لمدة لا تقل 1 ساعة إلى عدة أيام.
- الاستيلاء على القرنية مع ملقط غرامة وثقب القرنية مع مقص الصغرى. إزالة القرنية بعد استخدام المقص على طول حوف. إزالة العدسة مع ملقط.
- تقليم الجسم الهدبي مع مicro مقص السماح انفصال الشبكية. سحب بلطف شبكية العين كلها من / المشيمية / مجمع الصلبة RPE. قطع RPE / المشيمية / مجمع الصلبة شعاعيا من المحيط إلى المركز بالقرب من العصب البصري عدة مرات لجعل 4-8 أوراق لتركيب مسطحة.
- الوجه RPE / المشيمية / مجمع الصلبة لجعل الجانب RPE أسفل، وتقليم كل ما تبقى من الأنسجة في الجانب الصلبة بما في ذلك العضلات والملتحمة والعصب البصري. هذه الخطوة مهمة لجعل RPE / المشيمية / مجمع الصلبة شقة لأن أي نوع من الأنسجة المتبقية يجعل متفاوتة التعقيد.
- احتضان المجمع مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية لأغراضك بحثية محددة (اختياري، راجع المراجع لأساليب مفصلة). شقة-جبل RPE / المشيمية / مجمعات صلبوية على شريحة زجاجية واستيعاب PBS مع الاسفنجة الماصة.
- إضافة 30 ميكرولتر من محلول تركيب ووضع الشريحة الغطاء. مراقبة العينة لفعالية تسليم ناقلات تحت المجهر فلوريسئين. الحفاظ على العينات فيالثلاجة لمزيد من المراقبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتقييم فعالية حقن تحت الشبكية على الفيروسية تنبيغ الجينات بموجب هذا البروتوكول، استخدمنا المتاحة تجاريا ناقلات LV مع CMV المروج التعبير عن كل GFP وطلب تقديم العروض للمؤشر. ومنزوعة النواة العينين بعد الفترة الزمنية المناسبة وفقا للغرض البحث. للحصول على نتائج التمثيلية، ومنزوعة النواة عيون 10 أسبوعا و 20 أسبوعا بعد الحقن تحت الشبكية. بعد الاستئصال الكامل للشبكية العين باستخدام الطريقة الموصوفة أعلاه، تم تقييم جبل مسطح من RPE مجمع / المشيمية / الصلبة تحت المجهر مضان. وقد أظهرت نتائج ممثل في الشكل 3A (مثال جيد مع إزالة كاملة من شبكية العين) والشكل 3B (الفقراء سبيل المثال مع الشبكية سليمة). على الرغم من وجود الشبكية العصبية المتبقية (وخصوصا مبصرة الجزء الخارجي) على طبقة RPE لم تتدخل لتحليل مجال توصيل الجينات في RPE أنها حجبت مضان من GFP / RFP وvisua المباشر تحول دون lization من طبقة RPE لمزيد من التحليلات. ولذلك، فإن الإزالة الكاملة للالشبكية العصبية من مجمع / المشيمية / الصلبة RPE توفير نتائج أفضل.
الشكل 3. مثال RPE / المشيمية / الصلبة مجمع شقة جبل فقا لالإزالة الكاملة للشبكية العين. عشرون أسابيع بعد الحقن تحت الشبكية من الفيروسة البطيئة مع GFP / RFP الجينات. (A) خير مثال على RPE جبل شقة مع إزالة كاملة للشبكية يظهر تعبير واضح ومحدد من GFP / RFP في الخلايا RPE. (B) فقير مثال RPE جبل شقة بسبب عدم إزالة الشبكية معارض مجال توصيل الجينات مع إشارات RFP وهي غير كافية لتحليل أمراض RPE. التكبير: 40X، شريط مقياس: 500 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
معشوقة = "jove_content"> ومن الصعب الحكم على فعالية من التحليل الكمي لشدة إشارة GFP / RFP متغيرة في الخلايا RPE في المنطقة المحقونة. بالإضافة إلى ذلك، مجال تنبيغ تنحصر في مجال تشكيل فقاعة بعد الحقن. وهكذا، فإنه سيكون أكثر موثوقية للحكم على فعالية من خلال وجود GFP / التعبير طلب تقديم العروض وفقا لعيار الفيروسية في نفس حجم حقن (أي 2 ميكرولتر). هذا يساعد على ضبط عيار الفيروسية المناسب للتجربة.
نتائج تمثيلية من RPE / المشيمية / صلبوي مجمع شقة جبل 10 أسابيع بعد أن أظهرت الحقن تحت الشبكية في التكبير مختلف في الشكل 4 (40X) والشكل (5) (400X). الصور مع التكبير المنخفض كافية لتقييم مجال GFP / RFP التعبير. من ناحية أخرى، والصور مع التكبير العالية ضرورية لعلم الأمراض RPE آخر فيما يتعلق أغراض محددة الباحثين. هذه الصور الطرافةح تكبير مختلفة تساعد على فهم نمط التعبير الفيروسي في RPE (الشكل 4 و 5). لقد دققت أيضا التعبير عن GFP / RFP تصل إلى 36 أسابيع حقن آخر. كان لا يزال لاحظ التعبير عن GFP / RFP بعد الحقن بعد 36 أسبوعا (لا تظهر البيانات).
الرقم 4. مثال RPE / المشيمية / الصلبة مجمع شقة جبل 10 أسابيع بعد الحقن تحت الشبكية من الفيروسة البطيئة مع GFP / RFP جين (التكبير: 40X). (A) قناة خضراء لGFP (B) القناة الحمراء لطلب تقديم العروض. شريط مقياس: 500 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. مثال RPE / المشيمية / مجمع الصلبة شقة-mount 10 أسابيع بعد الحقن تحت الشبكية من الفيروسة البطيئة مع GFP / RFP جين (التكبير: 400X). (A) قناة خضراء لGFP (B) القناة الحمراء لطلب تقديم العروض. شريط النطاق: 50 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه المقالة الفيديو، وصفنا تقنية الحقن تحت الشبكية النهج الحوفي في التفاصيل مع نتائج ممثلة من RPE / المشيمية / الصلبة شقة جبل. هذا هو أسلوب سهلة ومريحة للحقن تحت الشبكية من ناقلات فيروسية في RPE. التصور المباشر لتشكيل فقاعة خلال الحقن هو خطوة هامة لتسليم دقيقة للمبتدئين. هناك بعض تقنيات الحقن تحت الشبكية التي أدخلت في مجلة التجارب متصور 10/08. الفضاء تحت الشبكية هو الفضاء المحتملين بين شبكية العين وRPE، وبالتالي هناك نوعان من طرق محتملة للاقتراب من الفضاء تحت الشبكية. واحد هو نهج الداخل إلى الفضاء تحت الشبكية عبر الجسم الزجاجي والشبكية والآخر هو نهج الخارجي عبر RPE والصلبة. هذا النهج الحوفي تقنية الحقن تحت الشبكية هي واحدة السابق عبر الفضاء intravitreal وشبكية العين. هذا الأسلوب له ميزة لتوفير المزيد من تشكيل الخلفي فقاعة بالمقارنة مع هذا الأخير لأن والأخيرpproach يجعل فقاعة من الجانب المحيطي عبر نفق الصلبة أو شق، والتي ينبغي على شبكية العين الطرفية. بالإضافة إلى ذلك، ثقب الحوفي بسيط هو أسهل من نفق الصلبة دون تغلغل في شبكية العين. لالفئران حديثي الولادة، ومع ذلك، فإنه سيكون أكثر ملاءمة لاستخدام نهج الخارجي 9. بسبب مقلة العين الماوس حديثي الولادة هي صغيرة جدا ومليئة العدسة، يمكن تقنية نهج الحوفي يسبب تشكيل إعتام عدسة العين غير المرغوب فيها أو حتى سل المقلة.
هناك بعض الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول. أولا وقبل كل شيء، يجب أن يكون ثقب الأولي المكان الخلفي قليلا إلى حوف بسبب ثقب الأمامي جدا في القرنية يجعل قزحية السجن، أو ثقب الخلفي أيضا يجعل ثقب مباشر في الشبكية الطرفية. ثانيا، فمن المستحسن أن تكون حذرا لتجنب ضرب العدسة مع إبرة في حين جعل ثقب الأولي. فمن الأفضل عدم إدراج شطبة كامل من الإبرة إلى تجنب عدسة ثقب. ثالثا، بمؤسسة زاوية اقتراب الإبرة حوالي 45 درجة ضد طائرة القزحية، وينبغي دفع إبرة حادة من الخلف باتجاه منطقة بالحليمة. وأخيرا، ينبغي أن توضع الإبرة في الفضاء تحت الشبكية خلال الحقن، مما أدى إلى تشكيلات فقاعة موحدة، وإلا فإن إبرة النازحين تسبب حقن intravitreal.
العين هي جهاز صغير مع الميزات الفريدة التي تجعلها هدفا جذابا للعلاج بالجينات 11. على وجه التحديد، هو حجرة صغيرة مغلقة مع المناعة الامتياز التي تمكن العلاج الجيني مع منخفضة نسبيا سمية وردود الفعل المناعية في العين والآثار السلبية النظامية. من السهل التصور والوصول استعداد لنهج الجراحية مزايا أخرى من العين للعلاج بالجينات. الشبكية لديها بنية الصفحي درجة عالية من التنظيم مع 10 طبقات متميزة. وبالتالي، لا يمكن تحقيق دقيق توصيل الجينات المكاني إلا من خلال الطرق المناسبة للحقن داخل العين. الأساليب الأكثر شيوعا اثنين لINTRتسليم aocular من ناقلات فيروسية هي حقن intravitreal وحقن تحت الشبكية 6. بشكل عام، حقن intravitreal هو الطريق المفضل لشبكية العين الداخلية التي تستهدف خلايا الشبكية العقدة والخلايا مولر. حقن تحت الشبكية هو الطريق المفضل لشبكية العين الخارجية التي تستهدف خلايا مستقبلة للضوء والخلايا RPE. لالتنبيغ كفاءة في RPE، فمن الضروري توفير ناقلات فيروسية subretinally على الرغم من احتمال حدوث ضرر على شبكية العين.
في هذه الدراسة، كنا ناقلات LV مع GFP وطلب تقديم العروض لالتصور. لأن ناقلات فيروسية لها مع الأجسام لأنواع معينة من الخلايا في شبكية العين، وينبغي اختيار النواقل الفيروسية وفقا لمع الأجسام من AAV، LV، والإعلان لاستهداف الخلايا 5. على سبيل المثال، AAV2 / 2، AAV2 / 6 و AAV2 / 8 هي أعلى كفاءة تنبيغ الخلايا RGC ومولر. AAV2 / 5، 2/7، 2/8 و 2/9 تنبيغ كفاءة خلايا مستقبلة للضوء وRPE مع AAV2 / 8 كونها المصلي الأكثر كفاءة في الفئران 5،12 5. لناقلات LV، هناك مستوى عال من التعبير في الخلايا RPE بعد الحقن تحت الشبكية، ولكن التعبير ضئيلة أو معدومة بعد الحقن intravitreal 13.
لتوصيل الجينات فعال لRPE، ينبغي النظر أيضا المروجين الفيروسي. المروجين الفيروسية، مثل الفيروس المضخم للخلايا (CMV) مروج والدجاج خيالية بيتا الأكتين / CMV محسن المروج والمروجين قوي وموجود في كل مكان، وبالتالي، فهي تستخدم في أغلب الدراسات العلاج الجيني. في RPE، ويقدر المروج CMV للتعبير عن عشرة أضعاف اكبر قدر من البروتين مقارنة مع المروج RPE65 14. من حيث الأهمية، ويجب تحقيق الجمع الأمثل من المروج وناقلات فيروسية بما في ذلك النمط المصلي لتحقيق نتائج أفضل كما يتبين من التعبير متفوقة من RPE65 عندما يتم تعبئتها المروج RPE65 البشري في المصلي rAAV2 / 4 من rAAV2 / 2 15. التركيز على إيصال الجينات إلى الخلايا RPE، RPE-SPالمروجين ecific مثل RPE65 أو المروج VMD2 يقلص قضايا سلامة بعيدا عن الهدف 16.
AMD هو مرض معقد يحتوي على مرحلتين مع مرحلة التنكسية المشار إليها AMD الجاف ومرحلة تتميز اتساع الأوعية الدموية المشيمية المشار إليها AMD الرطب كما. أيضا، AMD هو المرض الذي العديد من حساسيات الوراثية بما في ذلك عامل مكمل H (CFH)، تكمل C3، يكمل العامل الأول (CFI)، ذات الصلة العمر اعتلال البقعة قابلية 2 (ARMS2) وAPOE وجنبا إلى جنب مع المخاطر البيئية العوامل 17. بسبب الطبيعة المعقدة لعوامل الخطر الجينية في AMD، لا يوجد الجين مرشح واحد للعلاج بالجينات لها. وبالتالي، يركز العلاج الجيني الحالي في AMD على نقل الجينات للتعبير عن البروتينات المضادة للعائية استهداف اتساع الأوعية الدموية المشيمية في الرطب AMD 18. لا يوجد الجين مرشح حتى الآن طريقة لعلاج AMD الجاف مع العلاج الجيني. في الآونة الأخيرة، اقترحنا أن يمكن اميلويد بيتا تراكم الخلاياأن تكون ذات صلة لتجف ميزات AMD في الفئران المعدلة وراثيا 19. بالإضافة إلى ذلك، تم أخذ حقن subretinally بيتا اميلويد من قبل RPE في الفئران (بيانات غير منشورة). يمكننا أن يلتصق الخلايا بيتا اميلويد مع البروتيني الفيروسي 20. وبالتالي، لدينا مزيد من الدراسة والعلاج الجيني في AMD الجاف مع الأهداف المحتملة.
في الختام، والعلاج الجيني في أمراض العيون هو أكثر إشراقا من أي جهاز آخر. بالإضافة إلى ذلك، حقن تحت الشبكية هو أسلوب الأساسية للعلاج الجيني في أمراض الشبكية، وخاصة فيما يتعلق خلايا مستقبلة للضوء وRPE. وبالتالي، فإننا نأمل أن هذه التقنية يصبح استخدامها على نطاق واسع ويمكن أن تسهم في النهوض العلاج الجيني ليس فقط في أحادية المنشأ رثت اعتلال الشبكية ولكن أيضا في الضمور البقعي المرتبط بالعمر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة من قبل سيول القومي للبحوث منحة جامعة (800-20140542)، وبرنامج الرواد بحوث جبهة الخلاص الوطني / MEST (2012-0009544)، وبرنامج بيو الإشارة تحليل التكنولوجيا والابتكار من جبهة الخلاص الوطني / MEST (2009-0090895)، ومنح جبهة الخلاص الوطني / MEST (2015M3A9E6028949).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS | WPI | 500233 | |
| VANNAS Scissors S/S, 105 mm | WPI | 555583S | |
| 33 G Blunt needle | WPI | NF33BL-2 | |
| NanoFil Syringe, 10 microliter | WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | For easy one hand injection |
| 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) BD PrecisionGlideTM Needle | BD | 305107 | Initial puncture for subretinal injection |
| Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter) | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Leica operating microscope | Leica | LM M80 | |
| Fluoresecein microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Lentivirus | Thermo scientific | TMO.LV-Ctr | Used to dilute vectors |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to dilute vectors |
| Troperin (Phenylephrin 0.5% - Tropicamide 0.5%) | Hanmi | For dilation | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Sterile) | Bausch&Lomb | For topical anesthesia | |
| Healon GV OVD | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50 (tiletamine hypochloride and zolazepam hypochloride) | Virbac | For general anesthesia | |
| Rompun injection (Xylazine HCl) | Bayer | For general anesthesia |
References
- Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
- Jacobson, S. G., et al. Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years. Arch Ophthalmol. 130 (1), 9-24 (2012).
- Conlon, T. J., et al. Preclinical potency and safety studies of an AAV2-mediated gene therapy vector for the treatment of MERTK associated retinitis pigmentosa. Hum Gene Ther Clin Dev. 24 (1), 23-28 (2013).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet. 383 (9923), 1129-1137 (2014).
- Trapani, I., Puppo, A., Auricchio, A. Vector platforms for gene therapy of inherited retinopathies. Prog Retin Eye Res. 43, 108-128 (2014).
- Liang, F. Q., Anand, V., Maguire, A. M., Bennett, J. Intraocular delivery of recombinant virus. Methods Mol Med. 47, 125-139 (2001).
- Peyman, G. A., Lad, E. M., Moshfeghi, D. M. Intravitreal injection of therapeutic agents. Retina. 29 (7), 875-912 (2009).
- Matsumoto, H., Miller, J. W., Vavvas, D. G. Retinal detachment model in rodents by subretinal injection of sodium hyaluronate. J Vis Exp. (79), (2013).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J Vis Exp. (69), (2012).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Sahel, J. A., Roska, B. Gene therapy for blindness. Annu Rev Neurosci. 36, 467-488 (2013).
- Allocca, M., et al. Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors. J Virol. 81 (20), 11372-11380 (2007).
- Takahashi, K., et al. Sustained transduction of ocular cells with a bovine immunodeficiency viral vector. Hum Gene Ther. 13 (11), 1305-1316 (2002).
- Rolling, F., et al. Gene therapeutic prospects in early onset of severe retinal dystrophy: restoration of vision in RPE65 Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Bull Mem Acad R Med Belg. 161 (10-12), 497-508 (2006).
- Le Meur, G., et al. Restoration of vision in RPE65-deficient Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Gene Ther. 14 (4), 292-303 (2007).
- Alexander, J. J., Hauswirth, W. W. Adeno-associated viral vectors and the retina. Adv Exp Med Biol. 613, 121-128 (2008).
- Puche, N., et al. Genetic and environmental factors associated with reticular pseudodrusen in age-related macular degeneration. Retina. 33 (5), 998-1004 (2013).
- Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Hum Gene Ther. 22 (5), 523-529 (2011).
- Park, S. W., et al. Intracellular amyloid beta alters the tight junction of retinal pigment epithelium in 5XFAD mice. Neurobiol Aging. 35 (9), 2013-2020 (2014).
- Shin, B., et al. Intracellular cleavage of amyloid beta by a viral protease NIa prevents amyloid beta-mediated cytotoxicity. PLoS One. 9 (6), e98650 (2014).
