Introduction
Em oftalmologia, terapia genética surgiu como a modalidade de tratamento em retinopatias hereditárias monogênicas. Há retinopatias herdados associados com genes no epitélio pigmentar da retina (RPE), incluindo Leber amurosis congênita 1,2, retinite pigmentosa 3, 4 e choroideremia. O campo da terapia genética de pesquisa está em expansão em ambos os estudos pré-clínicos e clínicos que utilizam vectores virais tais como vírus adeno -associated (AAV), lentivírus (LV) e adenovírus (Ad) 5. Diferentes vectores virais possuem tropismo diferente na retina. Para uma terapia génica eficaz e segura, vectores virais devem ser cuidadosamente seleccionados de acordo com as células alvo e genes alvo.
A via de entrega de genes, também é importante para a entrega de genes a células alvo eficaz, assim, deve ser cuidadosamente escolhida bem. Os dois métodos mais comuns para entrega intra-ocular de vectores virais são subretinal injeção e injeção intravítrea 6. Este último, injecção intravítrea, tem sido amplamente utilizada para a entrega de drogas para tratar a neovascularização coroidal em molhado degeneração macular relacionada com a idade (AMD) e o edema macular em retinopatia diabética 7. Via intravítrea proporciona uma exposição de vectores virais para a retina interna e vítreo, mas a difusão dos vectores a retina externa é limitada. Por outro lado, a via sub-retiniano fornece a entrega directa de vectores virais para o espaço potencial entre retina e EPR, induzindo uma vesícula localizada. Portanto, a injeção sub-retiniana é actualmente considerado como uma rota mais eficiente para o direcionamento de células fotorreceptoras e RPE. Em termos de abordagem cirúrgica, pars plana é escolhida como uma área segura para injeção intravítrea para evitar danos na retina em pacientes humanos. Por simplesmente modificar essa abordagem para ratos, poderíamos injetar vetores virais subretinally ou intravireally via abordagem de limbo.
Neste vídeoartigo, demonstramos um método fácil e conveniente de injecção sub-retiniana de vectores virais em ratinhos EPR. Após a punção único no limbo posterior para com uma agulha 30 G 1/2, 33 g de uma agulha romba microlitro equipado seringa é inserida no espaço sub-retiniano através do local de punção limbo. Os vectores virais de 1,5-2 ul de volume são injectados para o espaço potencial entre retina e EPR induzir bolhas subretinal. Este procedimento pode ser realizado sob visualização directa utilizando microscópio cirúrgico. A prática repetida irá garantir resultados replicáveis mesmo sem a visualização direta da formação de bolha. Isso vai ajudar os pesquisadores a realizar experimentos precisos e que economizam tempo para entrega gene em camundongos subretinal RPE.
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Protocol
Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com a Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia Declaração para o uso de animais em Oftalmologia e Vision Research, e as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Universidade Animal Care Institucional e Comitê de Uso Seoul Nacional e Nacional de Seul Hospital Universitário Comitê de Biossegurança.
1. Preparação Kit injeção e Vetores Virais
- Prepare a seringa microlitro equipado com uma agulha romba 33 G esterilizados usando gás de óxido de etileno. Dilui-se a vectores virais em PBS durante a titulação adequada no tubo de micro (ou seja, 1 x 10 6 TU / mL). Lave a seringa várias vezes com vectores virais para remover qualquer espaço morto na seringa.
2. Injecção sub-retiniana de vetores virais
- Anestesiar os ratos adultos (ou seja, 6-8 semanas de idade) com uma injecção intraperitoneal de uma mistura de tiletamine zolazepam e (1: 1, 2,25 mg / kg de peso corporal) e cloridrato de xilazina (0,7 mg / kg de peso corporal) ou um regime de anestesia adequada alternativa.
- Dilatar pupilas com um colírio de fenilefrina e tropicamida 0,5% a 0,5%.
- Preparar a seringa microlitro por carregamento com 1,5-2 ul de vectores virais.
- Abra a pálpebra do olho e se projetam para expor o equador para injecção conveniente e focar sob o microscópio cirúrgico. Manter a posição dos olhos salientes até terminar a injecção, ou de deslocamento da agulha pode ocorrer durante a injecção. Para segurar o globo ocular firme, coloque os dedos fora da borda orbital.
- Aplicar uma gota de solução viscoelástica oftálmica para a superfície da córnea.
- Colocar uma pequena tampa deslizante rodada no topo da córnea para visualizar a retina.
- Perfurar um pequeno buraco no ligeira posterior ao limbo usando um estéril 30 G 1/2 agulha para a nova injecção sub-retiniana. Faça o buraco inferior for o olho direito, e superior para o olho esquerdo para a conveniência.
NOTA: Se o buraco é feito no temporais ou nasal, é difícil de ser coberta pela pálpebra após a injeção. Punção inicial deve ser feita ligeiramente posterior ao limbo para evitar os vasos do limbo, que correm ao longo do limbo e podem ser facilmente reconhecidas. Tenha cuidado para evitar bater a lente com agulha ao fazer a punção inicial. Não insira todo o bisel da agulha para evitar a perfuração da lente. - Inserir a agulha romba 33 g de microlitro seringa através do orifício pré-furado e aproximar-se a agulha no espaço sub-retiniano até o ponto em que é sentida a resistência moderada.
NOTA: Para a injeção sub-retiniana, o melhor ângulo de abordagem da agulha é de cerca de 45 graus contra plano da íris, ea agulha sem corte deve ser empurrado posteriormente em direção à área peripapilar. Quadrado pontilhado indicou o trajeto da agulha sugerido através da cavidade vítrea para o injectio subretinaln na Figura 1.
NOTA: Não haverá resistência sentiu quando perfuração (ou passagem) as camadas da retina como eles são muito moles. Assim, a primeira sensação de resistência leve indica que a agulha já tiver tocado na camada de EPR e a inserção da agulha deve ser interrompido. Tenha cuidado para não penetrar o tecido escleral com pressão excessiva porque a agulha deve ser colocada no potencial espaço sub-retiniano. Se a agulha perfura o tecido escleral por excesso de poder, ele entra nos espaços orbitais extra-oculares sem resistência. (Esta etapa é crítica)
Figura 1. Diagrama esquemático da injeção sub-retiniana. H & E corte manchado do olho do rato que descreve as estruturas com um trajeto da agulha para a injeção sub-retiniana marcados (um quadrado pontilhada). Ampliação: 40X, Barra de escala: 500 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Injectar os vectores virais (por exemplo, 1 x 10 6 TU / ul) suavemente para o espaço sub-retiniano sem tremor para evitar danos nos tecidos não desejados e retirar a agulha suavemente. Segurar firmemente o globo ocular durante a injecção, tal como descrito em 2.4.
- Observar a formação de bolha subretinal após a injecção sob microscópio cirúrgico para se certificar de que não há sangramento na retina.
Figura 2. Formação Subretinal Belb sem retina Hemorragia. Vista microscópica de belb subretinal após a injeção sub-retiniana sob o microscópio de operação mostra a formação de bolha bem sucedido sem hemorragia retiniana.m / files / ftp_upload / 53030 / "target =" _ blank 53030fig2large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Com cuidado, feche a pálpebra para cobrir o local da injecção de auto-selagem. Retornar os ratos para gaiola e manter viva até a avaliação.
NOTA: Depois que os pesquisadores se acostumar com os procedimentos, eles podem obter os resultados repetíveis com procedimentos rápidos saltando etapas (2,5, 6 e 10)
3. Avaliação da Eficácia da Entrega Gene em Retinal Pigment Epithelium
- Sacrifício dos ratinhos na câmara de CO 2. Enuclear os olhos com uma tesoura.
- Fixar os olhos na solução de paraformaldeído a 4% a 4 ° C durante um mínimo de 1 hora a alguns dias.
- Agarre a córnea com uma pinça fina e perfurar a córnea com micro-tesoura. Remover a córnea após tesoura ao longo do limbo. Retire a lente com uma pinça.
- Apare o corpo ciliar com mICRO-tesoura, permitindo o descolamento de retina. Puxe cuidadosamente toda a retina do / coróide / complexo esclera RPE. Cortar o RPE / coróide / complexo escleral radialmente a partir da periferia para o centro perto do nervo óptico várias vezes para fazer 4-8 folhas para montagem plana.
- Virar o RPE / coróide / complexo escleral para fazer lado RPE para baixo, e aparar todos os tecidos restantes na parte lateral escleral incluindo músculos, conjuntiva e nervo óptico. Este passo é importante fazer uma RPE / coróide / complexo escleral plana porque qualquer tecido remanescente torna o complexo desigual.
- Incubar o complexo com o anticorpo primário e secundário para seus fins específicos de investigação (opcional, consulte as referências para os métodos detalhados). Plano de montagem do EPR / coróide / complexos esclerais sobre a lâmina de vidro e absorver o PBS com uma esponja absorvente.
- Adicionar 30 ml de solução de montagem e coloque a cobertura deslizante. Observar a amostra para a eficácia da entrega do vetor sob o microscópio fluoresceína. Mantenha as amostras emo refrigerador para posterior observação.
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Representative Results
Para avaliar a eficácia da injecção sub-retinal na transdução de genes virais por este protocolo, foi utilizada vectores LV disponíveis comercialmente com o promotor de CMV expressando GFP e RFP para o indicador. Os olhos foram enucleados após o período de tempo adequado de acordo com a finalidade da investigação. Para os resultados representativos, os olhos foram enucleados 10 semanas e 20 semanas após a injeção sub-retiniana. Após a remoção completa da retina utilizando o método descrito acima, o plano de montagem do EPR complexo / coróide / esclera foi avaliada sob microscópio de fluorescência. Os resultados representativos são apresentados na Figura 3A (exemplo com uma remoção completa da retina) e a figura 3B (pobre exemplo com retina intacta). Embora a existência de retina neural remanescente (especialmente segmento externo dos fotorreceptores) sobre a camada RPE não interferiu para analisar a área de entrega de genes em RPE, que bloqueou a fluorescência da GFP / RFP e visua direta inibiuzação da camada de RPE para análises posteriores. Portanto, a remoção completa da retina neural do complexo / coróide / esclera EPR iria proporcionar melhores resultados.
Figura 3. O Exemplo de RPE / coróide / escleral Complexo Plano de montagem de acordo com a remoção completa de Retina. Vinte semanas após a injecção sub-retiniana de Lentivirus com GFP / RFP Gene. (A) Boa exemplo de EPR plana de montagem com a remoção completa da retina mostra a expressão clara e discreta de GFP / RFP nas células RPE. (B) Má exemplo de EPR plana montar devido à falta de remoção da retina mostra a área de entrega de genes com sinais de RFP que é insuficiente para analisar a patologia EPR. Ampliação: 40X, Barra de escala:. 500 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
(ou seja, 2 ul). Isto ajuda a ajustar o título viral apropriado para a experiência.
Os resultados representativos de RPE / coróide / escleral complexo plana de montagem 10 semanas após a injecção sub-retiniana foram mostradas em vários ampliação na Figura 4 (40x) e na Figura 5 (400X). As imagens com baixa ampliação são suficientes para avaliar a área da GFP expressão / RFP. Por outro lado, as imagens com alta ampliação são necessárias para a outra patologia EPR em relação a efeitos específicos dos investigadores. Estas imagens sagacidadeh diversas ampliações ajudar a compreender o padrão de expressão viral em EPR (Figura 4 e 5). Verificamos, também, a expressão da GFP / RFP até 36 semanas após a injecção. A expressão de GFP / RFP foi observada após 36 semanas pós-injecção (dados não mostrados).
Figura 4. O Exemplo de RPE / coróide / escleral Complexo Plano de montagem em 10 semanas após a injecção sub-retiniana de Lentivirus com GFP / RFP Gene (Ampliação: 40X). (A) do canal verde para GFP (B) do canal de vermelho para RFP. Barra de escala:. 500 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. O Exemplo de RPE / coróide / escleral Complexo Plano-mount 10 semanas após a injecção sub-retiniana de Lentivirus com GFP / RFP Gene (Ampliação: 400X). (A) do canal verde para GFP (B) do canal de vermelho para RFP. Barra de escala:. 50 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste artigo de vídeo, descrevemos o limbo abordagem técnica de injeção sub-retiniana em detalhe com resultados representativos de RPE / coróide / escleral flat-mount. Esta é uma técnica fácil e conveniente para a injecção sub-retiniana de vectores virais em EPR. A visualização direta da formação de bolha durante a injeção é um passo importante para a entrega correta para os novatos. Existem algumas técnicas de injeção subretinal introduzidas no Journal of Experiments Visualized 8-10. Espaço sub-retiniano é o espaço potencial entre retina e EPR, portanto, há duas rotas possíveis de abordar o espaço sub-retiniano. Uma é uma abordagem para dentro para o espaço sub-retiniano através de vítreo e retina e o outro é uma abordagem de fora através do EPR e esclera. Este limbo abordagem técnica de injeção sub-retiniana é a antiga via um espaço intravítrea e retina. Esta técnica tem a vantagem de proporcionar mais posterior formação da bolha em comparação com o último, porque este último umBORDAGEM faz uma vesícula a partir do lado periférico através de encapsulamento ou incisão escleral, o qual deve ser feita através da retina periférica. Além disso, punção de limbo simples é mais fácil do que tunneling escleral sem penetração da retina. Para os ratinhos neonatais, no entanto, seria mais adequado utilizar a abordagem de fora 9. Porque olho de rato neonatal é muito pequeno e cheio de lente, técnica de limbo abordagem pode causar a formação de catarata indesejada ou até mesmo bulbi tísica.
Existem alguns passos críticos neste protocolo. Primeiro de tudo, punção inicial deve ser lugar ligeiramente posterior ao limbo porque punção muito anterior na córnea torna íris encarceramento, ou punção muito posterior faz buraco direto na retina periférica. Em segundo lugar, recomenda-se ter cuidado para evitar bater a lente com agulha ao fazer a punção inicial. É melhor não para inserir todo o bisel da agulha para evitar a perfuração da lente. Em terceiro lugar, a best ângulo de aproximação da agulha é de cerca de 45 graus contra plano da íris, ea agulha sem corte deve ser empurrado posteriormente em direção à área peripapilar. Finalmente, a agulha deve ser colocada no espaço sub-retiniano durante a injecção, resultando em formações de bolha uniformes, de outro modo faz com que a agulha deslocada injecção intravítrea.
O olho é um órgão pequeno com características únicas que o tornam um alvo atraente para a terapia gênica 11. Especificamente, é um compartimento pequeno fechado com imuno-privilégio que permite a terapia de genes com uma toxicidade relativamente baixa e reacções imunes no olho e efeitos sistémicos adversos. Fácil visualização e acesso pronto para abordagens cirúrgicas são outras vantagens do olho para a terapia genética. A retina tem uma estrutura laminar altamente organizada com 10 camadas distintas. Assim, a entrega de genes espacial exacta só pode ser conseguido pelos métodos apropriados de injecção intra-ocular. Os dois métodos mais comuns para intraocular entrega de vectores virais são injecção intravítrea e injecção sub-retiniana 6. Em geral, a injecção intravítrea é a via preferida para a retina interna direccionamento células ganglionares da retina e células de Muller. Injecção sub-retiniana é a via preferida para a retina externa alvejando as células fotorreceptoras e células RPE. Para uma transdução eficiente em RPE, é necessário entregar vetores virais subretinally apesar do potencial de danos à retina.
Neste estudo, foram utilizados vetores LV com GFP e RFP para a visualização. Como vectores virais possuem tropismo para tipos específicos de células da retina, vectores virais devem ser escolhidos de acordo com o tropismo de AAV, LV, e Ad 5 a células alvo. Por exemplo, AAV2 / 2, AAV2 / 6 e AAV2 / 8 são a maior eficiência de transdução de células RGC e Muller. AAV2 / 5, 2/7, 2/8 e 2/9 eficiente transdução de células fotorreceptoras e RPE com AAV2 / 8 sendo o sorotipo mais eficiente em ratos 5,12 5. Para vectores de LV, há um elevado nível de expressão em células de RPE após injecções sub-retinianas, mas pouca ou nenhuma expressão após as injecções intravítreas 13.
Para entrega de genes eficaz para EPR, promotores virais devem também ser considerados. Os promotores virais, tais como o citomegalovírus (CMV) e de galinha quimérico beta-actina / promotor de CMV são promotores fortes e ubíquos, assim, eles são utilizados na maioria dos estudos de terapia génica. Em EPR, o promotor de CMV é estimada para expressar dez vezes mais proteína em comparação com o promotor RPE65 14. De importância, a combinação óptima do promotor e vectores virais, incluindo o serotipo deverá ser atingida para melhores resultados, como demonstrado pela expressão superior de RPE65 quando o promotor humano RPE65 são embalados em serotipo rAAV2 / 4 de rAAV2 / 2 15. Concentrando-se na entrega de genes para células EPR, RPE-sppromotores ecific como o RPE65 ou o promotor VMD2 reduz emite a segurança fora do alvo 16.
AMD é uma doença complexa que tem duas fases com uma fase degenerativa referido como AMD seca e uma fase caracterizada por neovascularização coróide referido como DMRI exsudativa. Além disso, a AMD é uma doença na qual numerosos susceptibilidades genéticas, incluindo fator H do complemento (CFH), complementar C3, complementar fator I (TPI), relacionada à idade maculopatia susceptibilidade 2 (ARMS2) e ApoE são combinados com factores de risco ambiental 17. Devido à natureza complexa dos factores de risco genéticos em AMD, não há único gene candidato para a sua terapia génica. Assim, a terapia genética atual em AMD está focada na transferência de genes para expressar proteínas anti-angiogénicos segmentação neovascularização de coróide no molhado AMD 18. Não há ainda gene candidato para o tratamento de DMRI seca com uma terapia de genes. Recentemente, sugeriu que a acumulação de beta-amilóide poderia intracelularestar relacionado com secar características AMD em ratinhos transgénicos 19. Além disso, subretinally injectado beta amilóide foi recolhido por RPE em ratinhos (dados não publicados). Podemos decompor intracelular amilóide beta com protease viral 20. Assim, estudamos ainda mais a terapia gênica em DMRI seca com alvos potenciais.
Em conclusão, a terapia genética na doença ocular é mais promissora do que em qualquer outro órgão. Além disso, a injecção sub-retiniana é uma técnica essencial para a terapia de genes em doenças da retina, particularmente em relação a células fotorreceptoras e RPE. Assim, esperamos que esta técnica torna-se mais amplamente utilizado e pode contribuir para o progresso da terapia genética não só em doenças monogénicas herdada retinopatia mas também em degeneração macular relacionada com a idade.
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Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo Seoul National University Research Grant (800-20140542), o Programa Pioneer Pesquisa da NRF / MEST (2012-0009544) ea Análise de Tecnologia Programa de Inovação Bio-Signal da NRF / MEST (2009-0090895), ea concessão da NRF / MEST (2015M3A9E6028949).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS | WPI | 500233 | |
| VANNAS Scissors S/S, 105 mm | WPI | 555583S | |
| 33 G Blunt needle | WPI | NF33BL-2 | |
| NanoFil Syringe, 10 microliter | WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | For easy one hand injection |
| 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) BD PrecisionGlideTM Needle | BD | 305107 | Initial puncture for subretinal injection |
| Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter) | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Leica operating microscope | Leica | LM M80 | |
| Fluoresecein microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Lentivirus | Thermo scientific | TMO.LV-Ctr | Used to dilute vectors |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to dilute vectors |
| Troperin (Phenylephrin 0.5% - Tropicamide 0.5%) | Hanmi | For dilation | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Sterile) | Bausch&Lomb | For topical anesthesia | |
| Healon GV OVD | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50 (tiletamine hypochloride and zolazepam hypochloride) | Virbac | For general anesthesia | |
| Rompun injection (Xylazine HCl) | Bayer | For general anesthesia |
References
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