Introduction
I oftalmologi, har genterapi blivit den behandlingsform i monogena ärvda retinopatier. Det finns ärvda retinopatier associerade med gener i näthinnans pigmentepitel (RPE) inklusive Leber medfödd amurosis 1,2, retinitis pigmentosa 3 och choroideremia 4. Forskningsområdet för genterapi expanderar i både prekliniska studier och kliniska prövningar med virala vektorer såsom adeno -associated virus (AAV), lentivirus (LV) och adenovirus (Ad) 5. Olika virala vektorer har olika tropism i näthinnan. För en säker och effektiv genterapi, bör virala vektorer noga utvalda enligt målceller och målgener.
Rutten för gentillförsel är också viktigt för effektiv genleverans till målceller, vilket således bör det väljas omsorgsfullt samt. De två vanligaste metoderna för intraokulär leverans av virala vektorer subretInal injektion och intravitreal injektion 6. Den senare, intravitreal injektion, har använts i stor utsträckning för drug delivery för behandling av koroidal kärlnybildning i vått åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) och makulaödem i diabetesretinopati 7. Intravitreal väg ger exponering av virala vektorer till glaskroppen och inre näthinnan, men spridningen av vektorerna till yttre näthinnan är begränsad. Å andra sidan, subretinal väg ger direkt leverans av virala vektorer för att det potentiella utrymmet mellan näthinnan och RPE, inducera en lokaliserad Bleb. Därför är subretinal injektion för närvarande vara mer effektiv väg för att rikta fotoreceptorceller och RPE. När det gäller kirurgisk metod, pars plana väljs som ett säkert område för intravitreal injektion för att undvika skada på näthinnan hos människor. Genom att helt enkelt ändra denna inställning till möss, kan vi injicera virala vektorer subretinally eller intravireally via limbus tillvägagångssätt.
I den här videonartikeln visar vi en enkel och bekväm metod för subretinal injektion av virala vektorer i möss RPE. Efter enda punktering på bakre till limbus med en 30 G 1/2 nål, är en 33 G trubbig nål utrustad mikroliter spruta in i subretinalområdet via limbal punktionsställe. De virala vektorer på 1,5 - 2 pl volym injiceras till den potentiella utrymmet mellan näthinnan och RPE inducera subretinal blåsor. Detta förfarande kan utföras under direkt visualisering med hjälp av operationsmikroskop. Upprepad praktiken kommer att garantera repliker resultat även utan direkt visualisering av bubblan bildning. Detta kommer att hjälpa forskarna att utföra exakta och tidsbesparande experiment för subretinal genleverans hos möss RPE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment på djur har utförts i enlighet med Föreningen för forskning i Vision och Ögon Uttalande för användningen av djur i ögon och Vision Research, och de riktlinjer och regler som anges av Seoul National University Institutional Animal Care och användning kommittén och Seoul National Universitetssjukhuset Biosäkerhetskommittén.
1. Förbereda injektion kit och virala vektorer
- Förbered mikroliter spruta försedd med en 33 G trubbig nål steriliseras med etylenoxidgas. Späd virala vektorer i PBS för adekvat titer i microslangen (dvs 1 x 10 6 TU / l). Spola sprutan flera gånger med virala vektorer för att avlägsna eventuellt dött utrymme i sprutan.
2. subretinal Injektion av virusvektorer
- Söva vuxna möss (dvs., 6 - 8 veckor gamla) med en intraperitoneal injektion av blandningen av tiletamine och zolazepam (1: 1, 2,25 mg / kg kroppsvikt) och xylazin-hydroklorid (0,7 mg / kg kroppsvikt) eller en alternativ lämplig anestesi regim.
- Vidga elever med ögondroppar av fenylefrin 0,5% och tropikamid 0,5%.
- Förbered mikroliter sprutan genom att ladda med 1,5 - 2 pl virala vektorer.
- Öppna ögonlocket och skjuter ögat för att exponera ekvatorn för bekväm injektion och fokusera på under operationsmikroskop. Bibehålla den utskjutande ögonläge tills avslutad injektion, eller förskjutning av nålen kan ske under injektionen. Att hålla ögongloben stadigt, placera fingrarna utanför omlopps kanten.
- Applicera en droppe oftalmisk viskoelastisk lösning på hornhinnans yta.
- Placera en liten rund locket på toppen av hornhinnan för att visualisera näthinnan.
- Punktering ett litet hål på liten bakre till limbus med en steril 30 G 1/2 nål för ytterligare subretinal injektion. Gör hålet sämre for höger öga, och överlägsen för vänster öga för bekvämlighet.
OBS: Om hålet görs vid tidsmässiga eller nasal, är det svårt att täckas av ögonlocket efter injektionen. Inledande punktion bör göras något posteriort limbus att undvika de limbala kärl som löper längs limbus och lätt kan kännas igen. Var noga med att undvika att slå linsen med nålen samtidigt som den ursprungliga punktering. Sätt inte in hela avfasning av nålen för att undvika lins punktering. - Placera 33 g trubbig nål för mikroliter spruta genom pre-punkterade hålet och närma sig nålen i subretinalområdet till den punkt då milda motstånd känns.
OBS: För subretinala injektion, är det bästa sättet vinkel nålen ca 45 grader mot iris plan, och trubbig nål ska skjutas posteriort mot peripapillary område. Prickad torget indikerade den föreslagna nålen vägen över glaskroppskaviteten för subretinala injection i figur 1.
OBS: Det blir inget motstånd kände när piercing (eller passerar) de retinaskikt eftersom de är mycket mjuka. Således, den första känslan av mild motstånd indikerar att nålen redan har berört RPE skiktet och införande av nålen bör stoppas. Var noga med att inte tränga skleral vävnad med högt tryck eftersom nålen ska placeras i den potentiella subretinalområdet. Om nålen punkterar skleral vävnad av överdriven kraft, träder den i extraokulära omlopps utrymmen utan motstånd. (Detta steg är kritisk)
Figur 1. Schematisk beskrivning av subretinal Injicerbara. H & E färgade tvärsnitt av musen ögat som visar strukturer med en nål väg för subretinal injektion märkt (en prickad fyrkant). Förstoring: 40X, Skala bar: 500 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Injicera virala vektorer (dvs 1 x 10 6 TU / ul) försiktigt in subretinalområdet utan tremor att undvika oönskade vävnadsskada och dra nålen försiktigt. Håll ögongloben stadigt under injektionen som beskrivs i 2.4.
- Observera bildandet av subretinal bubblan efter injektion under operationsmikroskop för att se till att det inte finns någon retinal blödning.
Figur 2. subretinal Belb Bildning utan retinal blödning. Mikroskopisk bild av subretinal belb efter subretinala injektion under operationsmikroskop visar framgångsrik Bleb bildning utan retinal blödning.m / filer / ftp_upload / 53030 / 53030fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Stäng försiktigt ögonlocket för att täcka injektionsstället för självtätande. Återgå mössen till buren och hålla vid liv tills utvärderingen.
OBS: Efter forskarna vänja sig vid förfaranden, kan de få repeterbara resultat med snabba förfaranden genom att hoppa över dessa steg (2,5, 6, och 10)
3. Utvärdering av effektiviteten av Gene Delivery i pigmentepitelet
- Offra mössen i CO 2 kammare. Enucleate ögonen med sax.
- Fäst ögon i 4% paraformaldehydlösning vid 4 ° C i minst 1 timme till några dagar.
- Ta hornhinnan med fin pincett och punktera hornhinnan med mikro-sax. Ta bort hornhinnan efter scissoring längs limbus. Ta bort lins med pincett.
- Trimma ciliarkroppen med micro-sax möjliggör näthinneavlossning. Dra försiktigt ut hela näthinnan från RPE / koroidea / sklera komplex. Skär RPE / koroidea / skleral komplex radiellt från periferin till centrum nära synnerven flera gånger för att göra 4 till 8 blad för platt montering.
- Vänd på RPE / koroidea / skleral komplicerat att göra RPE nedåt, och trimma alla återstående vävnaderna på skleral sidan, inklusive muskler, bindhinna och synnerven. Detta steg är viktigt att göra en platt RPE / koroidea / skleral komplex eftersom eventuell kvarvarande vävnad gör komplexa ojämn.
- Inkubera komplexet med primär och sekundär antikropp för dina specifika forskningsändamål (tillval, se referenser för detaljerade metoder). Platt-montera RPE / choroid / sklerala komplex på glasskiva och absorbera PBS med en absorberande svamp.
- Tillsätt 30 pl monteringslösning och placera locket. Provet observeras för effekten av vektor leverans enligt fluorescein mikroskop. Håll proverkylskåpet för vidare observation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att utvärdera effekten av subretinala injektion på viral gentransduktion av detta protokoll använde vi kommersiellt tillgängliga LV vektorer med CMV-promotor som uttrycker både GFP och RFP för indikatorn. Ögonen enucleated efter lämplig tidsperiod enligt forskning syfte. För representativa resultat har ögon enukleation 10 veckor och 20 veckor efter subretinal injektion. Efter fullständigt avlägsnande av näthinnan med hjälp av den metod som beskrivs ovan, har den platta fästet av RPE / koroidea / sklera komplex utvärderades under fluorescensmikroskop. De representativa resultat visas i figur 3A (bra exempel med fullständigt avlägsnande av näthinnan) och figur 3B (dåligt exempel med intakt näthinna). Även om förekomsten av kvarleva neurala näthinnan (speciellt fotoreceptor yttre segment) över RPE skiktet inte stör att analysera området gentillförsel i RPE, parerade fluorescensen av GFP / RFP och hämmade direkt videoasering av RPE lager för vidare analyser. Därför skulle fullständigt avlägsnande av neurala näthinnan från RPE / koroidea / sklera komplex ge bättre resultat.
Figur 3. Exempel på RPE / koroidea / skleral Complex Platt-mount enligt fullständigt avlägsnande av Retina. Tjugo veckor efter subretinal Injektion av Lentivirus med GFP / RFP Gene. (A) Bra exempel på RPE platt fäste med fullständigt avlägsnande av näthinnan visar klart och diskret uttryck av GFP / RFP i RPE-celler. (B) Dåligt exempel på RPE platt montera grund av att ingen avlägsnande av näthinnan visar området genleverans med RFP signaler som är otillräcklig för att analysera RPE patologi. Förstoring: 40X, Skala bar:. 500 pm klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
(dvs. 2 ^ il). Detta bidrar till att justera lämplig viral titer för experimentet.
De representativa resultaten av RPE / koroidea / skleral komplex platt mount 10 veckor efter subretinal injektion visades i olika förstoring i fig 4 (40X) och figur 5 (400X). Bilderna med låg förstoring är tillräckligt för att utvärdera området GFP / RFP uttryck. Å andra sidan, de bilder med hög förstoring är nödvändiga för andra RPE patologi om att forskarnas specifika ändamål. Dessa bilder with olika förstoringsgrader det lättare att förstå den virala expressionsmönstret i RPE (fig 4 och 5). Vi har också kontrollerat uttryck av GFP / RFP upp till 36 veckor efter injektion. Expressionen av GFP / RFP observerades fortfarande efter 36 veckor efter injektion (data ej visade).
Figur 4. Exempel på RPE / koroidea / skleral Complex Platt-mount 10 veckor efter subretinal Injektion av Lentivirus med GFP / RFP Gene (Förstoring: 40X). (A) gröna kanalen för GFP (B) röda kanalen för RFP. Skala bar:. 500 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Exempel på RPE / koroidea / skleral Complex Flat-mount 10 veckor efter subretinal Injektion av Lentivirus med GFP / RFP Gene (Förstoring: 400X). (A) gröna kanalen för GFP (B) röda kanalen för RFP. Skala bar:. 50 pm klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna video artikeln beskrev vi limbal-strategi subretinal injektionsteknik i detalj med representativa resultat av RPE / koroidea / skleral platt-mount. Detta är ett enkelt och bekvämt teknik för subretinal injektion av virala vektorer i RPE. Direkt visualisering av Bleb bildning under injektionen är ett viktigt steg för korrekt leverans för nybörjare. Det finns några subretinala injektionsteknik som införts i Journal of Visualized Experiments 8-10. Subretinalområdet är det potentiella utrymmet mellan näthinnan och RPE, därför finns det två möjliga vägar för att närma subretinalområdet. Den ena är en inre syn på subretinalområdet via glaskroppen och näthinnan och den andra är en extern strategi via RPE och sklera. Detta limbal-strategi subretinal injektionsteknik är den förra via intravitreal utrymme och näthinnan. Denna teknik har en fördel att tillhandahålla mer posteriora Bleb bildning jämfört med den senare, eftersom den senare enILLVÄGAGÅNGSSÄTT gör en blåsa från den perifera sido via skleral tunnel eller snitt, som bör göras över den perifera näthinnan. Dessutom är enkelt limbal punktering lättare än skleral tunnel utan retinal penetration. För neonatala möss, men skulle det vara lämpligare att använda utanför strategi 9. Eftersom neonatal musens ögongloben är mycket liten och full av linsen, kan limbal-strategi teknik orsaka oönskad grå starr eller ens phthisis bulbi.
Det finns några viktiga steg i detta protokoll. Först och främst bör inledande punktering vara plats något bakre till limbus eftersom alltför främre punktering på hornhinnan gör iris fängslande, eller för bakre punktering gör direkt hål på perifera näthinnan. För det andra är det rekommenderas att vara noga med att undvika att slå linsen med nålen samtidigt som den ursprungliga punktering. Det är bättre att inte sätta in hela avfasning av nålen för att undvika lins punktering. För det tredje, best frigångsvinkel av nålen är ca 45 grader mot iris plan, och trubbig nål ska skjutas posteriort mot peripapillary område. Slutligen bör nålen placeras i subretinalområdet under insprutningen, vilket resulterar i enhetliga Bleb formationer, annars den förskjutna nålen orsakar intravitreal injektion.
Ögat är en liten orgel med unika egenskaper som gör den till ett attraktivt mål för genterapi 11. Specifikt är det en liten slutna fack med immun privilegium som gör det möjligt för genterapi med relativt låg toxicitet och immunreaktioner i ögat och skadliga systemiska effekter. Lätt visualisering och redo tillgänglighet till kirurgiska metoder är andra fördelar med ögat för genterapi. Näthinnan har en mycket organiserad laminär struktur med 10 distinkta skikt. Sålunda kan noggrann spatial gentillförsel endast uppnås genom lämpliga metoder för intraokulär injektion. De två vanligaste metoderna för intraocular leverans av virala vektorer är intravitreal injektion och subretinal injektion 6. I allmänhet är intravitreala injektionen den föredragna vägen för inre näthinnan targeting retinala ganglionceller och Muller-celler. Subretinal injektion är den föredragna vägen för yttre näthinnan inriktning fotoreceptorceller och RPE-celler. För en effektiv transduktion i RPE, är det nödvändigt att leverera virala vektorer subretinally trots risken för skador på näthinnan.
I denna studie använde vi LV vektorer med GFP och RFP för visualisering. Eftersom virala vektorer har tropism för specifika celltyper i näthinnan, bör virala vektorer väljas enligt tropism av AAV, LV och Ad till målceller 5. Till exempel, AAV2 / 2, AAV2 / 6 och AAV2 / 8 är den högsta transduktionseffektiviteten till RGC och Müller-celler. AAV2 / 5, 2/7, 2/8 och 2/9 transducera effektivt fotoreceptorceller och RPE med AAV2 / 8 är den mest effektiva serotyp hos möss 5,12 5. För LV vektorer, det finns en hög nivå av uttryck i RPE-celler efter subretinal injektioner, men lite eller inget uttryck efter intravitreala injektioner 13.
För effektiv genleverans till RPE bör virala promotorer också övervägas. Virala promotorer, såsom cytomegalovirus (CMV) promotorn och chimära kyckling-beta-aktin / CMV-förstärkare-promotor är starka och allmänt utbredda promotorer, sålunda används de i majoritet av genterapistudier. I RPE är CMV-promotorn beräknas uttrycka tio gånger så mycket protein jämfört med RPE65 promotorn 14. Av betydelse, bör den optimala kombinationen av promotorn och virala vektorer, inklusive serotyp uppnås för bättre resultat, vilket framgår av överlägsen uttryckning av RPE65 när den humana RPE65 promotom är förpackade i serotyp rAAV2 / 4 än rAAV2 / 2 15. Fokusera på genen leverans till RPE-celler, RPE-specific promotorer såsom RPE65 eller VMD2 promotorn minskar off-target Säkerhetsfrågor 16.
AMD är en komplex sjukdom som har två faser med en degenerativ fas kallad torr AMD och en fas som kännetecknas av koroidal kärlnybildning kallad våt AMD. Dessutom är AMD en sjukdom där många genetiskt betingad överkänslighet inklusive komplementfaktor H (CFH), komplettera C3, komplementfaktorn I (CFI) är Åldersrelaterad makulopati känslighet 2 (ARMS2) och ApoE i kombination med miljö riskfaktorer 17. På grund av den komplicerade karaktären av genetiska riskfaktorer i AMD, det finns ingen enskild kandidatgen för sin genterapi. Således är den aktuella genterapi i AMD fokuserat på genöverföring för att uttrycka antiangiogena proteinerna inriktade koroidal neovaskularisation i våt AMD 18. Det finns ingen kandidatgen ännu för behandling av torr AMD med genterapi. Nyligen föreslog vi att intracellulär amyloid-beta ackumulationen kunderelateras till torka AMD funktioner i transgena möss 19. Dessutom var subretinally injicerades amyloid beta tas upp av RPE hos möss (data ej offentliggjort). Vi kan klyva intracellulär amyloid beta med virala proteaset 20. Därför har vi ytterligare studerat genterapi i torr AMD med potentiella måltavlor.
Sammanfattningsvis är genterapi i okulär sjukdom mer lovande än i något annat organ. Dessutom är subretinal injektion en grundläggande teknik för genterapi i retinala sjukdomar, särskilt i förhållande till ljusmätare celler och RPE. Därför hoppas vi att denna teknik blir mer utbredda och kan bidra till en positiv utveckling av genterapi inte bara i monogenic ärvt retinopati men även i åldersrelaterad makuladegeneration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Seoul National University Research Grant (800-20140542), Pioneer forskningsprogrammet NRF / MEST (2012-0009544) och Bio-Signal Analysis Technology Innovation Program för NRF / MEST (2009-0090895), och meddelande av NRF / MEST (2015M3A9E6028949).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS | WPI | 500233 | |
| VANNAS Scissors S/S, 105 mm | WPI | 555583S | |
| 33 G Blunt needle | WPI | NF33BL-2 | |
| NanoFil Syringe, 10 microliter | WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | For easy one hand injection |
| 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) BD PrecisionGlideTM Needle | BD | 305107 | Initial puncture for subretinal injection |
| Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter) | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Leica operating microscope | Leica | LM M80 | |
| Fluoresecein microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Lentivirus | Thermo scientific | TMO.LV-Ctr | Used to dilute vectors |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to dilute vectors |
| Troperin (Phenylephrin 0.5% - Tropicamide 0.5%) | Hanmi | For dilation | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Sterile) | Bausch&Lomb | For topical anesthesia | |
| Healon GV OVD | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50 (tiletamine hypochloride and zolazepam hypochloride) | Virbac | For general anesthesia | |
| Rompun injection (Xylazine HCl) | Bayer | For general anesthesia |
References
- Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
- Jacobson, S. G., et al. Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years. Arch Ophthalmol. 130 (1), 9-24 (2012).
- Conlon, T. J., et al. Preclinical potency and safety studies of an AAV2-mediated gene therapy vector for the treatment of MERTK associated retinitis pigmentosa. Hum Gene Ther Clin Dev. 24 (1), 23-28 (2013).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet. 383 (9923), 1129-1137 (2014).
- Trapani, I., Puppo, A., Auricchio, A. Vector platforms for gene therapy of inherited retinopathies. Prog Retin Eye Res. 43, 108-128 (2014).
- Liang, F. Q., Anand, V., Maguire, A. M., Bennett, J.
- Peyman, G. A., Lad, E. M., Moshfeghi, D. M.
- Matsumoto, H., Miller, J. W., Vavvas, D. G. Retinal detachment model in rodents by subretinal injection of sodium hyaluronate. J Vis Exp. (79), (2013).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J Vis Exp. (69), (2012).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Sahel, J. A., Roska, B.
- Allocca, M., et al. Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors. J Virol. 81 (20), 11372-11380 (2007).
- Takahashi, K., et al. Sustained transduction of ocular cells with a bovine immunodeficiency viral vector. Hum Gene Ther. 13 (11), 1305-1316 (2002).
- Rolling, F., et al. Gene therapeutic prospects in early onset of severe retinal dystrophy: restoration of vision in RPE65 Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Bull Mem Acad R Med Belg. 161 (10-12), 497-508 (2006).
- Le Meur, G., et al. Restoration of vision in RPE65-deficient Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Gene Ther. 14 (4), 292-303 (2007).
- Alexander, J. J., Hauswirth, W. W. Adeno-associated viral vectors and the retina. Adv Exp Med Biol. 613, 121-128 (2008).
- Puche, N., et al. Genetic and environmental factors associated with reticular pseudodrusen in age-related macular degeneration. Retina. 33 (5), 998-1004 (2013).
- Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Hum Gene Ther. 22 (5), 523-529 (2011).
- Park, S. W., et al. Intracellular amyloid beta alters the tight junction of retinal pigment epithelium in 5XFAD mice. Neurobiol Aging. 35 (9), 2013-2020 (2014).
- Shin, B., et al. Intracellular cleavage of amyloid beta by a viral protease NIa prevents amyloid beta-mediated cytotoxicity. PLoS One. 9 (6), e98650 (2014).
