Introduction
In der Augenheilkunde hat die Gentherapie als Behandlungsmethode in monogenen geerbt Retinopathien entstanden. Es vererbt Retinopathien mit Genen im retinalen Pigmentepithel (RPE), einschließlich Leber angeborene amurosis 1,2, Retinitis pigmentosa 3 und choroideremia 4 verbunden. Das Forschungsfeld der Gentherapie erweitert in beiden präklinischen Studien und klinischen Studien unter Verwendung von viralen Vektoren, wie Adeno-assoziierte Virus (AAV), Lentiviren (LV) und Adenovirus (Ad) 5. Verschiedene virale Vektoren haben unterschiedliche Tropismus in der Netzhaut. Für eine sichere und wirksame Gentherapie, virale Vektoren sollten sorgfältig entsprechend Zielzellen und Zielgene ausgewählt werden.
Die Route der Genübertragung ist auch wichtig für eine effektive Genübertragung an Zielzellen, so sollte es sorgfältig und ausgewählt werden. Die beiden am häufigsten verwendeten Methoden zur intraokularen Abgabe von viralen Vektoren sind SUBRETinal Einspritzung und intravitreale Injektion 6. Letztere, intravitreale Injektion, wurde weit verbreitet für die Arzneimittelabgabe verwendet werden, um CNV in feuchten altersbedingten Makuladegeneration (AMD) und Makulaödem bei diabetischer Retinopathie 7 behandeln. Intravitreale Route bietet Exposition viraler Vektoren zu glasigen und inneren Retina, sondern die Diffusion der Vektoren äußeren Netzhaut begrenzt ist. Auf der anderen Seite stellt die subretinale Route direkte Lieferung von viralen Vektoren zum Potential Raum zwischen Retina und RPE, Induzieren einer lokalisierten Bläschen. Daher wird subretinalen Injektion momentan als ein effizienter Weg für die gezielte Photorezeptorzellen und RPE. In Bezug auf die chirurgischen Ansatz, Pars plana als einen sicheren Bereich für die intravitreale Injektion gewählt, um Netzhautschäden in menschlichen Patienten zu vermeiden. Durch einfaches Ändern dieses Konzept für Mäuse, wir könnten virale Vektoren subretinal oder intravireally via Limbus-Ansatz zu injizieren.
In diesem VideoArtikel zeigen wir eine einfache und bequeme Methode der subretinalen Injektion von viralen Vektoren in Mäuse RPE. Nach Einzelpunktion bei posterior zu Limbus mit einer 30 G 1/2 Nadel wird ein 33 G stumpfen Nadel ausgestattet Mikroliterspritze in den subretinalen Raum über den Limbus Einstichstelle eingeführt. Die viralen Vektoren 1,5-2 ul Volumen auf das Potential Raum zwischen Retina und RPE Induzieren subretinalen Bläschen injiziert. Dieser Vorgang kann unter direkter Sicht mit Operationsmikroskop durchgeführt werden. Wiederholte Praxis werden reproduzierbare Ergebnisse auch ohne direkte Visualisierung der Bläschenbildung zu gewährleisten. Dies soll dazu dienen, um eine genaue und zeitsparende Experimente zur subretinalen Gentransfer in Mäusen RPE durchzuführen.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der Association for Research in Vision and Ophthalmology Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research durchgeführt und die Richtlinien und Vorschriften von der Seoul National University Institutional Animal Care und Verwenden Committee und Seoul National dargelegt Universitätsklinikum Biosafety Committee.
1. Vorbereiten Injection Kit und Virale Vektoren
- Bereiten Sie die Mikroliter-Spritze mit einer 33 G stumpfen Nadel sterilisiert mit Ethylenoxid-Gas ausgestattet. Verdünnt den viralen Vektoren in PBS zur adäquaten Titer im Mikroröhre (dh 1 × 10 6 TU / ul). Spülen Sie die Spritze mehrmals mit viralen Vektoren, jede toten Raum in der Spritze zu entfernen.
2. Subretinale Injektion von viralen Vektoren
- Betäuben den erwachsenen Mäusen (dh, 6-8 Wochen alt) mit einer intraperitonealen Injektion der Mischung aus tiletamine und Zolazepam (1: 1, 2,25 mg / kg Körpergewicht) und Xylazin-Hydrochlorid (0,7 mg / kg Körpergewicht) oder eine alternative geeignete Anästhesie Regimes.
- Erweitern sich die Schüler mit einem Auge Tropfen Phenylephrin 0,5% und 0,5% Tropicamid.
- Bereiten Sie den Mikroliterspritze durch das Laden mit 1,5 bis 2 & mgr; l von viralen Vektoren.
- Öffnen Sie das Augenlid und stehen den Blick auf den Äquator zum bequemen Injektion freizulegen und sich auf unter dem Operationsmikroskop. Aufrechterhaltung der vorstehende Augenposition bis Beendigung der Injektion oder Verschiebung der Nadel während der Injektion ein. Um den Augapfel fest zu halten, legen Sie die Finger außerhalb des Augenhöhlenrand.
- Einen Tropfen Augen viskoelastische Lösung, um die Hornhautoberfläche.
- Setzen Sie einen kleinen runden Deckglas auf der Oberseite der Hornhaut, um die Netzhaut zu visualisieren.
- Stechen ein kleines Loch an leichten hinter dem Limbus mit einer sterilen Nadel 30 G 1/2 für die weitere subretinale Injektion. Machen Sie das Loch unterlegen for das rechte Auge und überlegen für das linke Auge für die Bequemlichkeit.
HINWEIS: Wenn das Loch an zeitliche oder Nasen gemacht, ist es schwer, durch das Augenlid nach der Injektion bedeckt sein. Punktion sollte etwas hinter dem Limbus, die Limbusgefäßen, die entlang des Limbus ausgeführt und kann leicht erkannt werden, zu vermeiden. Seien Sie vorsichtig, schlagen Sie das Objektiv mit Nadel und gleichzeitig die Punktion zu vermeiden. Nicht die gesamte Kegel der Nadel legen nicht auf Linsenpunktion zu vermeiden. - Legen Sie die 33 G stumpfen Nadel der Mikroliterspritze durch die Pre-Stichloch und nähern sich die Nadel in den subretinalen Raum bis zu dem Punkt, wenn mild Widerstand zu spüren ist.
HINWEIS: Bei den subretinalen Injektion, der beste Ansatz Winkel der Nadel ist etwa 45 Grad gegen Iris Ebene und die stumpfe Nadel sollte nach hinten in Richtung peripapillären Bereich geschoben werden. Gepunktete Quadrat angezeigt die vorgeschlagene Nadel Weg über den Glaskörperraum für den subretinalen injection in 1.
HINWEIS: Es wird kein Widerstand fühlte, als Piercing (oder Weitergabe) die Netzhautschichten, wie sie sind sehr weich. Somit wird das erste Gefühl einer leichten Widerstand zeigt an, dass die Nadel die RPE-Schicht bereits berührt wurde und die Einführung der Nadel gestoppt werden sollte. Achten Sie darauf, Skleragewebe mit Überdruck durchdringen, weil die Nadel in das Potenzial subretinalen Raum platziert werden. Wenn die Nadel in die Lederhautgewebe durch übermäßige Macht, tritt sie in den äußeren Augen orbitalen Bereiche ohne Widerstand. (Dieser Schritt ist kritisch)
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Subretinale Injection. H & E gefärbten Querschnitt der Maus Auge Darstellung der Strukturen mit einer Nadel Weg für den subretinalen Injektion markiert (eine gepunktete Quadrat). Vergrößerung: 40x, Maßstabsbalken: 500 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Injizieren Sie den viralen Vektoren (dh 1 x 10 6 TU / ul) vorsichtig in den subretinalen Raum ohne Zittern um unerwünschte Gewebeschäden zu vermeiden und vorsichtig ziehen Sie die Nadel. Halten Sie den Augapfel fest während der Injektion, wie in 2.4 beschrieben.
- Beachten Sie die Bildung von subretinalen Bläschen nach Injektion unter Operationsmikroskop, um sicherzustellen, gibt es keine Netzhautblutungen.
Abbildung 2. Subretinale Belb Formation ohne Netzhautblutungen. Mikroskopische Ansicht des subretinalen belb nach dem subretinalen Injektion unter Operationsmikroskop zeigt erfolgreiche bleb Bildung ohne Netzhautblutungen.m / files / ftp_upload / 53030 / 53030fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Schließen Sie vorsichtig das Augenlid auf die Injektionsstelle für selbstdicht decken. Bringen Sie die Maus mit nach Hause Käfig und am Leben zu erhalten, bis die Auswertung.
Hinweis: Nach dem die Forscher erhalten den Verfahren verwendet werden, können sie die wiederholbare Ergebnisse mit Schnellverfahren durch Überspringen Sie diese Schritte erhalten (2,5, 6 und 10)
3. Bewertung der Wirksamkeit von Gentransfer in Retinapigmentepithel
- Opfern die Mäuse in der CO 2 Kammer. Entkernen die Augen mit einer Schere.
- Fixieren die Augen in der 4% Paraformaldehyd-Lösung bei 4 ° C für mindestens 1 Stunde bis einige Tage.
- Besorgen Sie sich die Hornhaut mit feinen Pinzetten und Punktion der Hornhaut mit Mikro-Schere. Entfernen Sie die Hornhaut nach scissoring entlang des Limbus. Nehmen Sie den Objektiv mit einer Pinzette.
- Schneiden Sie die Ziliarkörper mit micro-Schere ermöglicht Netzhautablösung. Ziehen Sie die gesamte Netzhaut von der RPE / Aderhaut / Lederhaut-Komplex. Schneiden Sie den RPE / Aderhaut / Lederhaut-Komplex radial von der Peripherie zum Zentrum in der Nähe des Sehnervs mehrmals, um 4 bis 8 Blätter für flache Montage machen.
- Klappen Sie den RPE / Aderhaut / Lederhaut-Komplex zu RPE Seite nach unten zu machen, und schneiden Sie die verbleibenden Gewebe an der skleralen Seite einschließlich der Muskeln, Bindehaut und Sehnerv. Dieser Schritt ist wichtig, um eine flache RPE / Aderhaut / Lederhaut-Komplex zu machen, weil der verbleibende Gewebe macht die komplexe uneben.
- Inkubieren Sie die Anlage mit primären und sekundären Antikörpers für Ihre spezielle Forschungszwecke (optional, siehe die Referenzen für detaillierte Methoden). Flach montieren RPE / Aderhaut / Lederhaut-Komplexe auf dem Objektträger und absorbieren die PBS mit einem saugfähigen Schwamm.
- In 30 ul Montagelösung und legen Sie das Deckglas. Beachten Sie die Probe für die Wirksamkeit von Vektor-Lieferung unter Fluoreszenzmikroskop. Bewahren Sie die Proben inder Kühlschrank zur weiteren Beobachtung.
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Representative Results
Um die Wirksamkeit der subretinalen Injektion auf virale Gen-Transduktion durch dieses Protokoll zu bewerten, haben wir im Handel erhältlich LV Vektoren mit CMV-Promotors exprimieren, sowohl GFP und RFP für den Indikator. Augen wurden nach der jeweiligen Zeitperiode nach dem Forschungszweck ausgeschält. Für die repräsentative Ergebnisse wurden die Augen 10 Wochen und 20 Wochen nach der subretinalen Injektion enukleiert. Nach vollständiger Entfernung der Netzhaut mit dem oben beschriebenen Verfahren wurde die Wohnung Berg der RPE / Aderhaut / Lederhaut-Komplex unter dem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. Die repräsentativen Ergebnisse wurden in Figur 3A (Beispiel mit vollständiger Entfernung der Netzhaut) und 3B (schlecht Beispiel bei intakter Netzhaut) gezeigt. Obwohl die Existenz von Überrest neuronalen Netzhaut (insbesondere Photorezeptoraußensegment) über RPE-Schicht nicht beeinträchtigen, um den Bereich der Genübertragung in RPE zu analysieren, die Fluoreszenz von GFP / RFP und gehemmt direkten Visualisierungs blockiert essierung der RPE-Schicht für weitere Analysen. Daher würde die vollständige Entfernung von neuronalen Netzhaut von der RPE / Aderhaut / Lederhaut-Komplex bessere Ergebnisse.
Abbildung 3. Das Beispiel der RPE / Aderhaut / Sklera Complex Flachlager nach der vollständigen Entfernung der Retina. Zwanzig Wochen nach der Injektion von Subretinale Lentivirus mit GFP / RFP Gene. (A) Gutes Beispiel für RPE Flachhalterung mit vollständigen Entfernung der Netzhaut zeigt deutliche und diskrete Expression von GFP / RFP in den RPE-Zellen. (B) Schlechte Beispiel RPE Flach montieren, da keine Entfernung von der Netzhaut zeigt das Gebiet der Gen-Delivery mit RFP Signale, die ausreicht, um die RPE-Pathologie zu analysieren ist. Vergrößerung: 40x, Maßstabsbalken:. 500 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
(das heißt 2 & mgr; l) zu beurteilen. Dies hilft dabei, geeignete Virustiter für das Experiment einzustellen.
Die repräsentativen Ergebnisse RPE / Aderhaut / Lederhaut-Komplex Flachlager 10 Wochen nach subretinaler Injektion wurden in verschiedenen Vergrößerungs in 4 (40X) und Figur 5 (400X) gezeigt. Die Bilder mit geringer Vergrößerung sind genug, um den Bereich der GFP / RFP Ausdruck auszuwerten. Auf der anderen Seite sind die Bilder mit hoher Vergrößerung für andere RPE-Pathologie in Bezug auf die Forscher bestimmte Zwecke erforderlich. Diese Bilder with verschiedenen Vergrößerungen helfen, den viralen Expressionsmuster in RPE verstehen (Abbildung 4 und 5). Wir haben auch überprüft die Expression von GFP / RFP bis zu 36 Wochen nach der Injektion. Die Expression von GFP / RFP noch nach 36 Wochen nach der Injektion beobachtet (Daten nicht gezeigt).
Abbildung 4. Das Beispiel des RPE / Aderhaut / Sklera Complex Flachhalterung 10 Wochen nach der Injektion von Subretinale Lentivirus mit GFP / RFP Gene (Vergrößerung: 40-fach). (A) Grünkanal für GFP (B) rot-Kanal für RFP. Maßstab:. 500 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Das Beispiel RPE / Aderhaut / Sklera Complex Wohnung-mount 10 Wochen nach der Injektion von Subretinale Lentivirus mit GFP / RFP Gene (Vergrößerung: 400X). (A) Grünkanal für GFP (B) rot-Kanal für RFP. Maßstab:. 50 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
In diesem Video-Artikel beschrieben wir die Limbus-Ansatz subretinalen Injektionstechnik im Detail mit den repräsentativen Ergebnissen der RPE / Aderhaut / Lederhaut Flachmontage. Dies ist eine einfache und bequeme Technik zum subretinalen Injektion von viralen Vektoren in RPE. Direkte Visualisierung bleb Bildung während der Injektion ist ein wichtiger Schritt für die pünktliche Lieferung für die Anfänger. Es gibt einige subretinalen Injektionstechniken in Blatt eingeführt of Visualized Experiments 8-10. Subretinalraum ist das Potential Raum zwischen Retina und RPE deshalb gibt es zwei mögliche Wege, um den subretinalen Raum zu nähern. One ist eine Innen Ansatz zur subretinalen Raum via Glaskörper und Netzhaut und die andere ist eine Außen Ansatz über RPE und Lederhaut. Diese Limbus-Ansatz subretinalen Injektionstechnik ist der ehemalige eine über intravitreale Raum und Netzhaut. Diese Technik hat den Vorteil, mehr posterior Bläschenbildung bieten im Vergleich zu den letzteren, da dieser eineNSATZ macht eine Blase aus dem peripheren Seite via skleralen Tunnel oder Einschnitt, der sich über der peripheren Netzhaut vorgenommen werden sollen. Darüber hinaus ist einfach Limbus Punktion einfacher als skleralen Tunnel ohne Netzhautpenetration. Für die neugeborenen Mäusen, wäre es jedoch besser, die außerhalb Ansatz 9 zu verwenden. Da neonatalen Maus Augapfel ist sehr klein und voll von der Linse, kann Limbus-Ansatz Technik unerwünschte Kataraktbildung oder sogar Phthisis bulbi führen.
Es gibt einige kritische Schritte in diesem Protokoll. Zunächst einmal sollte Punktion sein Platz leicht auf den Limbus posterior, weil zu vorderen Punktion an der Hornhaut macht Iris Inhaftierung oder zu posterior Punktion ermöglicht direkten Loch an der peripheren Netzhaut. Zweitens ist es empfehlenswert, vorsichtig schlagen die Linse mit Nadel und gleichzeitig die Punktion zu vermeiden. Es ist besser, den gesamten Abschrägung der Nadel zu vermeiden Linseneinstich einzufügen. Drittens ist die best Böschungswinkel der Nadel ist etwa 45 Grad gegen Iris Ebene und die stumpfe Nadel sollte nach hinten in Richtung peripapillären Bereich geschoben werden. Schließlich sollte die Nadel in den subretinalen Raum während der Injektion gesetzt werden, was zu einer gleichmäßigen bleb Formationen, da sonst die Nadel verschoben verursacht intravitreale Injektion.
Das Auge ist ein kleines Organ mit einzigartigen Eigenschaften, die es ein attraktives Ziel für die Gentherapie 11 zu machen. Insbesondere ist es eine kleine geschlossene Kammer mit immun-Privileg, Gentherapie ermöglicht mit relativ geringen Toxizität und Immunreaktionen im Augen- und unerwünschten systemischen Wirkungen. Einfache Visualisierung und leichte Zugänglichkeit zu Operationstechniken sind weitere Vorteile des Auges für die Gentherapie. Die Netzhaut hat eine hoch organisierte Schichtstruktur mit 10 verschiedenen Schichten. Auf diese Weise kann eine genaue räumliche Gentransfer nur durch die entsprechenden Methoden der intraokulare Injektion erreicht werden. Die beiden häufigsten Methoden zur intraocular Lieferung von viralen Vektoren sind intravitreale Injektion und subretinalen Injektion 6. In der Regel ist intravitreale Injektion der bevorzugte Weg zur inneren Netzhaut Targeting retinalen Ganglienzellen und Müller-Zellen. Subretinalen Injektion ist der bevorzugte Weg zur äußeren Netzhaut Targeting Photorezeptorzellen und RPE-Zellen. Für eine effiziente Transduktion in RPE, ist es erforderlich, virale Vektoren subretinal trotz der Möglichkeit einer Beschädigung der Netzhaut zu liefern.
In dieser Studie verwendeten wir LV Vektoren mit GFP und RFP zur Visualisierung. Da virale Vektoren Tropismus für spezifische Zelltypen der Retina sollte virale Vektoren gemäß Tropismus von AAV, LV und Ad an Zellen 5 Ziel gewählt werden. Zum Beispiel AAV2 / 2, AAV2 / 6 und AAV2 / 8 sind die höchste Transduktionseffizienz zu RGC und Müller-Zellen. AAV2 / 5, 2/7, 2/8 und 2/9 effizient transduzieren Photorezeptorzellen und RPE mit AAV2 / 8 ist der effizienteste Serotyp in Mäusen 5,12 5. Für LV-Vektoren gibt es eine High-Level-Expression in RPE-Zellen nach subretinaler Injektionen, aber wenig oder gar keine Expression nach intravitrealen Injektionen 13.
Für eine effektive Genübertragung auf RPE sollte virale Promotoren ebenfalls berücksichtigt werden. Virale Promotoren, wie Cytomegalievirus (CMV) Promotor und chimären chicken beta-Actin / CMV-Enhancer-Promotors sind stark und ubiquitäre Promotoren, damit sie in der Mehrheit von Gentherapiestudien verwendet. In RPE wird der CMV-Promotor geschätzt, um auszudrücken, verglichen mit dem RPE65-Promotor 14 zehnmal so viel Eiweiß. Von Bedeutung ist, sollte die optimale Kombination des Promotors und virale Vektoren einschließlich Serotyp für bessere Ergebnisse erzielt werden als durch überlegene Expression RPE65 gezeigt, wenn die menschliche RPE65 Promotor in Serotyp rAAV2 / 4 als rAAV2 / 2 15 verpackt werden. Die Konzentration auf Genübertragung auf RPE-Zellen, RPE-specific Promotoren wie der RPE65 oder VMD2 Promotors verringert die Off-Target-Sicherheitsfragen 16.
AMD ist eine komplexe Erkrankung, die zwei Phasen mit einer so genannte trockene AMD degenerative Phase und einer Phase, die durch CNV bezeichnet als feuchte AMD hat. Auch AMD eine Krankheit, bei der zahlreiche genetisch bedingten Anfälligkeit einschließlich Komplementfaktor H (CFH), ergänzen C3, Komplementfaktor I (CFI), sind altersbedingte Makuladegeneration Anfälligkeit 2 (ARMS2) und ApoE mit Umweltrisikofaktoren kombiniert 17. Aufgrund der komplexen Natur der genetischen Risikofaktoren in AMD gibt es keinen einzigen Kandidaten-Gen für die Gentherapie. So wird die Strom Gentherapie in AMD auf Gentransfer fokussiert, um anti-angiogenen Proteine gezielt CNV in feuchten AMD 18 zum Ausdruck bringen. Es gibt keine Kandidaten-Gen noch zur Behandlung von trockener AMD mit einer Gentherapie. Vor kurzem schlug vor, dass die intrazelluläre Amyloid-Beta-Akkumulation konnteAMD Funktionen in transgenen Mäusen 19 trocken stehen. Außerdem subretinal injiziert Amyloid-beta wurde von RPE in Mäusen entnommen (Daten nicht veröffentlicht). Wir können intrazelluläre Amyloid-beta mit viralen Protease 20 zu spalten. So haben wir weiter die Gentherapie in trockene AMD mit potenziellen Ziele untersucht.
Abschließend ist die Gentherapie in Augenerkrankung versprechender als in irgendeinem anderen Organ. Zusätzlich ist subretinale Injektion eine grundlegende Technik für die Gentherapie bei Netzhauterkrankungen, vor allem in Bezug auf die Photorezeptorzellen und RPE. So hoffen wir, dass diese Technik wird immer weit verbreitet und können zur Förderung der Gentherapie nicht nur in monogenen geerbt Retinopathie, sondern auch bei der altersbedingten Makuladegeneration beitragen.
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Acknowledgments
Diese Studie wurde von der Seoul National University Research Grant (800-20140542) unterstützt, der Pioneer Research Program der NRF / MEST (2012-0009544) und die Bio-Signalanalyse-Technologie-Innovations-Programm der NRF / MEST (2009-0090895), und die Gewährung von NRF / MEST (2015M3A9E6028949).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS | WPI | 500233 | |
| VANNAS Scissors S/S, 105 mm | WPI | 555583S | |
| 33 G Blunt needle | WPI | NF33BL-2 | |
| NanoFil Syringe, 10 microliter | WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | For easy one hand injection |
| 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) BD PrecisionGlideTM Needle | BD | 305107 | Initial puncture for subretinal injection |
| Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter) | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Leica operating microscope | Leica | LM M80 | |
| Fluoresecein microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Lentivirus | Thermo scientific | TMO.LV-Ctr | Used to dilute vectors |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to dilute vectors |
| Troperin (Phenylephrin 0.5% - Tropicamide 0.5%) | Hanmi | For dilation | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Sterile) | Bausch&Lomb | For topical anesthesia | |
| Healon GV OVD | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50 (tiletamine hypochloride and zolazepam hypochloride) | Virbac | For general anesthesia | |
| Rompun injection (Xylazine HCl) | Bayer | For general anesthesia |
References
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