Introduction
안과에서, 유전자 치료는 단일 유전자 상속 망막증의 치료법으로서 등장했다. Leber 씨 선천성 amurosis 1,2, 색소 성 망막염 (3), (4)를 포함 choroideremia 망막 색소 상피 (RPE) 유전자와 연관된 상속 망막 병증이있다. 유전자 치료의 연구 분야는 전임상 연구 및 아데노 -associated 바이러스 (AAV), 렌티 바이러스 (LV) 및 아데노 바이러스 (AD)와 같은 바이러스 벡터를 사용하여 임상 시험 모두에서 확대되고있다 (5). 다른 바이러스 성 벡터는 망막에 다른 친 화성이있다. 안전하고 효과적인 유전자 치료의 경우, 바이러스 벡터 신중 표적 세포와 표적 유전자에 따라 선택되어야한다.
효율적인 유전자 전달이 표적 세포에 대한 유전자 전달의 경로는 따라서 신중뿐만 선택되어야한다, 또한 중요하다. 바이러스 벡터의 인공 전달을위한 가장 일반적인 두 가지 방법이 subret된다원고 판 주입과 유리체 강내 주입 6. 후자 주입술 널리 당뇨 망막 7 습식 노인성 황반변 성 (AMD) 및 황반부 종의 맥락막 혈관 신생을 치료하는 약물 전달을 위해 사용되었다. 유리체 강내 경로 및 내측 망막 바이러스 벡터의 노광을 제공하지만, 외측 망막 벡터의 확산이 제한된다. 한편, 망막 경로 지역화 여과포를 유도, 망막 및 RPE 간의 잠재적 바이러스 벡터 공간으로의 직접 전달을 제공한다. 따라서, 망막 하 주사 현재 시각 세포 및 RPE를 타겟팅보다 효율적인 경로로 간주된다. 수술 방법의 측면에서, 인간 환자 유리체 망막 손상을 방지하기 위해 주입술 안전한 영역으로서 선택된다 갈 거예요. 단순히 쥐에이 방법을 수정하여, 우리는 윤부 접근 방식을 통해 subretinally 또는 intravireally 바이러스 벡터를 주입 할 수있다.
이 비디오에서기사, 우리는 쥐의 망막 색소 상피에 바이러스 벡터의 망막 주사의 쉽고 편리한 방법을 보여줍니다. 30 G 1/2 바늘 윤부에 후방에서 단일 천자 후, 33 G 무딘 바늘 장착 된 마이크로 리터 주사기는 윤부 천자 사이트를 통해 망막 하 공간에 삽입됩니다. 1.5의 바이러스 성 벡터 - 2 μL 볼륨은 망막과 망막 색소 상피가 망막 소포를 유도 사이의 잠재적 인 공간으로 주입된다. 이 절차는 수술 현미경을 사용하는 직접적인 시각화 하에서 수행 될 수있다. 반복 연습도 여과포 형성의 직접 시각화없이 복제 결과를 보장합니다. 이 쥐의 망막 색소 상피에서 망막 유전자 전달에 대한 정확하고 시간을 절약 실험을 수행하는 연구자 도움이 될 것입니다.
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Protocol
동물에 대한 모든 실험은 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용에 대한 비전 및 안과 문에 연구를위한 협회에 따라 수행하고, 지침과 규정은 서울 대학교 기관 동물 관리 및 사용위원회와 서울 대학교가 정한했다 대학 병원 바이오 안전성위원회.
1. 주입 키트 및 바이러스 성 벡터를 준비
- 에틸렌 옥사이드 가스를 사용하여 멸균 33 G 무딘 바늘을 갖춘 마이크로 리터 주사기를 준비한다. 마이크로 튜브 (즉, 1 × 6 TU / μL)의 적절한 역가에 대한 PBS에서 바이러스 벡터를 희석. 주사기 임의 사강을 제거하는 주사기를 바이러스 벡터로 수회 세척.
바이러스 성 벡터의 2. 망막 주입
- tiletami의 혼합물의 복강 내 주사 - (8 주 오래 즉, 6) 성인 쥐를 마취NE 및 zolazepam (1 : 1, 2.25 ㎎ / ㎏ 체중)과 자일 라진 하이드로 클로라이드 (0.7 ㎎ / ㎏ 체중) 또는 다른 적절한 마취 정권.
- 페닐에 0.5 %의 점안제와 동공 팽창 및 0.5 % tropicamide.
- 바이러스 벡터의 2 μL - 1.5로드하여 마이크로 리터 주사기를 준비합니다.
- 눈꺼풀을 열고 편리 주입 적도 노출 및 운영 현미경에 초점을 눈 돌출. 주입 동안 발생할 수있는 바늘의 주입, 또는 변위 마무리까지 돌출 눈 위치를 유지한다. 단단히 안구를 유지하기 위해, 궤도 림 외부에서 손가락을 놓습니다.
- 각막 표면 안과 점탄성 용액 한 방울을 적용한다.
- 망막을 시각화하는 각막의 상단에 작은 원형 커버 슬라이드를 놓습니다.
- 추가적인 망막 주 사용 멸균 1/2 30 G 바늘을 사용 윤부에 약간 후방에 작은 구멍이 천공. FO 구멍이 열등 확인R 우안과 편의상 좌안 우수한.
주 : 구멍 시간적 또는 비강에서 이루어진다면, 그것은 주입 후 눈꺼풀에 의해 커버되기 어렵다. 초기 구멍은 약간 만든 윤부를 따라 실행하고 쉽게 인식 할 수 윤부 혈관을 피하기 위해 윤부에 후부해야합니다. 초기 구멍을하는 동안 바늘로 렌즈를 타격 않도록주의하십시오. 렌즈 구멍을 피하기 위해 바늘의 전체 경사를 삽입하지 마십시오. - 사전 천공 구멍을 통해 마이크로 리터 주사기의 33 G 무딘 바늘을 놓고 가벼운 저항이 느껴지는 경우 지점까지 망막 하 공간에 바늘을 접근.
참고 : 망막 주사를 들어, 바늘의 가장 좋은 방법 각도는 조리개면에 대해 약 45도이며, 무딘 바늘은 유두 주위 지역을 향해 후방으로 밀어해야합니다. 점선 사각형은 망막 injectio의 유리 체강에서 제안 된 바늘의 경로를 표시그림 1에서 N.
참고 : 그들은 매우 부드럽고으로 관통 (또는 전달) 망막 층 경우에는 저항이 느끼지있을 것이다. 따라서, 온화한 저항 제 느낌 바늘 이미 RPE 층을 터치하고 바늘의 삽입이 중단되어야 함을 나타낸다. 바늘이 잠재적 인 망막 공간에 배치해야하기 때문에 과도한 압력과 공막 조직에 침투하지 않도록주의하십시오. 바늘이 과도한 전력에 의해 공막 조직을 천공하면, 저항없이 안구 궤도 공간으로 들어간다. (이 단계는 매우 중요하다)
망막 사출 그림 1. 회로도. H & E 표시 망막 주사 바늘 경로와 구조를 묘사 마우스 눈의 스테인드 단면 (점선 사각형). 배율 : 40X, 스케일 바 : 500 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 불필요한 조직 손상을 방지하고 조심스럽게 바늘을 철회 떨림없이 망막 하 공간에 부드럽게 바이러스 벡터 (즉, 1 × 6 TU / μL)를 주입한다. 2.4에 설명 된대로 주입하는 동안 단단히 안구를 잡습니다.
- 더 망막 출혈이없는 것을 확인하기 위해 운영 현미경으로 주사 후 망막 여과포의 형성을 관찰한다.
그림 2. 망막 출혈없이 망막 Belb 형성. 운영 현미경으로 망막 주사 후 망막 belb의 현미경보기 망막 출혈없이 성공적으로 여과포 형성을 보여줍니다.M / 파일 / ftp_upload / 53030 / 53030fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 부드럽게 자체 밀봉 용 주사 부위를 덮도록 눈꺼풀을 닫을. 홈 케이지에 마우스를 반환하고, 평가까지 살아 유지.
참고 : 연구자가 절차에 익숙해 후, 다음 단계 건너 뛰어 신속한 절차에 반복 가능한 결과를 얻을 수 (2.5, 6, 10) 수
망막 색소 상피의 유전자 전달의 효능 3. 평가
- CO 2 챔버에서 쥐를 희생. 가위를 사용하여 눈을 명백히하다.
- 며칠에 최소 1 시간 동안 4 ℃에서 4 % 파라 포름 알데히드 용액에서 쳐다.
- 미세 집게로 각막을 잡고 마이크로 가위로 각막에 구멍. 윤부를 따라 가위질 한 후 각막을 제거합니다. 집게로 렌즈를 제거합니다.
- M와 모양체 트림망막 박리를 허용 icro 가위. 조심스럽게 RPE / 맥락막 / 공막 단지에서 전체 망막을 잡아 당깁니다. 평면 실장 용 4~8 잎 있도록 시신경 수회 가까운 중심 둘레로부터 반경 RPE / 맥락막 / 공막 복합체를 잘라.
- 아래 망막 색소 상피면을 만들고, 근육, 결막 및 시신경을 포함하는 공막 측에 남아있는 모든 조직을 손질 할 수있는 RPE / 맥락막 / 공막 복잡한 플립. 나머지 조직은 복잡한 요철 구조를 만들기 때문에이 단계는 플랫 RPE / 맥락막 / 공막 복합체를 확인하는 것이 중요하다.
- (자세한 방법에 대한 내용을 참조, 선택 사항) 특정 연구 목적으로 기본 및 보조 항체 복합체를 품어. 유리 슬라이드에 RPE / 맥락막 / 공막 단지를 플랫 마운트 흡수성 스폰지로 PBS를 흡수한다.
- 장착 솔루션의 30 μl를 추가하고 커버 슬라이드를 배치합니다. 형광 현미경 벡터 전달의 효능에 대한 샘플을 관찰한다. 에 샘플을 유지더 관찰 냉장고.
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Representative Results
이 프로토콜에 의해 바이러스 성 유전자 전달에 망막 주사의 효능을 평가하기 위해, 우리는 인디케이터 GFP 및 RFP를 모두 표현하는 CMV 프로모터와 시판 LV 벡터를 사용했다. 눈은 연구 목적에 따라 적절한 시간 후에 적출 하였다. 대표적인 결과를 들어, 눈을 10 주에서 망막 주사 후 20 주 적출 하였다. 전술 한 방법을 사용하여 망막의 완전한 제거 후, RPE / 맥락막 / 공막 복합체의 평면 실장 형광 현미경으로 평가 하였다. 대표적인 결과는 그림 3A (망막의 완전한 제거와 좋은 예)와 그림 (b) (그대로 망막와 가난한 예)에 나타내었다. RPE 층 위에 남은 신경 망막 (특히 감광체 외측 부분)의 존재가 RPE에 유전자 전달의 영역을 분석을 방해하지 않았지만, 그것은 GFP / RFP 및 억제 직접 visua의 형광을 차단추가 분석을위한 망막 색소 상피 층의 사용 효율. 따라서, RPE / 맥락막 / 공막 복합체로부터 신경 망막의 완전한 제거가 더 나은 결과를 제공 할 것이다.
그림 3. 공막 RPE / 맥락막 /의 예 복잡한 평면 마운트 망막의 완전한 제거에 따라. 스물 주 GFP / RFP 유전자와의 Lentivirus의 망막 주사 후. 평면 망막의 완전한 제거와 장착 (A) 망막 색소 상피의 좋은 예는 망막 색소 상피 세포에서 GFP / RFP의 분명하고 분리 된 표현을 보여줍니다. 망막없이 제거로 RPE 병변을 분석하는 불충분 한 RFP 신호에 유전자 전달의 영역을 도시 때문에 (B) RPE의 불량 예 플랫 마운트. 배율 : 40X, 스케일 바 :. 500 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
(즉 2 μL) 당 바이러스 역가에 따라 GFP / RFP 발현의 존재에 의해 효과를 판정하는보다 안정하다. 이 실험에 적합한 바이러스 역가를 조정하는 데 도움이됩니다.
망막 주사는 그림 4 (40 배)와 그림 5 (400X)의 다양한 확대에 나타내었다 후 RPE / 맥락막의 대표 결과 / 공막은 평면 복잡한 십주를 탑재합니다. 낮은 배율의 사진 GFP / RFP 발현 영역을 평가하기에 충분하다. 한편, 고배율 이미지 연구자들의 특정한 목적에 관련된 다른 RPE 병리 필요하다. 이러한 이미지의 지혜H 다양한 배율은 망막 색소 상피의 바이러스 발현 패턴을 이해하는 데 도움이 (그림 4, 5). 우리는 또한 36주이 주사를 남기시려면 GFP / RFP의 발현을 확인했다. GFP / RFP 발현 여전히 36주 포스트 주입 후에 관찰되었다 (데이타 미기재).
그림 4. 망막 색소 상피의 예 공막 / 맥락막 /는 복잡한 GFP / RFP 유전자 (배율 : 40X)과의 Lentivirus의 망막 주입 후 10 주를 플랫 마운트합니다. (A) 녹색 채널을 GFP (B) RFP 빨간색 채널. 스케일 바 :. 500 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 플랫 복잡한 공막 RPE / 맥락막 /의 예GFP / RFP 유전자 (배율 : 400X)과의 Lentivirus의 망막 주사 후 -mount 10 주. () GFP (B) RFP 빨간색 채널에 대한 녹색 채널. 스케일 바 :. 50 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 비디오 문서에서는, 우리는 RPE / 맥락막 / 공막 평면 마운트의 대표적인 결과를 상세하게 윤부-접근 망막 주입 기술을 설명했다. 이것은 망막 색소 상피에 바이러스 벡터의 망막 주입을위한 쉽고 편리한 기술이다. 주입시 여과포 형성의 직접 시각화는 초보자를위한 정확한 전달을위한 중요한 단계입니다. 시각 실험 8-10의 저널에 소개 된 일부 망막 사출 기술이있다. 망막 하 공간이 망막과 망막 색소 상피 사이의 잠재적 인 공간이다, 따라서 망막 하 공간에 접근하는 두 가지 경로가있다. 하나는 유리체 및 망막을 통해 망막 공간 내부 방식이고, 다른 하나는 RPE 및 공막을 통한 외부 접근이다. 이 윤부-접근 망막 주입 기술은 유리체 강내 공간과 망막을 통해 이전의 하나입니다. 이 기술은 후자에 비해 더 후방 여과포 형성을 제공하는 장점을 가지고 있기 때문에, 후자pproach은 주변 망막을 통해 이루어져야한다 공막 터널 또는 절개를 통해 외주 측에서 여과포한다. 또한, 간단한 윤부 구멍 망막 침투하지 않고 공막 터널보다 쉽습니다. 신생아 생쥐 들어, 그러나, 외부 접근 구를 이용하는 것이 더욱 적합 할 것이다. 신생아 마우스의 안구가 매우 작고 렌즈의 전체이기 때문에, 윤부-접근 기술은 원치 않는 백내장 형성 또는 안구로의 bulbi의 원인이 될 수 있습니다.
이 프로토콜에 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 우선, 초기 구멍은 각막에 너무 앞쪽에 구멍을 뚫거나 아이리스 감금하게, 또는 너무 뒤쪽 구멍은 주변 망막에 직접 구멍을 만들기 때문에 장소가 약간 윤부에 후부해야한다. 둘째, 그것은 초기 펑크를하는 동안 바늘로 렌즈를 타격 않도록주의하는 것이 좋습니다. 또한, 렌즈 구멍을 피하기 위해 바늘의 베벨 전체를 삽입하지 않는 것이 좋다. 셋째, B바늘의 EST 접근 각도는 조리개면에 대해 약 45도이며, 무딘 바늘은 유두 주위 지역을 향해 후방으로 밀어해야합니다. 마지막으로, 바늘, 그렇지 않으면 난민 바늘 유리체 강내 주입이 발생, 균일 한 여과포 형성의 결과로, 주입시 망막 하 공간에 배치해야합니다.
눈은 유전자 치료 (11)에 대한 매력적인 대상 수 있도록 고유의 기능을 가진 작은 기관이다. 구체적으로는 비교적 낮은 독성 및 눈의 면역 반응 및 부작용 전신 효과를 유전자 요법을 가능 면역 특권 작은 밀폐 실이다. 쉽게 시각화 및 수술 방법에 준비 접근성 유전자 치료에 대한 눈의 다른 장점이다. 망막은 별개의 층 (10)으로 구성되어 매우 얇은 층 구조를 갖는다. 따라서, 정확한 공간적 유전자 전달은 안구 내 주사의 적절한 방법에 의해 달성 될 수있다. INTR에 대한 가장 일반적인 두 가지 방법바이러스 벡터의 aocular 배달 유리체 강내 주입 및 망막 주사 (6)이다. 일반적으로, 유리체 강내 주입 망막 신경절 세포와 뮐러 세포를 대상으로 내부 망막에 대한 선호 경로입니다. 망막 주입은 광 수용체 세포와 망막 색소 상피 세포를 대상으로 외부 망막의 기본 노선이다. RPE의 효율적인 형질 도입의 경우, subretinally 망막 손상에 대한 가능성에도 불구하고 바이러스 벡터를 제공하는 것이 필요하다.
이 연구에서 우리는 시각화를위한 GFP 및 RFP와 LV 벡터를 사용했다. 바이러스 벡터는 망막의 특정 세포 유형에 대한 친 화성을 가지고 있기 때문에, 바이러스 벡터는 세포 5를 대상으로 AAV, 라스베가스,의 친 화성 및 광고에 따라 선택해야합니다. 예를 들어, AAV2 / 2 AAV2 / 6 및 AAV2 / 8 RGC 및 뮐러 세포에 높은 전달 효율이다. AAV2 / 5, 2/7, 2/8 및 2/9 효율적 AAV2 / 8 마우스 5,12-을 가장 효율적으로 혈청 인과 광 수용체 세포와 망막 색소 상피를 형질 도입 5 형질 도입. LV 벡터를 들어, 강내 주사 13 일 후 망막 하 주사 후의 RPE 세포에서 발현하지만, 거의 또는 전혀 발현의 높은 수준이있다.
RPE 효과적인 유전자 전달 들어, 바이러스 프로모터가 또한 고려되어야한다. 이러한 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 프로모터 및 키메라 닭 베타 - 액틴 / CMV 프로모터 인핸서 같은 바이러스 프로모터, 즉, 그들은 유전자 치료 연구의 대부분에서 사용되는 강한 유비쿼터스 프로모터이다. RPE에서 CMV 프로모터 RPE65 촉진제 (14)와 비교하여 다량의 단백질을 열 배 표현하는 것으로 추정된다. 중요한 것은, 프로모터 및 혈청 형을 포함하여 바이러스 벡터의 최적의 조합은 인간의 RPE65 프로모터가 혈청 형 rAAV2 / 4 rAAV2 이상 / 2 (15)에 포장 할 때 RPE65의 우수한 표현에 의해 입증으로 더 나은 결과를 달성해야한다. 망막 색소 상피 세포에 유전자 전달에 초점을 맞추고, RPE-SP이러한 RPE65 또는 VMD2 프로모터 ecific 프로모터 오프 대상 안전 16를 발행 줄인다.
AMD는 건조 AMD 불리는 퇴행성 위상과 젖은 AMD 언급 맥락막 신생 혈관을 특징으로하는 단계와 두 단계가 복잡한 질병이다. 또한, AMD는 보체 인자 H (CFH) 등 다양한 유전 적 감수성, 나는 (CFI), 연령 관련 황반 병증 감수성 2 (ARMS2)과 아포 E가 17 요인, 환경 위험과 결합 계수를, C3을 보완 보완하는 질환이다. AMD 인해 유전 위험 인자의 복잡한 특성 때문에, 그 유전자 치료를위한 하나의 후보 유전자가 없다. 따라서, AMD에서 현재 유전자 치료는 습식 AMD 18 맥락막 신생 혈관을 표적으로 항 혈관 신생 단백질을 발현하는 유전자 전달에 초점을 맞추고있다. 유전자 치료와 건식 AMD를 치료하기위한 아직 후보 유전자는 없다. 최근에, 우리는 세포 내 아밀로이드 베타 축적 할 수 있었던 것을 제안트랜스 제닉 마우스 19 AMD 기능 건조 관련 될. 또한, subretinally 주입 아밀로이드 베타가 쥐에서 망막 색소 상피에 의해 촬영되었다 (데이터가 공개되지 않음). 우리는 바이러스 성 단백질 분해 효소 (20)와 세포 내 아밀로이드 베타를 절단 할 수 있습니다. 따라서, 우리는 더 잠재적 인 대상과 건조 AMD의 유전자 치료를 연구 하였다.
결론적으로, 안 질환의 유전자 치료는 다른 장기보다 더 밝다. 또한, 망막 하 주사, 특히 시각 세포 RPE와 관련하여, 망막 질환의 유전자 치료를위한 기본적인 기술이다. 그러므로, 우리는이 기술이 더 널리 이용되고 단일 유전자는 망막 아니라 연령 관련 황반 변성증에서 상속뿐만 아니라 유전자 요법의 진보에 공헌 할 수 있다고 기대.
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Acknowledgments
본 연구는 서울 대학교 연구 그랜트 (800-20140542)에 의해 지원되었다, NRF / 교육 과학 기술부의 개척자 연구 프로그램 (2012-0009544)과 NRF / 교육 과학 기술부의 바이오 신호 분석 기술 혁신 프로그램 (2009-0090895) 과 NRF / 교육 과학 기술부의 그랜트 (2015M3A9E6028949).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS | WPI | 500233 | |
| VANNAS Scissors S/S, 105 mm | WPI | 555583S | |
| 33 G Blunt needle | WPI | NF33BL-2 | |
| NanoFil Syringe, 10 microliter | WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | For easy one hand injection |
| 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) BD PrecisionGlideTM Needle | BD | 305107 | Initial puncture for subretinal injection |
| Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter) | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Leica operating microscope | Leica | LM M80 | |
| Fluoresecein microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Lentivirus | Thermo scientific | TMO.LV-Ctr | Used to dilute vectors |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to dilute vectors |
| Troperin (Phenylephrin 0.5% - Tropicamide 0.5%) | Hanmi | For dilation | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Sterile) | Bausch&Lomb | For topical anesthesia | |
| Healon GV OVD | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50 (tiletamine hypochloride and zolazepam hypochloride) | Virbac | For general anesthesia | |
| Rompun injection (Xylazine HCl) | Bayer | For general anesthesia |
References
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