Introduction
En ophtalmologie, la thérapie génique a émergé comme la modalité de traitement dans les rétinopathies héréditaires monogéniques. Il ya rétinopathies héréditaires associés à des gènes de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dont Leber amurosis congénitale 1,2, la rétinite pigmentaire 3 et 4 choroideremia. Le domaine de la thérapie génique de la recherche est en pleine expansion dans les deux études précliniques et des essais cliniques utilisant des vecteurs viraux tels que le virus adéno -associated (AAV), lentivirus (LV) et l'adénovirus (Ad) 5. Différents vecteurs viraux ont un tropisme différent dans la rétine. Pour une thérapie génique efficace et sans danger, les vecteurs viraux doivent être soigneusement sélectionnées en fonction des cellules cibles et des gènes cibles.
La voie d'administration de gènes est également important pour la délivrance de gènes efficace à des cellules cibles, par conséquent, il doit être choisi avec soin aussi bien. Les deux méthodes les plus courantes pour la livraison intra-oculaire de vecteurs viraux sont subretInal injection et injection intravitréenne 6. Ce dernier, l'injection intravitréenne, a été largement utilisé pour l'administration de médicaments pour traiter la néovascularisation choroïdienne dans humide de la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) et de l'œdème maculaire dans la rétinopathie diabétique 7. Voie intravitréenne offre une exposition à des vecteurs viraux vitré et la rétine interne, mais la diffusion des vecteurs de rétine externe est limitée. D'autre part, la voie sous-rétinien fournit plus directement de vecteurs viraux à l'espace potentiel entre la rétine et RPE, induisant une bulle localisée. Par conséquent, l'injection sous-rétinien est actuellement considéré comme une voie plus efficace pour cibler des cellules photoréceptrices et RPE. En termes d'approche chirurgicale, pars plana est choisie comme une zone de sécurité pour injection intravitréenne pour éviter d'endommager la rétine chez des patients humains. En modifiant simplement cette approche à des souris, nous pourrions injecter vecteurs viraux sous-rétinienne ou intravireally via approche limbique.
Dans cette vidéoarticle, nous démontrons une méthode facile et pratique de l'injection sous-rétinien de vecteurs viraux dans des souris RPE. Après la ponction unique au postérieure à limbe avec une aiguille 30 G 1/2, un 33 G aiguille émoussée microlitre équipée seringue est insérée dans l'espace sous-rétinien via le site de ponction limbique. Les vecteurs viraux de 1,5 à 2 volume ul sont injectés à l'espace potentiel entre la rétine et RPE induire bulles sous-rétiniens. Cette procédure peut être réalisée sous visualisation directe utilisant microscope chirurgical. Pratique répétée garantira des résultats reproductibles, même sans la visualisation directe de la formation de vésicules. Cela aidera les chercheurs à réaliser des expériences précises et gagner du temps pour la livraison de gènes sous-rétinien chez la souris RPE.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec l'Association pour la recherche en vision et ophtalmologie Déclaration pour l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et Vision Research, et les directives et règlements énoncés par le Comité nationale de Séoul soin et l'utilisation des animaux et institutionnelle Université nationale de Séoul Comité de biosécurité de l'hôpital universitaire.
1. Préparation Kit d'injection et vecteurs viraux
- Préparer la seringue microlitre équipé d'une aiguille émoussée 33 G stérilisée en utilisant du gaz d'oxyde d'éthylène. Diluer les vecteurs viraux dans PBS pour le titre adéquat dans le micro tube (soit 1 x 10 6 TU / pi). Rincer la seringue à plusieurs reprises avec des vecteurs viraux pour éliminer tout espace vide dans la seringue.
2. Injection sous-rétinienne de vecteurs viraux
- Anesthésier les souris adultes (par exemple, 6 - 8 semaines) par une injection intraperitoneale du mélange de tiletamiet ne zolazepam (1: 1, 2,25 mg / kg de poids corporel) et de chlorhydrate de xylazine (0,7 mg / kg de poids corporel) ou un régime d'anesthésie adapté alternative.
- Dilater les élèves avec un collyre de phényléphrine 0,5% et tropicamide 0,5%.
- Préparer la seringue microlitre en chargeant avec 1,5 à 2 pi de vecteurs viraux.
- Ouvrir la paupière et l'oeil en saillie pour exposer l'équateur pour injection pratique et se concentrer sur la sous microscope opératoire. Maintenir la position de l'oeil en saillie jusqu'à terminer l'injection, ou le déplacement de l'aiguille peut se produire lors de l'injection. Pour tenir le globe oculaire fermement, placer les doigts à l'extérieur du rebord orbitaire.
- Appliquer une goutte de solution viscoélastique ophtalmique à la surface de la cornée.
- Placer une petite lamelle ronde sur le haut de la cornée afin de visualiser la rétine.
- Percer un petit trou à peu en arrière du limbe en utilisant une aiguille stérile 30 G 1/2 pour la poursuite de l'injection sous-rétinien. Faire le trou inférieur for l'œil droit, et supérieur pour l'oeil gauche pour la commodité.
NOTE: Si le trou est fait au temporelle ou nasale, il est difficile d'être couvert par la paupière après l'injection. Ponction initiale devrait être rendue légèrement derrière le limbe pour éviter les vaisseaux limbiques qui courent le long du limbe et peut être facilement reconnus. Soyez prudent pour éviter de heurter la lentille avec l'aiguille tout en rendant la ponction initiale. Ne pas insérer l'ensemble du biseau de l'aiguille pour éviter lentille crevaison. - Placez l'aiguille émoussée 33 G de microlitre seringue à travers le trou pré-percé et l'approche de l'aiguille dans l'espace sous-rétinien jusqu'au moment où une légère résistance se fait sentir.
NOTE: Pour l'injection sous-rétinien, le meilleur angle d'approche de l'aiguille est d'environ 45 degrés contre iris avion, et l'aiguille émoussée doit être poussé en arrière vers la zone péripapillaire. Carré en pointillés indique la voie de l'aiguille suggéré dans la cavité vitréenne pour la sous-rétinien injection sur la figure 1.
NOTE: Il n'y aura pas de résistance ressentie lorsque perçage (ou passage) les couches de la rétine car ils sont très doux. Ainsi, le premier sentiment de légère résistance indique que l'aiguille a déjà touché la couche RPE et l'insertion de l'aiguille doit être arrêté. Attention à ne pas pénétrer dans le tissu scléral avec une pression excessive parce que l'aiguille doit être placé dans l'espace sous-rétinien potentiel. Si l'aiguille perce le tissu scléral par la puissance excessive, il entre dans les espaces extra-orbitales sans résistance. (Cette étape est essentielle)
Figure 1. Schéma de l'injection sous-rétinienne. H & E de section teinté de l'œil de la souris représentant les structures avec une voie d'aiguilles pour l'injection sous-rétinienne marquée (un carré pointillé). Grossissement: 40X, Barre d'échelle: 500 um. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Injecter les vecteurs viraux (par exemple, 1 x 10 6 TU / pi) doucement dans l'espace sous-rétinien, sans tremblements d'éviter des dommages aux tissus non désirées et retirer délicatement l'aiguille. Tenez fermement le globe oculaire pendant l'injection comme décrit dans 2.4.
- Observer la formation de bulle sous-rétinien après l'injection sous microscope opératoire pour vous assurer qu'il n'y a pas de saignement de la rétine.
Figure 2. Formation sous-rétinienne Belb sans hémorragie rétinienne. Vue microscopique de belb sous-rétinien après l'injection sous-rétinien sous microscope opératoire montre succès la formation de bulle sans hémorragie rétinienne.m / files / ftp_upload / 53030 / 53030fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Fermez doucement la paupière pour recouvrir le site d'injection pour l'auto-étanchéité. Retourner les souris à la maison cage et garder en vie jusqu'à ce que l'évaluation.
NOTE: Après les chercheurs obtiennent utilisés pour les procédures, ils peuvent obtenir des résultats reproductibles avec des procédures rapides en sautant les étapes (2,5, 6 et 10)
3. Evaluation de l'efficacité de Gene Livraison en épithélium pigmentaire rétinien
- Sacrifiez la souris dans la chambre de CO 2. Énucléer les yeux avec des ciseaux.
- Fixer les yeux dans la solution de paraformaldehyde à 4% à 4 ° C pendant au moins une heure à quelques jours.
- Prenez la cornée avec des pinces fines et à la perforation de la cornée avec des micro-ciseaux. Retirer la cornée après ciseaux le long du limbe. Retirez la lentille avec une pince.
- Coupez le corps ciliaire avec mICRO-ciseaux permettant décollement de la rétine. Tirez doucement sur l'ensemble de la rétine / choroïde / sclérotique complexe de l'EPR. Couper le complexe RPE / choroïde / scléral radialement de la périphérie vers le centre, près du nerf optique à plusieurs reprises de faire 4 à 8 feuilles pour montage à plat.
- Retournez le RPE / choroïde / complexe scléral pour faire face RPE vers le bas, et couper tous les tissus restants sur le côté scléral y compris les muscles, de la conjonctive et du nerf optique. Cette étape est importante pour faire un / choroïde / scléral complexe de l'EPR à plat parce que tout tissu restant inégale rend le complexe.
- Incuber le complexe avec l'anticorps primaire et secondaire pour vos fins de recherche spécifiques (en option, voir les références pour les méthodes détaillées). Flat-monter les RPE / choroïde / sclérotique complexes sur la lame de verre et d'absorber l'PBS avec une éponge absorbant.
- Ajouter 30 pi de solution de montage et placer la lame de couverture. Observer l'échantillon pour l'efficacité de la prestation de vecteur au microscope fluorescéine. Gardez les échantillons dansle réfrigérateur pour observation.
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Representative Results
Pour évaluer l'efficacité de l'injection sous-rétinienne sur la transduction du gène viral par ce protocole, nous avons utilisé des vecteurs disponibles dans le commerce BT avec le promoteur du CMV exprimant à la fois la GFP et DP pour l'indicateur. Les yeux ont été énucléés, après la période de temps appropriée selon le but de la recherche. Pour les résultats représentatifs, les yeux ont été énucléés 10 semaines et 20 semaines après l'injection sous-rétinien. Après l'élimination complète de la rétine en utilisant la méthode décrite ci-dessus, la montagne plate de complexe / choroïde / sclérotique de l'EPR a été évaluée sous microscope à fluorescence. Les résultats représentatifs sont présentés dans la figure 3A (bon exemple avec l'élimination complète de la rétine) et la figure 3B (mauvais exemple avec rétine intacte). Bien que l'existence de rétine neurale reste (surtout photorécepteur segment extérieur) sur la couche de RPE n'a pas interféré pour analyser la zone de livraison des gènes dans les RPE, il a bloqué la fluorescence de la GFP / RFP et visua directe inhibéelisation de la couche RPE pour d'autres analyses. Par conséquent, l'élimination complète de la rétine neurale du complexe / choroïde / sclérotique RPE donnerait de meilleurs résultats.
Figure 3. L'exemple de RPE / choroïde / scléral Complexe plat monter en fonction de la suppression complète de la rétine. Vingt semaines après l'injection sous-rétinienne de lentivirus avec la GFP / RFP Gene. (A) Bon exemple de RPE plat monter avec l'élimination complète de la rétine montre l'expression claire et discrète de la GFP / RFP dans les cellules de l'EPR. (B) Mauvais exemple de RPE montage plat en raison sans retrait de la rétine montre le domaine de la livraison de gènes avec des signaux de la DP qui est insuffisant pour analyser la pathologie de l'EPR. Grossissement: 40X, Barre d'échelle:. 500 um S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
(par exemple 2 pi). Cela permet d'ajuster titre viral approprié pour l'expérience.
Les résultats représentatifs de RPE / choroïde / sclère complexe plat de montage 10 semaines après injection sous-rétinienne ont été montrés dans divers grossissement sur la figure 4 (40X) et la figure 5 (400X). Les images avec un faible grossissement sont suffisantes pour évaluer le domaine de la GFP / RFP expression. D'autre part, les images avec un fort grossissement sont nécessaires pour une autre pathologie RPE concernant à des fins spécifiques des chercheurs. Ces images d'esprith différents grossissements aident à comprendre le schéma d'expression virale dans RPE (Figure 4 et 5). Nous avons également vérifié l'expression de la GFP / RFP jusqu'à 36 semaines après l'injection. L'expression de la GFP / RFP a encore été observée après l'injection 36 semaines de poste (données non présentées).
Figure 4. L'exemple de RPE / choroïde / scléral Complexe plat de montage 10 semaines après l'injection sous-rétinienne de lentivirus avec la GFP / RFP Gene (grossissement: 40X). (A) canal vert pour la GFP (B) du canal rouge pour DP. Barre d'échelle:. 500 um S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. L'exemple de RPE / choroïde / scléral Complexe plat-mount 10 semaines après l'injection sous-rétinienne de lentivirus avec la GFP / RFP Gene (grossissement: 400X). (A) canal vert pour la GFP (B) du canal rouge pour DP. Barre d'échelle:. 50 pm S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Dans cet article, vidéo, nous avons décrit la technique d'injection sous-rétinien limbique-approche en détail avec des résultats représentatifs de RPE / choroïde / scléral plate-mount. Ceci est une technique facile et pratique pour l'injection sous-rétinien de vecteurs viraux en RPE. La visualisation directe de la formation de bulle pendant l'injection est une étape importante pour la livraison précis pour les débutants. Il existe des techniques d'injection sous-rétiniens introduites dans le Journal of Visualized Experiments 8-10. Espace sous-rétinien est l'espace potentiel entre la rétine et RPE, donc il ya deux voies possibles d'aborder l'espace sous-rétinien. L'une est une approche à l'intérieur de l'espace sous-rétinien via vitré et de la rétine et l'autre est une approche extérieur par RPE et la sclérotique. Cette technique d'injection sous-rétinien limbique-approche est l'ancienne via l'espace intravitréenne et de la rétine. Cette technique présente l'avantage de fournir plus de formation de vésicules postérieure par rapport à celui-ci, car ce dernier unpproche fait une bulle du côté périphérique via tunnel scléral ou de l'incision, ce qui devrait être fait au cours de la rétine périphérique. En outre, simple ponction limbique est plus facile que tunnel scléral sans pénétration de la rétine. Pour les souris néonatales, cependant, il serait plus approprié d'utiliser l'approche en dehors 9. Parce que le globe oculaire de la souris néonatale est très petit et complet de la lentille, la technique limbique-approche peut provoquer la formation de la cataracte non désirée ou même la phtisie bulbi.
Il ya quelques étapes critiques dans ce protocole. Tout d'abord, la ponction initiale devrait être lieu légèrement en arrière du limbe parce ponction trop antérieure à la cornée rend iris incarcération, ou la ponction trop postérieure rend trou directement à la rétine périphérique. Deuxièmement, il est recommandé d'être prudent pour éviter de heurter la lentille avec l'aiguille tout en rendant la ponction initiale. Il est préférable de ne pas insérer l'ensemble du biseau de l'aiguille pour éviter lentille crevaison. Troisièmement, le bangle d'approche is de l'aiguille est d'environ 45 degrés contre iris avion, et l'aiguille émoussée doit être poussé en arrière vers la zone péripapillaire. Enfin, l'aiguille doit être placée dans l'espace sous-rétinien lors de l'injection, ce qui entraîne dans les formations de vésicules uniformes, sinon l'aiguille déplacée provoque l'injection intravitréenne.
L'œil est un petit organe avec des caractéristiques uniques qui en font une cible attrayante pour la thérapie génique 11. Plus précisément, il ya un petit compartiment clos avec privilège immunitaire qui permet à la thérapie génique avec une toxicité relativement faible et les réactions immunitaires de l'œil et des effets systémiques indésirables. Une visualisation facile et l'accessibilité prête à des approches chirurgicales sont les autres avantages de l'œil pour la thérapie génique. La rétine a une structure laminaire hautement organisé avec 10 couches distinctes. Ainsi, la livraison de gènes spatial précis ne peut être obtenu par les méthodes appropriées d'injection intraoculaire. Les deux méthodes les plus courantes pour intrlivraison aocular de vecteurs viraux sont injection intravitréenne et l'injection sous-rétinien 6. En général, l'injection intravitréenne est la voie préférée pour rétine interne ciblant les cellules ganglionnaires de la rétine et les cellules de Müller. Injection sous-rétinien est la voie privilégiée pour rétine externe ciblant les cellules photoréceptrices et les cellules RPE. Pour une transduction efficace dans l'EPR, il est nécessaire de fournir des vecteurs viraux sous-rétinienne malgré le potentiel de dommages à la rétine.
Dans cette étude, nous avons utilisé des vecteurs LV avec la GFP et RFP pour la visualisation. Parce que vecteurs viraux ont tropisme pour des types cellulaires spécifiques de la rétine, des vecteurs viraux doivent être choisis en fonction de tropisme de l'AAV, LV, et Ad pour cibler les cellules 5. Par exemple, AAV2 / 2, AAV2 / 6 et AAV2 / 8 sont la plus grande efficacité de transduction des cellules RGC et Müller. AAV2 / 5, 2/7, 2/8 et 2/9 transduisent efficacement les cellules photoréceptrices et RPE avec AAV2 / 8 étant le sérotype le plus efficace chez la souris 5,12 5. Pour les vecteurs LV, il ya un haut niveau d'expression dans les cellules de l'EPR après les injections sous-rétiniens, mais peu ou pas d'expression après des injections intravitréennes 13.
Pour la livraison de gènes efficace pour RPE, promoteurs viraux doivent être également considérés. Des promoteurs viraux, tels que le cytomegalovirus (CMV), le promoteur chimère poulet et la bêta-actine / CMV enhancer promoteur sont des promoteurs forts et ubiquistes, par conséquent, ils sont utilisés dans la majorité des études de thérapie génique. Dans RPE, le promoteur du CMV est estimé à exprimer dix fois plus de protéines par rapport au promoteur RPE65 14. D'importance, la combinaison optimale du promoteur et des vecteurs viraux, notamment le sérotype doit être réalisé pour des meilleurs résultats comme le montre l'expression de RPE65 supérieur lorsque le promoteur RPE65 humain sont emballés dans sérotype rAAV2 / 4 de rAAV2 / 2 15. En se concentrant sur la livraison de gènes aux cellules RPE, RPE-specific promoteurs comme le RPE65 ou le promoteur VMD2 réduit les problèmes de la sécurité hors-cible 16.
La DMLA est une maladie complexe qui comporte deux phases avec une phase dégénérative visée à AMD sec et une phase caractérisée par une néovascularisation choroïdienne appelé AMD aussi humide. En outre, AMD est une maladie dans laquelle de nombreuses susceptibilités génétiques y compris le facteur H du complément (CFH), complètent C3, complètent facteur I (FCI), liée à l'âge maculopathie susceptibilité 2 (ARMS2) et ApoE sont combinés avec des facteurs de risque environnementaux 17. En raison de la nature complexe de facteurs de risque génétiques dans la DMLA, il n'y a pas de gène candidat unique pour sa thérapie génique. Ainsi, la thérapie génique actuel dans AMD se concentre sur le transfert de gènes pour exprimer des protéines anti-angiogéniques ciblant néovascularisation choroïdienne dans la DMLA humide 18. Il n'y a pas encore de gène candidat pour le traitement de la DMLA sèche avec une thérapie génique. Récemment, nous avons suggéré que l'amyloïde bêta accumulation pourrait intracellulaireêtre liée à sécher caractéristiques AMD chez la souris transgénique 19. En outre, sous-rétinienne injecté bêta-amyloïde a été repris par RPE chez la souris (données non publiées). Nous pouvons cliver intracellulaire bêta-amyloïde avec protéase virale 20. Ainsi, nous avons en outre étudié la thérapie génique dans la DMLA sèche avec des cibles potentielles.
En conclusion, la thérapie génique dans la maladie oculaire est plus prometteuse que dans n'importe quel autre organe. En outre, l'injection sous-rétinienne est une technique fondamentale pour la thérapie génique dans les maladies de la rétine, en particulier en ce qui concerne les cellules photoréceptrices et RPE. Ainsi, nous espérons que cette technique devient plus largement utilisé et peut contribuer à l'avancement de la thérapie génique, non seulement dans la rétinopathie héréditaires monogéniques, mais aussi dans la dégénérescence maculaire liée à l'âge.
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Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par le Grant Université nationale de Séoul de recherche (800-20140542), le Programme de Pioneer Research de la NRF / MEST (2012-0009544), et le Programme Bio-Signal Analysis Technology Innovation de la NRF / MEST (2009-0090895), et la subvention de la NRF / MEST (2015M3A9E6028949).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS | WPI | 500233 | |
| VANNAS Scissors S/S, 105 mm | WPI | 555583S | |
| 33 G Blunt needle | WPI | NF33BL-2 | |
| NanoFil Syringe, 10 microliter | WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | For easy one hand injection |
| 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) BD PrecisionGlideTM Needle | BD | 305107 | Initial puncture for subretinal injection |
| Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter) | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Leica operating microscope | Leica | LM M80 | |
| Fluoresecein microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Lentivirus | Thermo scientific | TMO.LV-Ctr | Used to dilute vectors |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to dilute vectors |
| Troperin (Phenylephrin 0.5% - Tropicamide 0.5%) | Hanmi | For dilation | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Sterile) | Bausch&Lomb | For topical anesthesia | |
| Healon GV OVD | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50 (tiletamine hypochloride and zolazepam hypochloride) | Virbac | For general anesthesia | |
| Rompun injection (Xylazine HCl) | Bayer | For general anesthesia |
References
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