Introduction
Oogheelkunde, heeft gentherapie ontpopt als de behandeling modaliteit in monogene erfelijke retinopathieën. Er zijn geërfd retinopathieën geassocieerd met genen in retinale pigment epitheel (RPE), met inbegrip van Leber congenitale amurosis 1,2, retinitis pigmentosa 3 en choroideremia 4. Het onderzoek gebied van gentherapie is uit te breiden, zowel in preklinische studies en klinische proeven met behulp van virale vectoren zoals adeno-geassocieerde virus (AAV), lentivirus (LV) en adenovirus (Ad) 5. Verschillende virale vectoren hebben verschillende tropisme in de retina. Voor een veilige en effectieve gentherapie, virale vectoren moeten zorgvuldig worden geselecteerd op basis van doelcellen en doelgenen.
De route van genoverdracht is ook belangrijk voor effectieve genoverdracht aan doelcellen dus moet zorgvuldig worden eveneens gekozen. De twee meest voorkomende methoden voor intra-oculaire aflevering van virale vectoren zijn subretrechtelijke injectie en intravitreale injectie 6. Laatstgenoemde, intravitreale injectie, is op grote schaal gebruikt om geneesmiddelafgifte te choroïdale neovascularisatie in natte leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) en maculair oedeem bij diabetische retinopathie 7 behandelen. Intravitreale route verschaft blootstelling van virale vectoren voor glasvocht en binnenste retina, maar de diffusie van de vectoren naar de buitenste retina beperkt. Anderzijds, de subretinale route biedt rechtstreekse afgifte van virale vectoren aan de mogelijke ruimte tussen retina en RPE, induceren een gelokaliseerd bleb. Daarom wordt subretinale injectie momenteel beschouwd als meer efficiënte route voor het richten RPE en fotoreceptorcellen. Qua chirurgische benadering, pars plana wordt gekozen als een veilig gebied voor intravitreale injectie retinale schade bij menselijke patiënten te voorkomen. Door simpelweg het wijzigen van deze aanpak aan muizen, konden we virale vectoren subretinally of intravireally injecteren via limbale aanpak.
In deze videoartikel tonen we een eenvoudige en handige methode van subretinale injectie van virale vectoren in muizen RPE. Na enkele punctie bij posterior aan limbus met een 30 G 1/2 naald wordt een 33 G stompe naald uitgerust microliter spuit ingevoegd in de subretinale ruimte via de limbale prikplaats. De virale vectoren van 1,5-2 ul volume geïnjecteerd om de potentiële ruimte tussen retina en RPE induceren subretinale blebs. Deze werkwijze kan onder directe visualisatie worden uitgevoerd middels chirurgische microscoop. Herhaalde praktijk zal garanderen reproduceerbare resultaten, zelfs zonder directe visualisatie van de blaar formatie. Dit zal helpen de onderzoekers om nauwkeurige en tijdbesparende experimenten uit te voeren voor subretinale gentherapie bij muizen RPE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de Vereniging voor Onderzoek in Vision en Oogheelkunde Verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Geluid Onderzoek en de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Seoul National University Institutional Animal Care en gebruik Comite en Seoul National University Hospital Bioveiligheid Comité.
1. Voorbereiding Injection Kit en virale vectoren
- Bereid de microliter spuit uitgerust met een 33 G stompe naald gesteriliseerd met ethyleenoxide gas. Verdun de virale vectoren in PBS voor de adequate titer in de micro tube (dwz 1 x 10 6 TU / ul). Spoel de spuit enkele malen met virale vectoren om elke dode ruimte te verwijderen in de spuit.
2. Subretinal Injectie van virale vectoren
- Verdoven volwassen muizen (dwz, 6-8 weken oud) een intraperitoneale injectie van het mengsel van tiletamine en zolazepam (1: 1, 2,25 mg / kg lichaamsgewicht) en xylazine hydrochloride (0,7 mg / kg lichaamsgewicht) of een andere geschikte anesthesie regime.
- Verwijden leerlingen met een oog druppel fenylefrine 0,5% en tropicamide 0,5%.
- Bereid de microliter spuit door belading met 1,5-2 ul virale vectoren.
- Open het ooglid en steken het oog op de evenaar voor gemakkelijke injectie bloot en focus op onder de operatiemicroscoop. Handhaaf het uitstekende ooghoogte tot de voltooiing van de injectie, of verplaatsing van de naald kan optreden tijdens de injectie. Om de oogbol stevig vast te houden, plaats de vingers buiten de orbitale rand.
- Breng een druppel oftalmische viscoelastische oplossing van het hoornvlies.
- Plaats een rond dekglaasje op de top van het hoornvlies tot het netvlies te visualiseren.
- Doorboren klein gaatje aan lichte de limbus met een steriele 30 G 02/01 naald voor de verdere subretinale injectie. Maak het gat inferieure for het rechteroog en superieur voor het linkeroog voor het gemak.
OPMERKING: Als het gat is gemaakt op tijdelijke of nasale, is het moeilijk om te worden gedekt door het ooglid na de injectie. Initiële punctie moet iets worden achter de limbus de limbale vaten die langs de limbus en gemakkelijk herkenbaar voorkomen. Wees voorzichtig om te voorkomen dat het raken van de lens met een naald tijdens het maken van de eerste lekke band. Steek het hele afschuining van de naald om de lens punctie te voorkomen. - Plaats de 33 G stompe naald van microliter spuit door de pre-lekke gat en de aanpak van de naald in de subretinale ruimte tot het moment waarop een milde weerstand wordt gevoeld.
LET OP: Voor de subretinale injectie, de beste aanpak hoek van de naald is ongeveer 45 graden tegen iris vliegtuig, en de stompe naald moet naar achteren worden geschoven in de richting van pupil- omgeving. Gestippelde vierkant aangegeven de voorgestelde naald pad over het glasachtig holte van de subretinale spuitgietenn in figuur 1.
OPMERKING: Er zullen geen weerstand voelde toen piercing (of passeren) de retinale lagen zoals ze zijn erg zacht. Aldus, de eerste gevoel van lichte weerstand geeft aan dat de naald reeds aangeraakt RPE laag en het inbrengen van de naald moet worden gestopt. Wees voorzichtig om geen sclerale weefsel dringen met hoge druk, omdat de naald in de potentiële subretinale ruimte moet worden geplaatst. Als de naald prikt de sclerale weefsel door overmatige kracht, gaat het in de oculaire orbitale ruimtes zonder weerstand. (Deze stap is essentieel)
Figuur 1. Schematisch diagram van de Subretinal Injection. H & E gekleurde dwarsdoorsnede van de muis oog die de structuren met een naald route voor de subretinale injectie aangegeven (gestippeld vierkant). Vergroting: 40X, Schaal bar: 500 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Injecteer de virale vectoren (dat wil zeggen, 1 x 10 6 TU / ul) voorzichtig in de subretinale ruimte zonder tremor om ongewenste weefselschade te voorkomen en de naald zachtjes trekken. Houd de oogbol vast tijdens de injectie zoals beschreven in 2.4.
- Let op de vorming van subretinale bleb na de injectie onder operationele microscoop om ervoor te zorgen dat er geen netvlies bloeden.
Figuur 2. Subretinal Belb Vorming zonder retinale bloeding. Microscopische mening van subretinale belb na de subretinale injectie onder operatiemicroscoop blijkt succesvolle blaar vorming zonder retinale bloeding.m / files / ftp_upload / 53030 / 53030fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Sluit voorzichtig het ooglid aan de injectieplaats voor zelfdichtende dekken. Terug de muizen naar huis kooi en levend houden totdat de evaluatie.
OPMERKING: Nadat de onderzoekers wennen aan de procedures, kunnen ze de herhaalbare resultaten met snelle procedures komen door het overslaan van deze stappen (2,5, 6 en 10)
3. Evaluatie van de werkzaamheid van Gene Levering in retinaal pigment epitheel
- Offer de muizen in de CO 2 kamer. Ophelderen met een schaar de ogen.
- Bevestig de ogen in 4% paraformaldehyde oplossing bij 4 ° C gedurende ten minste 1 uur tot enkele dagen.
- Pak het hoornvlies met fijne pincet en punctie het hoornvlies met micro-schaar. Verwijder de cornea na scharende langs de limbus. Verwijder de lens met een tang.
- Trim de ciliaire lichaam met mICRO-schaar waardoor netvliesloslating. Trek de hele netvlies van de RPE / choroid / sclera complex. Snijd de RPE / choroid / sclerale complex radiaal vanaf de omtrek naar het centrum Bij oogzenuw meerdere malen 4-8 bladeren voor vlakke montage maken.
- Flip de RPE / choroïd / sclerale complex RPE naar beneden te maken, en trim alle resterende weefsels aan de sclerale zijkant waaronder de spieren, bindweefsel en de oogzenuw. Deze stap is belangrijk om een vlakke RPE / choroïd / sclerale complexer omdat het resterende weefsel maakt het complex ongelijk.
- Incubeer het complex met primaire en secundaire antilichaam voor uw specifieke onderzoeksdoeleinden (optioneel, zie de verwijzingen voor gedetailleerde methoden). Flat-mount de RPE / choroïd / sclerale complexen op het glas glijbaan en absorberen de PBS met een absorberende spons.
- Voeg 30 ul van de montage-oplossing en plaats de deksel dia. Observeer het monster voor de werkzaamheid van vector levering onder fluoresceïne microscoop. Laat de monsters inde koelkast voor verdere observatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de effectiviteit van de subretinale injectie op viraal gen transductie evalueren van dit protocol, gebruikten we in de handel verkrijgbaar LV vectoren met CMV promoter die zowel GFP en RFP de indicator. Ogen werden enucleated na de juiste tijd volgens het onderzoek doel. Voor representatieve resultaten zijn ogen enucleatie 10 weken en 20 weken na de subretinale injectie. Na volledige verwijdering van de retina volgens de hierboven beschreven werkwijze, de vlakke onderstel van RPE / choroid / sclera complex werd geëvalueerd onder fluorescentiemicroscoop. De representatieve resultaten zijn getoond in figuur 3A (voorbeeld met volledige verwijdering van de retina) en figuur 3B (slecht voorbeeld intacte retina). Hoewel de aanwezigheid van restant neurale retina (vooral fotoreceptor buitensegment) langer RPE laag interfereerde niet tot het gebied van genafgifte in RPE analyseren, blokkeerde de fluorescentie van GFP / RFP en remde direct Visuabiliseren van RPE laag voor verdere analyses. Daarom zou volledige verwijdering van neurale retina van de RPE / choroid / sclera complex betere resultaten.
Figuur 3. Het voorbeeld van RPE / Choroid / Scleral Complex Flat-mount volgens de volledige verwijdering van de Retina. Twintig weken na Subretinal Injectie van Lentivirus met GFP / RFP Gene. (A) Goed voorbeeld van RPE vlakke houder met volledige verwijdering van de retina vertoonde duidelijke en discrete expressie van GFP / RFP in de RPE cellen. (B) Slechte voorbeeld van RPE vlakke montage omdat er geen verwijdering van de retina toont het gebied van gentherapie met RFP signalen die ontoereikend is om het RPE pathologie analyseren. Vergroting: 40X, Schaal bar:. 500 pm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
(ie 2 pl). Dit helpt om geschikte virale titer passen voor het experiment.
De vertegenwoordiger resultaten van RPE / choroïd / sclerale complex flat monteren 10 weken na subretinale injectie in verschillende vergroting in figuur 4 (40X) en Figuur 5 (400X) werden getoond. De beelden met lage vergroting genoeg om het gebied van GFP / RFP uitdrukking uit. Anderzijds, de beelden met hoge vergroting nodig zijn voor andere RPE pathologie betrekking tot specifieke doeleinden onderzoekers. Deze beelden with verschillende vergrotingen helpen de virale expressiepatroon in RPE begrijpen (figuur 4 en 5). We hebben ook gecontroleerd de expressie van GFP / RFP tot 36 weken na de injectie. De expressie van GFP / RFP werd steeds waargenomen na 36 weken na injectie (data niet getoond).
Figuur 4. Het voorbeeld van RPE / Choroid / Scleral Complex Flat-mount 10 weken na Subretinal Injectie van Lentivirus met GFP / RFP Gene (Vergroting: 40X). (A) groene kanaal voor GFP (B) rode kanaal voor RFP. Schaal bar:. 500 pm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Voorbeeld van RPE / Choroid / Scleral Complex Flat-mount 10 Weken na Subretinal Injectie van Lentivirus met GFP / RFP Gene (Vergroting: 400X). (A) groene kanaal voor GFP (B) rode kanaal voor de RFP. Schaal bar:. 50 pm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze video artikel beschreven we de limbale-aanpak subretinale injectietechniek in detail met representatieve resultaten van RPE / choroïd / sclerale flat-mount. Dit is een eenvoudige en handige techniek voor subretinale injectie van virale vectoren in RPE. Directe visualisatie van bleb formatie tijdens de injectie is een belangrijke stap voor accurate levering voor de beginners. Er zijn enkele subretinale injectie technieken geïntroduceerd in Journal of Visualized Experimenten 8-10. Subretinale ruimte is de potentiële ruimte tussen retina en RPE, daarom zijn er twee mogelijke routes naar de subretinale ruimte benaderen. Eén is een inside benadering van de subretinale ruimte via glasvocht en het netvlies en de andere is een buiten benadering via RPE en sclera. Deze limbale-aanpak subretinale injectie techniek is de voormalige één via intravitreale ruimte en netvlies. Deze techniek heeft het voordeel meer posterior bleb vorming ontstaan ten opzichte van het tweede omdat deze eenAANPAK maakt bleb de omtrekszijde via sclerale tunnels of incisie, die moet worden aangebracht op de perifere retina. Bovendien eenvoudige limbale punctie eenvoudiger dan sclerale tunnels zonder retinale penetratie. Voor de neonatale muizen, zou het echter beter de buitenzijde benadering 9 gebruiken. Omdat de oogbol neonatale muis is zeer klein en vol van de lens, kan limbale-aanpak techniek ongewenste cataractvorming of zelfs phthisis bulbi veroorzaken.
Er zijn een aantal cruciale stappen in dit protocol. Allereerst dient initiële punctie zijn plaats enigszins achter de limbus omdat te anterior punctie bij de cornea maakt iris opsluiting ofte posterior punctie maakt direct gat aan de perifere retina. Anderzijds wordt aanbevolen voorzichtig te ontwijken de lens met de naald tijdens het maken van de initiële punctie te zijn. Het is beter de hele schuine kant van de naald om de lens punctie te voorkomen niet in te voegen. Ten derde, de best benadering hoek van de naald is ongeveer 45 graden tegen iris vliegtuig, en de stompe naald moet naar achteren worden geschoven in de richting van pupil- omgeving. Tenslotte moet de naald in de subretinale ruimte worden geplaatst tijdens het injecteren, wat resulteert in uniform bleb formaties, anders kan de verplaatste naald veroorzaakt intravitreale injectie.
Het oog is een klein orgaan met unieke eigenschappen die het een aantrekkelijk doelwit voor gentherapie 11 maken. Concreet is een kleine omsloten ruimte met immuun-privilege die gentherapie mogelijk maakt met een relatief lage toxiciteit en immunologische reacties in het oog en geen nadelige effecten. Eenvoudige visualisatie en eenvoudige verkrijgbaarheid chirurgische benaderingen zijn andere voordelen van het oog voor gentherapie. De retina heeft een zeer georganiseerde laminaatstructuur met 10 afzonderlijke lagen. Zo kan een nauwkeurige ruimtelijke genaflevering alleen worden bereikt door de juiste methoden van intra-oculaire injectie. De twee meest voorkomende methoden voor intraocular afgifte van virale vectoren zijn intravitreale injectie en subretinale injectie 6. In het algemeen, intravitreale injectie is de aangewezen route voor innerlijke netvlies richten retinale ganglioncellen en Müller cellen. Subretinale injectie is de voorkeursroute voor de buitenste retina richten fotoreceptorcellen en RPE cellen. Voor een efficiënte transductie in RPE, is het noodzakelijk virale vectoren leveren subretinally ondanks de mogelijke schade aan de retina.
In deze studie hebben we gebruik LV vectoren met GFP en RFP voor de visualisatie. Omdat virale vectoren tropisme voor bepaalde celtypen van de retina, dient virale vectoren worden gekozen volgens tropisme van AAV, LV en Ad cellen 5 te richten. Bijvoorbeeld, AAV2 / 2, AAV2 / 6 en AAV2 / 8 zijn de hoogste transductie efficiëntie RGC en Müllercellen. AAV2 / 5, 07/02, 08/02 en 09/02 efficiënt transduceren RPE en fotoreceptorcellen met AAV2 / 8 zijn de meest efficiënte serotype in muizen 5,12 5. Voor LV vectoren, is een hoog expressieniveau in RPE cellen na subretinale injecties, maar weinig of geen expressie na intravitreale injecties 13.
Voor een effectieve gen-afgifte aan RPE dient virale promoters worden beschouwd. Virale promoters, zoals de cytomegalovirus (CMV) promoter en chimere kippen beta-actine / CMV enhancer promoter sterk en alomtegenwoordige promotoren dus worden ze gebruikt in de meerderheid van gentherapie studies. In RPE, is de CMV promoter geschat uiten tien keer zo veel eiwit in vergelijking met het RPE65 promotor 14. Van belang is, dient de optimale combinatie van de promoter en virale vectoren waaronder serotype bereikt betere resultaten blijkt uit hogere expressie van RPE65 wanneer het menselijk RPE65 promoter zijn verpakt in serotype rAAV2 / 4 dan rAAV2 / 2 15. Focussen op gen-levering aan RPE cellen RPE-specifieke promoters zoals de RPE65 of VMD2 promotor vermindert de off-target veiligheid kwesties 16.
AMD is een complexe ziekte die twee fasen een bij droge AMD degeneratieve fase en een fase gekenmerkt door genoemd natte AMD choroïdale neovascularisatie is. Ook AMD is een ziekte waarbij tal van genetische aanleg, waaronder complement factor H (CFH), aanvulling C3, een aanvulling op factor I (CFI), leeftijd maculopathie gevoeligheid 2 (ARMS2) en ApoE worden gecombineerd met het milieu risicofactoren 17. Vanwege de complexiteit van genetische risicofactoren AMD, is er geen enkele kandidaatgen voor de gentherapie. Aldus wordt de huidige gentherapie bij AMD gericht op genoverdracht op anti-angiogene eiwitten targeting choroïdale neovascularisatie drukken bij natte AMD 18. Er is geen kandidaatgen nog voor de behandeling van droge AMD met gentherapie. Onlangs hebben we gesuggereerd dat de intracellulaire amyloïde beta accumulatie kongerelateerd aan AMD functies drogen in transgene muizen 19. Bovendien werd subretinally geïnjecteerd amyloid beta opgenomen door RPE bij muizen (data niet gepubliceerd). We kunnen intracellulaire amyloïde beta klieven met virale protease 20. Zo hebben we verder onderzocht gentherapie in droge AMD met potentiële doelwitten.
Concluderend gentherapie bij oculaire ziekte is veelbelovender dan in andere organen. Bovendien subretinale injectie een fundamentele techniek voor gentherapie bij retinale ziekten, met name met betrekking tot RPE en fotoreceptorcellen. Zo hopen we dat deze techniek wordt op grotere schaal gebruikt en kan bijdragen aan de vooruitgang van gentherapie niet alleen in monogene erfelijke retinopathie, maar ook in leeftijdsgebonden maculaire degeneratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de Seoul National University Research Grant (800-20140542), de Pioneer Research Program van NRF / MEST (2012-0009544), en de Bio-Signal Analysis Technology Innovation Program van NRF / MEST (2009-0090895), en de verlening van NRF / MEST (2015M3A9E6028949).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS | WPI | 500233 | |
| VANNAS Scissors S/S, 105 mm | WPI | 555583S | |
| 33 G Blunt needle | WPI | NF33BL-2 | |
| NanoFil Syringe, 10 microliter | WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | For easy one hand injection |
| 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) BD PrecisionGlideTM Needle | BD | 305107 | Initial puncture for subretinal injection |
| Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter) | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Leica operating microscope | Leica | LM M80 | |
| Fluoresecein microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Lentivirus | Thermo scientific | TMO.LV-Ctr | Used to dilute vectors |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to dilute vectors |
| Troperin (Phenylephrin 0.5% - Tropicamide 0.5%) | Hanmi | For dilation | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Sterile) | Bausch&Lomb | For topical anesthesia | |
| Healon GV OVD | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50 (tiletamine hypochloride and zolazepam hypochloride) | Virbac | For general anesthesia | |
| Rompun injection (Xylazine HCl) | Bayer | For general anesthesia |
References
- Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
- Jacobson, S. G., et al. Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years. Arch Ophthalmol. 130 (1), 9-24 (2012).
- Conlon, T. J., et al. Preclinical potency and safety studies of an AAV2-mediated gene therapy vector for the treatment of MERTK associated retinitis pigmentosa. Hum Gene Ther Clin Dev. 24 (1), 23-28 (2013).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet. 383 (9923), 1129-1137 (2014).
- Trapani, I., Puppo, A., Auricchio, A. Vector platforms for gene therapy of inherited retinopathies. Prog Retin Eye Res. 43, 108-128 (2014).
- Liang, F. Q., Anand, V., Maguire, A. M., Bennett, J.
- Peyman, G. A., Lad, E. M., Moshfeghi, D. M.
- Matsumoto, H., Miller, J. W., Vavvas, D. G. Retinal detachment model in rodents by subretinal injection of sodium hyaluronate. J Vis Exp. (79), (2013).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J Vis Exp. (69), (2012).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Sahel, J. A., Roska, B.
- Allocca, M., et al. Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors. J Virol. 81 (20), 11372-11380 (2007).
- Takahashi, K., et al. Sustained transduction of ocular cells with a bovine immunodeficiency viral vector. Hum Gene Ther. 13 (11), 1305-1316 (2002).
- Rolling, F., et al. Gene therapeutic prospects in early onset of severe retinal dystrophy: restoration of vision in RPE65 Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Bull Mem Acad R Med Belg. 161 (10-12), 497-508 (2006).
- Le Meur, G., et al. Restoration of vision in RPE65-deficient Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Gene Ther. 14 (4), 292-303 (2007).
- Alexander, J. J., Hauswirth, W. W. Adeno-associated viral vectors and the retina. Adv Exp Med Biol. 613, 121-128 (2008).
- Puche, N., et al. Genetic and environmental factors associated with reticular pseudodrusen in age-related macular degeneration. Retina. 33 (5), 998-1004 (2013).
- Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Hum Gene Ther. 22 (5), 523-529 (2011).
- Park, S. W., et al. Intracellular amyloid beta alters the tight junction of retinal pigment epithelium in 5XFAD mice. Neurobiol Aging. 35 (9), 2013-2020 (2014).
- Shin, B., et al. Intracellular cleavage of amyloid beta by a viral protease NIa prevents amyloid beta-mediated cytotoxicity. PLoS One. 9 (6), e98650 (2014).
