Introduction
I oftalmologi har genterapi opstået som behandlingsmodalitet i monogeniske nedarvede retinopatier. Der er nedarvede retinopatier forbundet med gener i retinal pigment epitel (RPE), herunder Leber medfødt amurosis 1,2, retinitis pigmentosa 3, og choroideremia 4. Inden for genterapi forskning ekspanderer i både prækliniske og kliniske forsøg med virale vektorer, såsom adeno-associeret virus (AAV), lentivirus (LV) og adenovirus (Ad) 5. Forskellige virale vektorer har forskellige tropisme i nethinden. For en sikker og effektiv genterapi bør virale vektorer nøje udvalgt efter målceller og målgener.
Ruten for genafgivelse er også vigtige for effektiv genafgivelse til målceller, således skal det omhyggeligt valgt som godt. De to mest almindelige metoder til intraokulær afgivelse af virale vektorer subretginal injektion og intravitreal injektion 6. Sidstnævnte, intravitreal injektion, har været meget anvendt til lægemiddelafgivelse til behandling choroidal neovaskularisering i våd aldersrelateret maculadegeneration (AMD) og makulært ødem i diabetisk retinopati 7. Intravitreal rute giver eksponering af virale vektorer til glaslegemet og indre nethinde, men diffusionen af vektorerne til ydre nethinde er begrænset. På den anden side, den subretinal rute giver direkte levering af virale vektorer til potentielle rum mellem retina og RPE, inducere en lokaliseret bleb. Derfor er subretinal injektion i øjeblikket betragtes som en mere effektiv vej til at målrette fotoreceptorceller og RPE. Med hensyn til kirurgisk tilgang, pars plana er valgt som et sikkert område til intravitreal injektion for at undgå beskadigelse af nethinden hos humane patienter. Ved blot at ændre denne tilgang til mus, kunne vi tilføre virale vektorer subretinalt eller intravireally via limbal tilgang.
I denne videoartiklen viser vi en nem og bekvem metode til subretinal injektion af virale vektorer i mus RPE. Efter en enkelt punktering ved posteriort for limbus med en 30 G 1/2 nål, er en 33 G stump nål udstyret mikroliter sprøjte indsat i subretinarummet via limbale indstikssted. De virale vektorer af 1,5-2 ul volumen injiceres til den potentielle rum mellem retina og RPE inducerende subretinal bleb'er. Denne procedure kan udføres under direkte visualisering under anvendelse af kirurgisk mikroskop. Gentagne praksis vil garantere reproducerbare resultater selv uden direkte visualisering af bleb formation. Dette vil hjælpe forskerne til at udføre nøjagtige og tidsbesparende eksperimenter for subretinal genafgivelse i mus RPE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter på dyr blev udført i overensstemmelse med Foreningen for Forskning i Vision og Oftalmologi Erklæring til brug af dyr i Ophthalmic og Vision Research, og de retningslinjer og regler angivet af Seoul National University Institutional Animal Care og brug Udvalg og Seoul National Universitetshospital biosikkerhed udvalget.
1. Forberedelse Injektion Kit og virusvektorer
- Forbered mikroliter sprøjte med en 33 G stump nål steriliseret med ethylenoxid-gas. Fortynd de virale vektorer i PBS for en tilstrækkelig titer i mikro rør (dvs. 1 x 10 6 TU / pl). Skylle sprøjten flere gange med virale vektorer til at fjerne enhver dødt rum i sprøjten.
2. subretinal Injektion af virusvektorer
- Bedøver de voksne mus (dvs. 6 - 8 uger gamle) med en intraperitoneal injektion af blandingen af tiletamine og zolazepam (1: 1, 2,25 mg / kg legemsvægt) og xylazin-hydrochlorid (0,7 mg / kg legemsvægt) eller en alternativ egnet anæstesi regime.
- Spile eleverne med øje dråbe phenylephrin 0,5% og tropicamid 0,5%.
- Forbered mikroliter sprøjte ved at indlæse med 1,5-2 pi virale vektorer.
- Åbn øjenlåget og rager øjet at blotlægge ækvator til praktisk injektion og fokus på under operationsmikroskopet. Opretholde den fremspringende øjenhøjde indtil afslutning af injektion eller forskydning af nålen kan forekomme under injektionen. At holde øjeæblet fast, skal du placere fingrene uden for orbital rand.
- Påfør en dråbe af oftalmisk viskoelastisk opløsning til hornhindens overflade.
- Placere en lille runde dækglas på toppen af hornhinden for at visualisere nethinden.
- Punktere et lille hul ved svag posterior for limbus anvendelse af en steril 30 G 1/2 nål til den videre subretinal injektion. Lav hullet ringere for det højre øje, og overlegen til venstre øje for bekvemmelighed.
BEMÆRK: Hvis hullet er lavet ved tidsmæssig eller nasal, er det svært at være omfattet af øjenlåget efter injektionen. Indledende punktering gøres lidt posteriort for limbus at undgå de limbale fartøjer, som løber langs limbus og let kan anerkendes. Vær omhyggelig med at undgå at ramme linsen med nål, samtidig med at den indledende punktering. Indsæt ikke hele facet af nålen for at undgå linse punktering. - Placer 33 G stump nål af mikroliter sprøjten gennem præ-punkterede hul og nærme nålen ind i subretinarummet indtil det punkt, hvor mild der mærkes modstand.
BEMÆRK: For subretinale indsprøjtning, den bedste tilgang vinkel af nålen er omkring 45 grader mod iris fly, og den stumpe kanyle skal skubbes bagud mod peripapillary område. Stiplede firkant angivet den foreslåede nål pathway tværs af glaslegemet hulrum for subretinal injektionsvæskenn i figur 1.
BEMÆRK: Der vil ikke være nogen modstand følte, da piercing (eller passerer) de retinale lag, da de er meget bløde. Således er det første følelse af mild modstand indikerer, at nålen allerede har berørt RPE lag og indføring af nålen bør stoppes. Pas på ikke at trænge sclerale væv med stort tryk, da nålen skal placeres i den potentielle subretinale rum. Hvis nålen punkterer sclerale væv ved overdreven magt, den træder ind i de ekstraokulære orbitale rum uden modstand. (Dette trin er kritisk)
Figur 1. Skematisk diagram af subretinal injektion. H & E farvet tværsnit af muse øjet afbilder strukturerne med en nål pathway for subretinal injektion mærket (en stiplet firkant). Forstørrelse: 40X, Målestok: 500 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Injicer virale vektorer (dvs. 1 x 10 6 TU / pi) forsigtigt ind i subretinarummet uden tremor at undgå uønsket vævsskade og trække kanylen forsigtigt. Hold øjeæblet fast under injektionen som beskrevet i 2.4.
- Observere dannelsen af subretinale bleb efter injektionen under drift mikroskop for at sikre, at der ikke er nogen retinal blødning.
Figur 2. subretinal Belb Formation uden Retinal Blødninger. Mikroskopisk visning af subretinal belb efter subretinal injektion under operationsmikroskop viser succesfuld blæredannelse uden retinal blødning.m / filer / ftp_upload / 53030 / 53030fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
- Luk forsigtigt øjenlåget for at dække injektionsstedet til selv-forsegling. Retur mus til hjem bur og holde i live, indtil evalueringen.
BEMÆRK: Efter forskerne vænne sig til procedurerne, kan de få de gentagelige resultater med hurtige procedurer ved at springe disse trin (2,5, 6 og 10)
3. Evaluering af effekten af Gene Delivery i retinale pigmentepitel
- Sacrifice musene i CO 2 kammer. Enucleate øjnene med en saks.
- Fix øjerne i 4% paraformaldehyd-opløsning ved 4 ° C i mindst 1 time til få dage.
- Grib hornhinden med fine pincet og punktere hornhinden med mikro-saks. Fjern hornhinden efter klipning langs limbus. Fjern linsen med en pincet.
- Trim corpus ciliare med micro-saks tillader nethindeløsning. Træk forsigtigt hele nethinden fra RPE / choroidea / sclera kompleks. Skær RPE / choroidea / sclera kompleks radialt fra periferien til centrum nær synsnerven flere gange for at 4 til 8 blade til flad montering.
- Vend RPE / choroidea / sclera kompliceret at gøre RPE nedad, og trim alle de resterende væv på sclerale side herunder muskler, bindehinden og synsnerven. Dette trin er vigtigt at gøre en flad RPE / choroidea / sclera kompleks, fordi resterende væv gør det komplekse ujævn.
- Inkubér kompleks med primær og sekundær antistof til dine specifikke forskningsformål (valgfrit, se referencer for detaljerede metoder). Fladskærms-montere RPE / chorioideus / sclerale komplekser på objektglas og absorbere PBS med en absorberende svamp.
- Tilføj 30 pi monteringsløsning og placere dækslet dias. Prøven for effekten af vektor levering under fluorescein mikroskop observere. Opbevar prøverne ikøleskab i yderligere observation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
At evaluere effekten af det subretinale indsprøjtning på viral gentransduktion af denne protokol, vi brugte kommercielt tilgængelige LV vektorer med CMV-promotor, der udtrykker både GFP og RFP for indikatoren. Øjne var udskrællet efter passende tidsrum efter forskningen formål. For de repræsentative resultater blev øjne tømte 10 uger og 20 uger efter subretinal injektion. Efter fuldstændig fjernelse af nethinden under anvendelse af den ovenfor beskrevne metode blev den flade mount af RPE / choroidea / sclera kompleks evalueres under fluorescensmikroskop. De repræsentative resultater er vist i figur 3A (godt eksempel med fuldstændig fjernelse af nethinden) og Figur 3B (dårlig eksempel med intakt nethinden). Selvom eksistensen af rest neurale nethinde (især fotoreceptor ydre segment) i løbet af RPE lag ikke blandede at analysere området for genafgivelse i RPE, det blokerede fluorescensen af GFP / RFP og inhiberede direkte udstyr og forretnilization af RPE lag til yderligere analyser. Derfor ville en fuldstændig fjernelse af neurale nethinde fra RPE / choroidea / sclera kompleks give bedre resultater.
Figur 3. Eksempel på RPE / Årehinden / Scleral Complex fladskærms-mount efter fuldstændig fjernelse af Retina. Tyve uger efter subretinal Injektion af Lentivirus med GFP / RFP Gene. (A) godt eksempel på RPE flad montering med fuldstændig fjernelse af nethinden viser klart og diskrete ekspression af GFP / RFP i RPE-celler. (B) Dårlig eksempel på RPE flad mount grundet ingen fjernelse af nethinden viser området for genafgivelse med RFP signaler, som er utilstrækkelig til at analysere RPE patologi. Forstørrelse: 40X, Målestok:. 500 um Klik her for at se en større version af dette tal.
(dvs. 2 pi). Dette medvirker til at justere passende virale titer til eksperimentet.
De repræsentative resultater af RPE / choroidea / scleral kompleks flad mount 10 uger efter subretinal injektion blev vist i forskellige forstørrelse i figur 4 (40X) og figur 5 (400X). Billeder med lav forstørrelse er nok til at vurdere det område af GFP / RFP ekspression. På den anden side, er nødvendige for andre RPE patologi med hensyn til forskernes specifikke formål billederne med stor forstørrelse. Disse billeder with forskellige forstørrelser hjælpe til at forstå den virale ekspressionsmønster i RPE (figur 4 og 5). Vi har også kontrolleret ekspression af GFP / RFP op til 36 uger efter injektion. Ekspressionen af GFP / RFP blev stadig observeret efter 36 uger efter injektion (data ikke vist).
Figur 4. Eksempel på RPE / Årehinden / Scleral Complex fladskærms-mount 10 uger efter subretinal Injektion af Lentivirus med GFP / RFP Gene (Forstørrelse: 40X). (A) grøn kanal for GFP (B) rød kanal til RFP. Målestok:. 500 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Eksempel på RPE / Årehinden / Scleral Complex Flat-mount 10 uger efter subretinal Injektion af Lentivirus med GFP / RFP Gene (Forstørrelse: 400X). (A) grøn kanal for GFP (B) rød kanal til RFP. Målestok:. 50 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne video artiklen, beskrev vi den limbale-tilgang subretinal injektionsteknik i detaljer med de repræsentative resultater af RPE / choroidea / sclera fladskærms-mount. Dette er en nem og bekvem teknik til subretinal injektion af virale vektorer i RPE. Direkte visualisering af bleb dannelse under injektionen er et vigtigt skridt for præcis levering for begyndere. Der er nogle subretinal injektionsteknik indført i Journal of visualiseret Forsøg 8-10. Subretinal rum er det muligt rum mellem retina og RPE, derfor er der to mulige ruter at nærme subretinarummet. Den ene er en indvendig tilgang til subretinarummet via glaslegemet og retina og den anden er en udvendig tilgang via RPE og sclera. Denne limbale-tilgang subretinal injektionsteknik er den tidligere en via intravitreal plads og nethinden. Denne teknik har en fordel at tilvejebringe mere posterior blæredannelse forhold til sidstnævnte fordi sidstnævnte enMETODE laver en bleb fra den perifere side via sclerale tunneling eller snit, som bør foretages over den perifere retina. Desuden enkel limbal punktering er nemmere end scleral tunneling uden retinal penetration. For de neonatale mus, men det ville være mere hensigtsmæssigt at bruge den uden for tilgang 9. Fordi neonatal mus er øjeæble er meget lille og fuld af linsen, kan limbal-tilgang teknik forårsage uønsket kataraktdannelse eller endda phthisis bulbi.
Der er nogle kritiske skridt i denne protokol. Først og fremmest bør indledende punktering være sted lidt posterior for limbus fordi for anterior punktering på hornhinden gør iris indespærring, eller for posterior punktering gør direkte hul ved den perifere retina. For det andet anbefales det at være omhyggelig med at undgå at ramme linsen med nål, samtidig med at den indledende punktering. Det er bedre ikke at indsætte hele facet af nålen for at undgå linse punktering. For det tredje, best tilgang vinkel af nålen er omkring 45 grader mod iris fly, og den stumpe kanyle skal skubbes bagud mod peripapillary område. Endelig bør nålen placeres i subretinarummet under injektionen, hvilket resulterer i ensartede bleb formationer, ellers det fortrængte nålen forårsager intravitreal injektion.
Øjet er et lille orgel med unikke funktioner, der gør det til et attraktivt mål for genterapi 11. Specifikt er det en lille lukket rum med immun-privilegium, der muliggør genterapi med relativ lav toksicitet og immunreaktioner i øjet og systemiske bivirkninger. Nem visualisering og klar adgang til kirurgiske fremgangsmåder er andre fordele i øjet til genterapi. Nethinden har en højt organiseret laminar struktur med 10 forskellige lag. Således kan præcis rumlig genadministration kun opnås ved passende metoder til intraokulær injektion. De to mest almindelige metoder til intraocular levering af virale vektorer er intravitreal injektion og subretinal injektion 6. Generelt intravitreal injektion er den foretrukne vej til indre nethinde målretning retinale ganglieceller og Müller celler. Subretinal injektion er den foretrukne vej til ydre retina målretning fotoreceptorer og RPE-celler. For en effektiv transduktion i RPE, er det nødvendigt at levere virale vektorer subretinalt trods af det potentiale for skade på nethinden.
I denne undersøgelse anvendte vi LV vektorer med GFP og RFP til visualisering. Fordi virale vektorer har tropisme til specifikke celletyper i nethinden, bør virusvektorer vælges efter tropisme af AAV, LV, og Ad til målceller 5. F.eks AAV2 / 2, AAV2 / 6 og AAV2 / 8 er de højeste transduktionseffektivitet til RGC og Müller celler. AAV2 / 5, 2/7, 2/8 og 2/9 effektivt transducere fotoreceptorceller og RPE med AAV2 / 8 er den mest effektive serotype i mus 5,12 5. For LV-vektorer, der er en høj-niveau ekspression i RPE-celler efter subretinal injektioner, men kun lidt eller ingen ekspression efter intravitreale injektioner 13.
For effektiv gen-levering til RPE, bør virale promotorer også overvejes. Virale promotorer, såsom cytomegalovirus (CMV) promotor og kimære kylling beta-actin / CMV enhancer-promotor er stærke og allestedsnærværende promotorer, således anvendes de i fleste undersøgelser genterapi. I RPE, er CMV-promotoren skønnes at udtrykke ti gange så meget protein sammenlignet med den RPE65 promotoren 14. Af betydning, bør den optimale kombination af promotoren og virale vektorer, herunder serotype opnås bedre resultater som påvist ved overlegen ekspression af RPE65 når det menneskelige RPE65 promotor er pakket i serotype rAAV2 / 4 end rAAV2 / 2 15. Fokus på gen-levering til RPE-celler, RPE-specific promotorer, såsom RPE65 eller VMD2 promotoren reducerer off-target sikkerhedsproblemer 16.
AMD er en kompleks sygdom, der har to faser med en benævnt tør AMD degenerativ fase og en fase karakteriseret ved choroidal neovaskularisering benævnt våd AMD. Også AMD er en sygdom, hvor mange arveanlæg herunder komplement faktor H (CFH), supplere C3, supplere faktor I (CFI), er Aldersrelateret makulopati modtagelighed 2 (ARMS2) og ApoE kombineret med miljømæssige risikofaktorer 17. På grund af den komplekse natur af genetiske risikofaktorer i AMD, er der ingen enkelt kandidat gen for dets genterapi. Således er den nuværende genterapi i AMD fokuseret på genoverførsel til at udtrykke anti-angiogene proteiner målrettet mod choroidal neovaskularisering i våd AMD 18. Der er ingen kandidat-gen endnu til behandling tør AMD med en genterapi. For nylig har vi foreslået, at intracellulær amyloid beta ophobning kunnevære relateret til tørre AMD funktioner i transgene mus 19. Desuden blev subretinalt injiceret amyloid beta taget op af RPE i mus (data ikke offentliggjort). Vi kan spalte intracellulær amyloid beta med virale protease 20. Således har vi yderligere studeret genterapi i tør AMD med potentielle mål.
Afslutningsvis genterapi i okulær sygdom er mere lovende end i noget andet organ. Desuden subretinal injektion er en grundlæggende teknik til genterapi i retinale sygdomme, især i relation til fotoreceptorceller og RPE. Således håber vi, at denne teknik bliver mere udbredt og kan bidrage til fremme af genterapi ikke kun i monogeniske arvet retinopati, men også i aldersrelateret makuladegeneration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Seoul National University Research Grant (800-20140542), Pioneer Research Program for NRF / MEST (2012-0009544), og Bio-Signal Analysis Technology Innovation Program for NRF / MEST (2009-0090895), og meddelelse af NRF / MEST (2015M3A9E6028949).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS | WPI | 500233 | |
| VANNAS Scissors S/S, 105 mm | WPI | 555583S | |
| 33 G Blunt needle | WPI | NF33BL-2 | |
| NanoFil Syringe, 10 microliter | WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | For easy one hand injection |
| 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) BD PrecisionGlideTM Needle | BD | 305107 | Initial puncture for subretinal injection |
| Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter) | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Leica operating microscope | Leica | LM M80 | |
| Fluoresecein microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Lentivirus | Thermo scientific | TMO.LV-Ctr | Used to dilute vectors |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to dilute vectors |
| Troperin (Phenylephrin 0.5% - Tropicamide 0.5%) | Hanmi | For dilation | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Sterile) | Bausch&Lomb | For topical anesthesia | |
| Healon GV OVD | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50 (tiletamine hypochloride and zolazepam hypochloride) | Virbac | For general anesthesia | |
| Rompun injection (Xylazine HCl) | Bayer | For general anesthesia |
References
- Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
- Jacobson, S. G., et al. Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years. Arch Ophthalmol. 130 (1), 9-24 (2012).
- Conlon, T. J., et al. Preclinical potency and safety studies of an AAV2-mediated gene therapy vector for the treatment of MERTK associated retinitis pigmentosa. Hum Gene Ther Clin Dev. 24 (1), 23-28 (2013).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet. 383 (9923), 1129-1137 (2014).
- Trapani, I., Puppo, A., Auricchio, A. Vector platforms for gene therapy of inherited retinopathies. Prog Retin Eye Res. 43, 108-128 (2014).
- Liang, F. Q., Anand, V., Maguire, A. M., Bennett, J.
- Peyman, G. A., Lad, E. M., Moshfeghi, D. M.
- Matsumoto, H., Miller, J. W., Vavvas, D. G. Retinal detachment model in rodents by subretinal injection of sodium hyaluronate. J Vis Exp. (79), (2013).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J Vis Exp. (69), (2012).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Sahel, J. A., Roska, B.
- Allocca, M., et al. Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors. J Virol. 81 (20), 11372-11380 (2007).
- Takahashi, K., et al. Sustained transduction of ocular cells with a bovine immunodeficiency viral vector. Hum Gene Ther. 13 (11), 1305-1316 (2002).
- Rolling, F., et al. Gene therapeutic prospects in early onset of severe retinal dystrophy: restoration of vision in RPE65 Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Bull Mem Acad R Med Belg. 161 (10-12), 497-508 (2006).
- Le Meur, G., et al. Restoration of vision in RPE65-deficient Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Gene Ther. 14 (4), 292-303 (2007).
- Alexander, J. J., Hauswirth, W. W. Adeno-associated viral vectors and the retina. Adv Exp Med Biol. 613, 121-128 (2008).
- Puche, N., et al. Genetic and environmental factors associated with reticular pseudodrusen in age-related macular degeneration. Retina. 33 (5), 998-1004 (2013).
- Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Hum Gene Ther. 22 (5), 523-529 (2011).
- Park, S. W., et al. Intracellular amyloid beta alters the tight junction of retinal pigment epithelium in 5XFAD mice. Neurobiol Aging. 35 (9), 2013-2020 (2014).
- Shin, B., et al. Intracellular cleavage of amyloid beta by a viral protease NIa prevents amyloid beta-mediated cytotoxicity. PLoS One. 9 (6), e98650 (2014).
