Summary
Vagusnervstimulation (VNS) hat sich als Instrument zur zielgerichteten synaptischen Plastizität im Vorderhirn zu veranlassen, eine Reihe von Verhaltensweisen ändern entstanden. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Umsetzung VNS, um die Konsolidierung der Angst Aussterben Speicher zu erleichtern.
Introduction
Klassische Angstkonditionierung stellt eine weit verbreitete Tiermodell, um die biologischen Grundlagen von Angststörungen zu untersuchen. Während der Furchtkonditionierung, ein aversiven Reiz (der unbedingten Reiz, USA, zum Beispiel ein Fuß-Schock) wird in Verbindung mit einem neutralen Reiz, wie eine Ton und / oder einem Kontext (; CS der bedingten Reiz) präsentiert. Während der Furchtkonditionierung, Verbände zwischen der CS und den USA ausgebildet. Schließlich wird die Präsentation des CS allein löst eine Angstreaktion (die konditionierte Reaktion; CR). In Furchtextinktion wird der CS wiederholt in der Abwesenheit der USA dargestellt, wodurch die CR allmählich verringern 1. So ist vom Aussterben konditionierter Angst ein aktiver Prozess, bei dem ängstlichen Verhaltensreaktionen auf neutrale Reize gedämpft werden, wenn sie nicht mehr aversive Ergebnisse vorherzusagen. Extinction konditionierter Reaktionen erfordert Konsolidierung neuer Erinnerungen, die mit gelernt Verbände konkurrieren. Ein Markenzeichen von Angststörungen ist impaired Aussterben 2-4. Somit dient Extinktion konditionierter Furcht in Tiermodellen als wichtiges Paradigma sowohl inhibitorische Lernen und als Verhaltensmodell für die menschliche Therapie von Angststörungen 5,6.
Da gibt es enge Korrespondenz zwischen Angst und menschliche Angst, wird angenommen, dass diese Studien können Einblick in die biologische Natur der Angst-Erkrankungen wie posttraumatische Belastungsstörung liefern und helfen, Strategien zu entwickeln, um sie zu behandeln. Ein wichtiges Ziel der präklinischen Forschung ist zum Aussterben Lernen zu unterstützen und um zielgerichtete Plastizität in Aussterben Schaltungen zu veranlassen, vom Aussterben Lernen zu festigen. Vagusnervstimulation (VNS) ist eine minimal-invasive neuroprothetischer Ansatz, der verwendet werden könnte, um enge zeitliche und Kreislauf-spezifische Modulation von Gehirnbereichen und Synapsen in fortlaufende Aufgabe beschäftigt ist. Eine Reihe von aktuellen Studien von Michael Kilgard Gruppe an der University of Texas at Dallas habengezeigt, dass die Paarung VNS mit diskreten sensorische oder motorische Reize (zB ein Ton oder ein Hebel ziehen) ist hoch wirksam bei der Förderung der kortikale Plastizität zur Behandlung von Tinnitus 7 oder motorische Defizite zu überwinden, nach Schlaganfall 8-10. Darüber hinaus Nicht-Kontingent VNS, die innerhalb eines kurzen Zeitfenster nach dem Lernen erfolgt in ähnlicher Weise fördert die kortikale Plastizität und verbessert die Gedächtniskonsolidierung bei Ratten und beim Menschen 11-13.
In Anbetracht der Rolle des Vagus in der parasympathischen Weges, ist es nicht verwunderlich, dass es bei der Modulation der Erinnerungen und der synaptischen Plastizität zu beteiligen. Hoch emotionalen Ereignisse neigen dazu, stärker Erinnerungen als Nicht-emotionalen Erinnerungen zu produzieren. Dies ist durch den Einfluss von Stresshormonen auf die Gedächtniskonsolidierung wahrscheinlich. Posttraining Verwaltung des Stresshormons Adrenalin erhöht die Speicherkonsolidierung in menschlichen und nicht-menschlichen Tieren, aber Adrenalin nicht die Blut-Hirn-Schranke 14, 15 kreuzen 16 festgestellt, dass die systemische Verabreichung von Adrenalin erhöht Vagusnerv Brennen, und erhöhte Noradrenalin in der Amygdala 17. Die systemische Verabreichung von Adrenalin nicht verbessern Gedächtniskonsolidierung, wenn β-adrenergen Rezeptoren in der Amygdala 18 was darauf hindeutet, dass der Vagus spielt eine Rolle bei der Bahn, die emotional erregende Erfahrungen verwandelt sich in Langzeitgedächtnis blockiert.
So Paarung VNS mit Ausbildung hat das Potenzial, um die Veränderungen im Gehirn, die Gedächtniskonsolidierung und der Exposition gegenAnlage Cues unterstützt in der Abwesenheit von Verstärkung erhöht die Konsolidierung des Aussterbens Lernen bei Ratten 19,20 verbessern. Hier beschreiben wir die Verwendung von VNS asa-Tool, um kortikale Plastizität fördern und Erlöschen einer konditionierten Angstreaktion zu erleichtern.
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Protocol
Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren werden nach dem NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt, und sie wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der Universität von Texas in Dallas genehmigt.
1. Konstruktion des VNS Cuffs
- Erstellen Sie ein Bohrwerkzeug durch Absägen das scharfe Ende einer 22 ½ G Nadel.
- Führen Sie das jetzt stumpfen Ende der 22 ½ G Nadel über einem Metall Datei mehrmals, um sie zu glätten. Halten Sie die Nadel in einem Winkel von 45 ° auf die Datei und führen Sie es mehrmals über die Datei, während Drehen. Dies führt dazu, dass das Metall dünner und furl nach innen zu werden. ACHTUNG: Führen Sie die Spitze des Skalpells in den Schnitt Ende der Nadel und drehen Sie mit etwas Kraft nach unten, um das Metall zu entfalten.
- Verwenden Vergrößerungsfernglas für die verbleibenden Schritte in Abschnitt 1.
- Mit einem Skalpell (10 oder 15 Messer) geschnitten 4 mm Segmente der Schläuche.
- Legen Sie eine 4 mm-Segment mehr als einkleine Bohrer oder anderen ähnlich geformten Werkzeug. Dies ist, um den Schlauch in Position zu halten, während er betätigt wird.
- 4 Löcher in das Rohr (1A). Löcher sollten die vier Punkte von einer 2 mm um 2 mm im Quadrat zu machen und sollte sauber ohne Ecken und Kanten sein.
HINWEIS: Das Bohrwerkzeug muss nachgeschärft werden (Schritt 1.2) alle 2 oder 3 Löcher. Schwierigkeit bei diesem Schritt ist nahezu sicher auf ein Bohrwerkzeug, die nicht scharf genug ist. - Mit dem Schlauch noch am Bohrer, mit einem Skalpell, um den Schlauch in Längsrichtung zwischen den Öffnungen geschnitten, so dass zwei Löcher am Ende auf beiden Seiten des Schnitts (1B).
- Unter Verwendung einer Nähnadel und Faden, übergeben Naht durch die Löcher, um die Takelage für die ultimative Platzierung der Manschette um den Vagusnerv erstellen. Beginnen Sie mit der Nadel in der Manschette und führt es durch eines der Löcher, dann gehen Sie zurück durch den angrenzenden Loch von außen (Abbildung 1c). Binden Sie die thread zusammen ~ 2 cm aus dem Kunststoff, so daß der Schlauch und Faden bilden ein Dreieck. Lassen Sie ~ 8 cm Faden nach dem Knoten und trimmen. Wiederholen des Prozesses für die Löcher auf der gegenüberliegenden Seite des Ausschnitts. Der Schlauch ist nun bereit, verdrahtet werden.
- Bereiten Drähte für Manschetten.
- Schneiden Sie Platin-Iridium-Draht in 70 mm Segmente.
- Mit den besten Tipp für die Schmuck Fackel, erstellen Sie eine scharfe Flamme mit blauem Zentrum, das als raffinierte wie möglich ist, und es verwenden, um Streifen ~ 1 cm der Kunststoffbeschichtung von dem Draht. Übernehmen Sie die blaue Mitte der Flamme auf abisolierte Ende des Drahtes, um einen kleinen Ball zu erstellen. Übernehmen Sie die blaue Mitte der Flamme auf einige Punkte des abisolierten Teil, um die sieben Stränge miteinander zu verschmelzen. Der Draht in dieser Flecken erscheinen zu knicken.
- Am gegenüberliegenden Ende des Drahtes, gelten die blaue Mitte der Flamme an das Ende, um eine kleine Kugel zu schaffen. Minimieren Strippen der Kunststoff an diesem Ende.
- Verdrahten Sie die Manschette (1D).
HINWEIS: Steps in Abschnitt 1.10 müssen unter Vergrößerungsfernglas durchgeführt werden.- Kleben Sie die Manschette nach unten mit den Themen, so dass es mit der Schnitt horizontal verlaufausgerichtet ist. Ziehen Sie die Fäden fest, damit die Manschette aufgezogen und dann kleben Sie unten die Fäden.
- Fassen Sie die geballt Ende des abisolierten Seite des vorbereiteten Draht mit # 5 Zange und schieben Sie durch die untere rechte Loch. Ziehen die Zange aus dem Loch, so dass das Ende des Drahtes in der Mitte der Manschette.
- Re-greifen die geballt Ende des abisolierten Draht (jetzt in der Mitte der Manschette) und drücken Sie sie durch die obere rechte Loch. Ziehen Sie die Zange aus dem Loch, so dass der Draht vollständig durch die Manschette und lose auf der Oberseite der Manschette übergeben.
- Re-greifen die geballt Ende des abisolierten Draht (jetzt außerhalb der Manschette auf der Oberseite) und drücken Sie sie durch die obere rechte Loch von innen Rücken. Auch weiterhin tun, bis der Draht richtig an seinem Platz: Test durch Ziehen am anderen Ende des Drahtes.
HINWEIS:Während dieses Prozesses ist es wichtig, die abisolierten / isolierter Abschnitte des Drahts zu unterscheiden. Der Draht, der schließlich in den "Trog" der Manschette positioniert ist, muss entfernt werden, aber alles unterhalb der Löcher (außerhalb der Manschette am unteren Ende) zu isolieren. Dies stellt sicher, Lieferung von Strom nur zu den Vagusnerv. - Fassen Sie die geballt Ende des isolierten Seite und schieben Sie es durch die untere rechte Loch von der Innenseite der Manschette, um einmal looping es.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.10.2 - 1.10.5 auf der linken Seite der Manschette, so dass zwei Drähte enden an den Schlauch, eine auf der rechten Seite und einer auf der linken Seite befestigt.
- Legen Sie eine goldene Nadel in den Arm des helfende Hand mit dem Loch nach oben zeigt. Füllen Sie das Loch mit einem Flussmittel.
- Löten Sie die isolierten Ende des Drahtes (jetzt an der Manschette angebracht ist) in den Stift.
- Ermöglichen das Lot abkühlen und dann in der Schmelze wieder. Dies gewährleistet eine gute Verbindung zwischen dem Ende des Drahts und der inside des Stiftes. Bewerben mehr Lot, wenn nötig. Wiederholen Sie für die zweite Leitung.
- Mit den Leitungen laufen nach rechts, markieren Sie die Spitze der Manschette mit Permanentmarker. Markieren Sie außerdem die Goldstift an die Spitze führen befestigt.
2. Konstruktion Kopfhaube für VNS Eingang Website
- Schneiden Sie 30 mm Segmente 26 AWG Kupferdraht. Streifen einen kleinen Teil an jedem Ende.
- Schneiden Sie das schmale Ende off losen gold Stifte und löten Sie das abisolierte Ende des Kabels an das abgeschnittene Ende des Gold-Pin. Erstellen Sie zwei Draht / Stift-Verbindungen für jede gewünschte Eingangs Website. Legen Sie einen Stecker in die helfenden Hände und löten den Draht Ende eines Drahtes / pin-Verbindung zu der jeder der beiden gefluxte Zähne des Verbinders (2G).
- Mark einer der Drähte mit Filzstift. Während der Operation, positionieren Sie das Implantat mit dem gekennzeichneten Adern rostral zum freistehenden Draht.
3. VNS Surgery
- Schaffen Sie kundenspezifische Glaswerkzeuge für die Bearbeitung von Vagus Nerven während der Operation.
- Verwenden Borosilikatglas zu einer Mikropipette zu ziehen, so dass es eine lange konische Spitze. Wenn keine Pipettenzieher zur Verfügung steht, zu brechen das Glas, um eine längere Kante zu schaffen.
- Halten Sie den nicht verjüngten Ende der Pipette in ein dickes Tuch (um Verbrennungen zu vermeiden) und drücken Sie die verjüngende / gebrochen Ende zu einem glatten feuerfesten Oberfläche beim Auftragen der blauen Flamme von der Schmuck-Fackel, um das verjüngte Ende. Das Glas zu biegen, wie es in die Oberfläche gedrückt wird. Bewerben Flamme, bis einem Haken oder J-Form bildet.
- VNS chirurgischen Eingriffen
- Zu sammeln und zu sterilisieren alle Werkzeuge. Bereiten Sie eine Sanitär, beheizte Operationsgebiet.
- Betäuben Tieres mit Ketamin / Xylazin (85 mg / kg, 5 mg / kg, IP). Beurteilen Sie die Tiefe der Narkose Ebene durch Überwachung Lautäußerungen des Tieres und Rücknahme-Reflexen in Reaktion auf die Zehen und / oder Schwanz Kneifen.
- Rasieren Sie die Spitze des Kopfes und linker Halsseite Tieres. Augen des Tieres zu schützen mit mineral Öl oder Augensalbe. Bewerben Jod Reinigungslösung mit Gaze und dann Alkohol mit Gaze auf die rasierte Bereichen. Wiederholen Sie einmal.
- Injizieren 0,05 ml Marcain subkutan auf der Oberseite des Kopfes und lassen Sie den Bolus zu zerstreuen, während, indem das Tier in den stereotaktischen Instrument.
- Verwenden Sie ein Skalpell, um einen Einschnitt in die Haut am Schädel sowohl Lambda und Bregma aussetzen zu machen. Vorbereitung eines Pfades für die Manschette mithilfe stumpfen Pinzette tunneln subkutan aus der Inzisionsstelle auf der linken Seite vor dem Ohr an der linken Seite des Halses.
- Ziehen Sie die Inzisionsstelle mit Gefäßklemmen geöffnet. Verwendung Wattestäbchen, gelten Wasserstoffperoxid zu der exponierten Schädels, um jegliches verbleibende Gewebe zu entfernen.
- Mit einem Skalpell, bohren Sie zwei flache Starter Löcher in den Schädel, um Ankerschrauben zu platzieren. Sie sollten weit genug voneinander entfernt, um Platz für das Implantat ermöglichen gesetzt werden, aber nicht zu nahe an dem umgebenden Gewebe. Vermeiden Sie es, Schrauben direkt an der Mittellinie.
- Mit Kraftps und Schraubenzieher, fahren eine Knochenschraube in beide Löcher. Die Schrauben sollten dicht sein in den Löchern, mit den Kappen 2 - 3 mm über der Oberfläche des Schädels, um Platz für Acryl erlauben, unter und um die Schrauben füllen.
- Füllen den Raum unter, um und zwischen den Schrauben mit einer kleinen Menge der Acrylsäure, die Vermeidung der umgebenden Gewebe. Dann einen größeren Menge Acryl in der Mitte des Schädels zwischen den beiden Schrauben.
- Schnappen Sie sich das Implantat, so dass die markierte Ader ist mit dem nicht markierten Draht orientiert rostral und schnell das Implantat in der Acryl, dabei nicht zu Acryl in die Gold-Pins, der Verschluss-Bereich, oder der Eingangsstelle auf Spitze. Nach der Positionierung zu ermöglichen, ~ 5 min, bis sie trocken gesetzt. Dies kann auch mit dem Arm des stereotaktischen Unterstützung durchgeführt werden. Füllen Sie Risse oder Lücken zwischen dem Implantat und Schädel mit einer niedrigen Viskosität Mischung aus Acryl. Trocknen lassen.
- Verwenden Vergrößerungsfernglas für die verbleibenden Schritte in Abschnitt 3.2.
- Entfernen the Tier aus der stereotaktischen Instrument. Legen Sie das Tier auf der rechten Seite, rotierende es leicht in die Bauchlage.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt in etwa über die linke Halsschlagader. Der Kieferknochen und Schlüsselbein sollte etwa gleich weit in die Einschnittstelle sein. Erweitern Sie den Schnitt mit stumpf, bis der Muskelschicht erreicht ist. Die M. sternocleidomastoideus, M. sternohyoideus und M. omohyoideus Muskeln sichtbar sein soll. Verwenden Muskelwundhaken, um die Website offen zu halten.
- Weiter stumpfes Sezieren entlang der natürlichen Furchen zwischen den Muskeln. Achten Sie auf das Pulsieren der Halsschlagader. Überschrift durch den Muskel zu dem pulsierenden die Halsschlagader zu offenbaren. Ziehen Sie die Muskeln wieder mit dem Rückziehmuskel. Die Hülle, die die Halsschlagader enthält auch den Vagusnerv. Vorsichtig stumpf sezieren die Hülle mit der Schere.
- Identifizieren Sie den Vagusnerv. Es ist die größte Nerv im Karotisscheide und ist normalerweise zur linken Seite der Arterie des Tieressondern kann auf jeder Seite. Wechseln Sie in das benutzerdefinierte Glaswerkzeuge und trennen den Vagusnerv aus der Halsschlagader. Der Nerv sollte mindestens 5 mm frei von anderem Zellgewebe.
- Von dem Einschnitt auf dem Kopf, mit den Themen auf der Seite der Manschette gegenüber den Zuleitungen, ziehen Sie die Manschette über den zuvor gemachten subkutanen Tunnel mit einer Pinzette oder kleinen Gefäßklemmen. Schieben Sie es durch das Gewebe in die Einschnittstelle auf den Hals.
- Heben Sie die Nerven, das mit den Glaswerkzeuge und schieben Sie die Fäden auf der Seite der Manschette gegenüber den Leitungen unter dem Nerv. Ziehen Sie die Fäden den ganzen Weg durch, dabei nicht gegen die Nerven reiben. Die Manschette sollte unmittelbar neben dem Nerv.
- Stellen Sie sicher, die Manschette mit der Aufschrift "top" Seite überlegen orientiert. Löschen Sie die Nerven in die Mitte der Manschette. Der Nerv sollte nun über beide Leitungen liegen in der Mulde der Manschette (2B). Binden Sie die Fäden zusammen, um die Manschette zu schließen.
- Auf der Kopfhaube, stecken Sie die Stifte an der Manschette in die Gold-Pins auf der Stimulation Eingangsstelle angebracht. Stecken Sie das markierte Stift in die Goldstift zu den Frontzahn auf der Simulation Eingangsstelle angebracht.
- Zu überprüfen, dass die Manschette richtig stimuliert die Vagusnerv, führen Sie einen Atemstill Test verbindet den Stimulator an die Stimulationseingabestelle auf dem headcap Laufen Stimulation (0.2 mA, 60 Hz, bis zu 10 sec). Die Atmung sollte kurz stoppen und Herzfrequenz sollte fallen, die Überprüfung der Manschette Funktion.
- Sichern Sie sich die Pins auf der Stimulation Eingang Website mit Acryl. Decken Sie die Kabel und stellen Sie sicher, dass freiliegende Stifte und Drähte nicht zu Kurzschlüssen führen. Verwenden Acryl zu glätten keine Beulen oder in irgendwelchen Lücken zu füllen. Trocknen lassen.
- Naht verschlossen beide Inzisionsstellen. Injizieren 0,05 ml Marcain subkutan in der Nähe des Halses Einschnittstelle. Gelten antibiotische Salbe auf Websites Einschnitt. Optional lassen einen Stecker in Stelle auf der Stimulation Eingang Website zuSchutz vor Beschädigungen und Verstopfung während des Heilungsprozesses.
- Behandeln Sie mit Antibiotikum und folgen standard post-operative Betreuung einschließlich angemessenen Schmerzmitteln. Rückgabe Tiere Tierhaltung Anlage, nachdem sie die Mobilität wieder zu erlangen. Lassen Sie 5 Tage für Erholung. Um eine maximale Lebensdauer und Funktion der Kopfhaube, Haustieren einzeln für den Rest des Experiments zu gewährleisten.
HINWEIS: Sham-VNS-Ratten durchlaufen die gleichen Operationen, aber die Schaltung ist mit kurzen auf der Ebene des Kopfhaube (dh ein headcap implantiert und die Vagusnerv aus der Halsschlagader getrennt, aber keine Elektrode Manschette um die angeordnet entworfen Nerv).
4. Auditory Angst Anlage
HINWEIS: Diese Angst Anlage Protokoll ist intensiver als die meisten 21, weil das Ziel dieser Versuche ist es, vom Aussterben zu verbessern. Mit milden Angstkonditionierung, die leicht ausgelöscht wird, kann ein Bodeneffekt dieser Erweiterung zu verschleiern.
- Folgen Sie den ursprünglichen Ton Präsentationen mit 8 Ton-Fuß-Schock (1 sec, 0,5 mA) Paarungen auf jeder der 2 aufeinanderfolgenden Tagen. Wiederholen Sie die Ton-Fußschock Paarungen wieder am zweiten Tag. Variieren Sie die Inter-Stimulus-Intervall (ISI) zwischen 2 und 4 min mit durchschnittlich 3 min für jede Studie. Zufälliger Punkt, an dem während der Ton der Schock auftritt.
- Stecken Sie die Ratten in den Stimulator, indem Sie die Stecker aus der StimulatoR in den Stimulationseingabestelle. Ort Tiere in die Kammer (2A, 2C). Stellen Sie den Stimulator auf 0,4 mA, 500 & mgr; s Pulsbreite bei 30 Hz. Stellen Stimulation zu einer Gesamtlaufzeit von 30,15 sec, ab 150 msec vor dem Einsetzen des Tons. Spielen Tieren 4 Töne (wie in Schritt 4.6) und koppeln jeden Ton-Präsentation mit VNS oder Sham VNS.
- Stecker das Tier in als normal und spalten die Ausgabe von dem Stimulator zum Oszilloskop.
- Stellen Sie den Bereich auf dem Oszilloskop als -20 V bis +20 V und führen Stimulation. Die Wellenform des 30 Hz Stimulation sollte auf dem Oszilloskop angezeigt werden. Stimulationen von mehr als 10 V in Größe zeigen mit hoher Impedanz und einem nicht korrekt funktionierenden Manschette oder Verbindung an der Stimulation Eingang Website.
5. In vivo-Recordings der evozierte Feldpotentiale
Anmerkung: Dieser Schritt ist optional. Evozierte Feldpotentiale (EFP) in Isofluran-narkotisierten Ratten in einem stereotaktischen Apparat montiert ist, nach Standardverfahren aufgezeichneten 23,24 24 Stunden nach Tests der Wiedereinstellung (Tag 5).
- Zu sammeln und zu sterilisieren alle Werkzeuge.
- Induzieren Narkose mit Isofluran (5% in 100% Sauerstoff, Durchfluss 1l / min) in einem durchsichtigen Kunststoff-Kammer. Beurteilen Sie die Tiefe der Narkose Ebene durch Überwachung Lautäußerungen des Tieres und Rücknahme-Reflexen in Reaktion auf die Zehen und / oder Schwanz Kneifen. Verwenden Mineralöl oder Augensalbe die Augen zu schützen.
- Injizieren 0,05 ml Marcain subkutan auf der Oberseite des Kopfes und lassen Sie den Bolus zu zerstreuen. Verwenden Sie ein Skalpell und Gefäßklemmen, um die Kopfhaube aus dem Schädel zu entfernen. Verwenden Sie so wenig Kraft wie möglich zu verschleiern Bregma.
- Legen Sie das Tier in der stereotaktischen Instrument. Verwenden Sie ein Skalpell, um den Einschnitt sowohl Lambda und Bregma aussetzen erweitern. Aufrechtzuerhalten Narkose Ebene mit Isofluran (3% in 100% Sauerstoff, Durchfluss 1 l / min) über einen Nasenkonus.
- Die Bohrungen in den Schädel über dem infralimbischen präfrontalen Kortex (IL) und der basolateralen Amygdala (BLA). Senken einer Glasmikroelektroden (2 M KCl; 1-2 MOhm Widerstand) in die BLA (D / V: 7,2, A / P: 2,7, M / L: 4,9 von Bregma) und eine stimulatIonenelektrode in die IL Bereich des medialen präfrontalen Kortex (D / V: 4,6 A / P: 3,0, M / L: 0,7 vom Bregma) (4A).
- Stimulieren die IL auf EFPs in der BLA evozieren. In Figur 4 gezeigten Daten wurden mit den folgenden Einstellungen erfasst: ein Stimulationsimpuls von 0,3 ms Dauer, mit einer Stimulationsintensität, die auf 40% der minimalen Stromstärke, der eine maximale Feldantwort hervorgerufen entsprach (auf Grundlage eines Eingangs-Ausgangs-Kurve vor fest Sammlung von Basisdaten) lieferte alle 15 sec.
- Sammeln Ausgangsdaten für ein Minimum von 10 bis 15 min vor der Induktion der synaptischen Plastizität.
HINWEIS: Die zur synaptischen Plastizität hervorzurufen wird den Anforderungen der Experimente variieren und müssen sorgfältig von jedem Experimentator gewählt werden Protokoll. Daten in 4C zeigt Veränderungen in der EFP folgenden 3 Ausbrüche von 100 Pulse bei 50 Hz (2 sec), mit 20 sec Inter-Burst-Intervalle bei der minimalen Stromstärke, die evozierend die maximale Feld Antwort. - Messen der Amplitude des EFP als die Differenz zwischen dem Mittelwert einer 5 msec Fenster, bevor der Stimulationsartefakt und der Mittelwert von 5 msec Fenster um 20 bis 25 ms nach dem Stimulationsartefakt, entsprechend dem negativen Spitzenwert des Feldpotentials. Normalisieren Daten zu den Ausgangswerten und den Durchschnitt von 10 Minuten Grundlinie als 100%. Mit den gemittelten EFP Amplituden weitere 10 Minuten Zeit nach Plastizität Induktion (zB 40 - 50 min nach Induktion), um langfristige Veränderungen in EFP Amplitude zu bewerten.
- Nach dem Ende der Aufnahme zu enthaupten die narkotisierten Tier und extrahieren das Gehirn. Bereiten Gewebe zur histologischen Überprüfung der Elektrodenplatzierung.
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Representative Results
In diesem Abschnitt werden Beispiele für Ergebnisse, die durch die Verwendung VNS in Kombination mit vom Aussterben Lernen, um die Expression des konditionierten Angstreaktion in Ratten zu verringern gewonnen werden können. Für den Tagen 1 und 2 (Auditory Angst Anlage) wurden die Ratten auf einem Gehörfurchtkonditionierung Aufgabe, in der Fußschocks wurden mit einem Ton, gepaart geschult. Am Tag 3 (Pre-Behandlung Test), wurden Töne in der Abwesenheit von Fußschocks, um ein Einfrieren zu messen und zu schließen Anlage Angstreaktion Nahme vorgestellt. Am Tag 4 (Behandlung) Ratten erhielten gruppenspezifische Aussterben Ausbildung und Behandlung: 4 Ton-Präsentationen wurden entweder mit VNS oder Schein-Stimulation oder im erweiterten Aussterben Gruppe, 20 Ton Präsentationen mit Scheinstimulation gepaart. Einfrieren Ebenen wurden erneut an Tag 5 in Reaktion auf 4 Präsentationen allein der CS (Nachbehandlung Test) (siehe Zeitleiste in 3A) getestet. Tiere, die eine begrenzte Anzahl (4) der nicht-verstärkten Forderung an das co empfangenennditioned Ton während der Auslöschung Phase zeigen nur eine kleine Verringerung der konditionierte Furcht auf den folgenden Wieder Tag (3B). Im Gegensatz dazu VNS behandelten Ratten zeigen eine signifikante Verringerung der Gefrier nach einer einzigen Aussterben Trainingseinheit (3B). Der Betrag der Verringerung im konditionierten Furcht Antwort des VNS-behandelten Tiere ist vergleichbar mit dem in scheinbehandelten Tieren, die 5-fache Menge an unverstärktem Belichtungen (20 Töne) während Extinktion Ausbildung (Gruppe EE in 3B) übermittelt gesehen. Unter Verwendung der spezifischen Versuchsaufbau oben skizzierten können VNS auch Aussterben zu erleichtern Rahmen. Wie in 3C gezeigt ist, auch VNS Tiere zeigten außerhalb der Darstellung der aufbereiteten Ton verringert Gefrierverhalten, was darauf hindeutet, daß ihre Extinktion Ausbildung auch den Kontext verallgemeinert. Wir zeigen auch, dass die Paarung VNS vom Aussterben Training verändert die Metaplastizität in den Weg between der infralimbischen Kortex (IL) und der basolateralen Amygdala (BLA) bei narkotisierten Tieren (Abbildung 4). In Angst Anlage Tieren, die nicht vom Aussterben Training, kurze Burst Stimulation (HFS) der IL induzierte LTD der evozierten lokale Feld in der BLA (Abbildung 4) zu unterziehen hat. Ob sie verlängert Aussterben Training oder VNS während einer einzigen Sitzung vom Aussterben gegeben wurden, wurde dieser synaptische Depression in Tieren zeigen signifikante Aussterben der konditionierten Angst umgekehrt; Die Verabreichung VNS während Extinktion gefördert Induktion von LTP während die Tiere in der ausgefahrenen Extinktion Gruppe zeigte keine Veränderung in Reaktion auf HFS. Dieses Ergebnis wurde auch bei Tieren, die in der Vier-Ton Aussterben Gruppe schein-stimuliert wurden beobachtet. Wichtig ist, VNS nur verändert die Plastizität in dem Weg zwischen dem IL und der BLA, wenn es in einer Extinktion Kontext geliefert. Im Gegensatz dazu lieferte VNS ungeübten Tiere in ihre Käfige hatte keine Wirkung auf synaptic Plastizität im IL-BLA-Weg (Abbildung 4B).
Abbildung 1. Aufbau des Vagus-Nerven-Manschetten. (A) Die Platzierung des 4 mm Schlauchstück auf den Bohrmeißel für Stabilität, die die Verwendung eines modifizierten Nadel, um Löcher in den Schlauch zu bohren. (B) Löcher in die gemacht worden Schlauch und der Schlauch wurde in der Mitte. (C) Die Platzierung des Nähfadens durch die Löcher der Manschette abgeschnitten. Man beachte, dass der Faden geht über die Lippe der Manschette. (D) Insertion der Platin-Iridium-Drähte an der Manschette. Top-Shows abgeschlossen Verdrahtung unten zeigt Verdrahtung ausgeführt. (E, F) Die fertige Manschette mit den Gold-Pins an das Ende der Drähte befestigt. Siehe Einfügen in (F) für die Skala. (G) Zeigt die chenden Kopfhaube Stück, das während der in Schritt 3 beschriebene Operation am Schädel befestigt wird Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Vagusnervstimulation und Versuchsaufbau. (A) Schematische Darstellung der Set-up für Vagusnervstimulation (VNS) verwendet. Die Tiere werden mit einer Stimulationsisolationseinheit über eine Kopfhaube, aus dem 2 Platin-Iridium Drähte führen subkutan in die maßgeschneiderte Stulpe-Elektrode, die um den Nervus vagus gewickelt angeschlossen ist. (B) Platzierung der Manschette-Elektrode um den Nervus vagus. Mikroskopische Aufnahme des chirurgischen Einschnitt und der exponierten Vagusnerv, bevor die Manschette Elektrode herum vernäht. (C) Foto des Setup für verwendetGehörfurchtkonditionierung, mit dem Tier an den Stimulator angeschlossen. (Abbildung von Reference 20 modifiziert). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. VNS verbessert Aussterben Gehörfurchtkonditionierung. (A) Experimentelle Timeline. Tag 1 und 2: Auditive Angst Anlage, 8 Ton (CS) / Schock-Paarungen (US) pro Tag. Tag 3: Klima Angst-Test vor, das Einfrieren während 4 ungepaarte Ton Präsentationen gemessen. Tag 4: Behandlung, 3 Gruppen: 4 Ton Präsentationen gepaart mit VNS, 4 Ton Präsentationen mit schein-Stimulation, 20 Ton Präsentationen gepaart mit Scheinstimulation (EE) gepaart. Tag 5: Klima Angst Test-Post, Gefrieren während 4 ungepaarte Ton Präsentationen gemessen (B). (C) Prozentsatz der Zeitaufwand während der inter-Ton-Intervallen (ITI) an Tag 3 (D3, weiße Balken Gefrieren ) und am Tag 5 (D5) in B. VNS Tieren gezeigt den gleichen Gruppen zeigten auch außerhalb der Darstellung der aufbereiteten Ton verringert Gefrierverhalten. (* P <0.05, Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert). (Abbildung von Reference 20 modifiziert). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. VNS verändert Metaplastizität in der IL-BLA-Weg. (A) Repräsentative Stimulation und Aufzeichnung Stätten in der IL und BLA und repräsentative Spuren einer Input-Output-Kurve der Feldpotentiale in der BLA nach Stimulation des IL erfasst. (B ) synaptischen Plastizität in der IL-BLA-Weg als Reaktion auf kurzen Burst-Stimulation in 4 Gruppen von Ratten. Oben rechts: In Furcht Anlage Ratten kurzen Burst Stimulation des IL induziert LTD in der BLA. Mitte links: Ratten, die 4 Ton Aussterben Training mit Scheinstimulation erhielten zeigen auch, LTD. Unten links: Ratten, die erweiterte Aussterben Training mit Schein-Stimulation erhalten keine Veränderung oder eine Erholung der LTD, die in der Furcht Anlage nur Gruppe und der Schein-Stimulationsgruppe induziert wurde. Mitte rechts: bei Ratten mit VNS behandelt, während eines einzigen extinction Sitzung wird synaptischen Stärke weiter verstärkt, was zu einer LTP. Unten rechts: VNS im Käfig geliefert bewirkt keine Veränderung der Plastizität. Abkürzungen: IL, infralimbischen Kortex; PL, prälimbischen Kortex; BLA, basolateralen Amygdala, LA, lateralen Kern der Amygdala; CE, zentralen Kern der Amygdala. (* P <0.05, Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert). (Abbildung von Reference 20 modifiziert). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 5 vereinfachte schematische Darstellung des Hirnstamms Innervation durch den Vagusnerv und zweiter oder höherer Ordnung Projektionen. Durch die indirekte Modulation der Monoamin-Kerne im Hirnstamm, einschließlich des Locus coeruleus (LC) und der Raphe nuclei (DRN) kann der Vagusnerv wichtige Komponenten des vom Aussterben Schaltung, die den präfrontalen Kortex (PFC), die Amygdala (Amyg) gehören zu modulieren, der Hippocampus (Hipp) und der Nucleus accumbens (NAC). Bitte klicken Sie hier, um zu sehen eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll, das verwendet wird, um vom Aussterben konditionierter Angst während einer einzigen Sitzung der Exposition gegenüber konditionierten Signale 19 zu erleichtern und die Plastizität in den Weg zwischen dem infralimbischen Kortex und der basolateralen Amygdala, die vermitteln können Aussterben Lernen 20 zu modulieren. Ein entscheidender Schritt für den Erfolg dieses Protokolls ist die ordnungsgemäße Lieferung der VNS bei Aussterben Ausbildung. Daher sollte besondere Sorgfalt auf die Konstruktion der Manschette Elektroden und der Anordnung der Manschette um den Vagusnerv gegeben. Beim Bau des Manschettenelektrode ist es wichtig, sicherzustellen, dass der freiliegende Abschnitt der Drähte in der richtigen Stelle. In ähnlicher Weise während der Operation, sollten besondere Anstrengungen unternommen werden, um die Manschette in der richtigen Position anzuordnen und ihn ausreichend zu verankern, so dass der Stromkreis zwischen der Manschette und dem Stimulator intakt über den Verlauf des Versuchs bleibt. Die einwandfreie Funktion der Manschette sollte be geprüft nach der Operation nach der Verhaltenstests (wie in Schritt 3.2.20 beschrieben) und wiederum (wie in Schritt 4.8 beschrieben).
Die Mechanismen, durch die VNS moduliert Aktivität im Zentralnervensystem sind nicht vollständig verstanden. Die zervikale Vagusnerv ist der afferenten sensorischen und motorischen Fasern efferent in etwa einer 4-zu-1-Verhältnis zusammengesetzt, die jeweils 25. Vagale Afferenzen Relaissignale an den Nucleus tractus solitarius (NTS), die dann Projekte Kern, Hypothalamus, Thalamus, der Amygdala, Hippocampus und 26,27 parabrachialis. Wichtig ist, Monoamin-Kerne im Hirnstamm, dem Locus coeruleus (LC) und der Raphe-Kerne, erhält direkte und / oder indirekte Projektionen aus dem NTS (Abbildung 5). Somit kann VNS kortikale Plastizität und Speicher über die synergistische Wirkung mehrerer Neuromodulatoren modulieren. Vorgeschlagene Auswirkungen auf Vagusreizung Zusammenhang umfassen Veränderung von Norepinephrin (NE) Freigabe durch Projektionen von den NTS auf dieLC, erhöhte Werte von hemmenden GABA, und die Hemmung der kortikalen Aktivität anomale durch Retikularsystem Aktivierung 28,29,30. Eine wichtige Rolle für Acetylcholin, Serotonin und Wachstumsfaktor BDNF wurde auch gezeigt, 31-35. Zur Modulation der Angsterinnerungen und Extinktion in der Regel sind die Auswirkungen der VNS auf Transmitterfreisetzung im präfrontalen Kortex (PFC), die Amygdala und der Hippocampus wahrscheinlich besonders relevant 36,37 sein. Akute VNS erhöht Noradrenalin und Serotonin-Freisetzung sowohl in der medialen PFC 33,38 und der Amygdala 39,30. Akuter VNS erhöht auch Noradrenalin 38 und verbessert synaptischen Übertragung im Hippocampus 40-42. Norepinephrin wurde bereits früher gezeigt, dass bei der Modulation der Expression Angst beteiligt sein. Läsionen der NE Projektionen aus dem LC an den Vorderhirn das Aussterben der aktiven Vermeidung beeinträchtigen ohne Änderung Erwerb oder die Beibehaltung des original Lern 43,44. Konsolidierung der konditionierten Angst hängt von β-Adrenozeptor-Aktivierung in der BLA 43, und mehrere Berichte deuten auf eine Rolle sowohl für α- und β-adrenergen Rezeptoren in den medialen PFC in Gedächtniskonsolidierung sowohl drogen- und Angst-Auslöschung Ausbildung 46-49. Somit wird, wenn die Paarung Aussterben Training mit VNS, die VNS-induzierte Freisetzung von Neuromodulatoren wie NE oder 5-HT scheint die synaptische Plastizität, die von der Ausbildung führt allein, was zu einer verbesserten Konsolidierung des Aussterbens zu erleichtern.
Ein Hauptvorteil der VNS liegt in seiner zeitlichen und räumlichen Spezifität. Im Gegensatz zu systemisch oder sogar lokalen Medikamentenapplikation, die oft eine langsame Beginn und Offset von Aktion können VNS selektiv mit spezifischen Verhaltensweisen gekoppelt werden, um die synaptische Plastizität in diesen aktiven Netzwerken, die das Verhalten von Interesse zu regulieren zu erleichtern. Wir beschreiben hier eine VNS-Protokoll, Parameter auch klinisch zur Bearbeitung verwendet, verwendetnt von Epilepsie beim Menschen (0,4 mA, 500 & mgr; s Pulsbreite bei 30 Hz, Stimulationszyklus von 30 Sekunden auf und 5 min aus). Mikrodialyse-Experimente zeigen, dass VNS unter Verwendung dieser Parameter führt zu einer lang anhaltenden, etwa 2-fachen Anstieg von NE-Release in der Amygdala 39. Dieses große und relativ langsame Anstieg der NE mag erklären, warum VNS gepaart Aussterben Ausbildung, im Gegensatz zu längeren Aussterben Ausbildung von selbst, erleichtert auch das Aussterben der Gefrierverhalten außerhalb der Vorstellung des bedingten Reiz (die intertrial Intervall). Da in unseren Experimenten Tiere unterzogen Aussterben Ausbildung in demselben Kontext wie dem Gehörfurchtkonditionierung, die Verringerung der Gefrierverhalten während der ITI zeigt an, dass VNS erleichtert Verallgemeinerung Aussterben Lernen auf den Kontext.
Trotz der potenziell langfristiger Wirkung auf NE Mitteilung sind jedoch Auswirkungen auf das Verhalten oder VNS synaptische Plastizität nur ersichtlich, wenn sie w gepaart sindith ein bestimmtes Verhalten. Anwendung des VNS an Ratten in ihre homecages kurz nach Furchtextinktion Ausbildung nicht erleichtern Extinktion 20 und in ähnlicher Weise angewendet VNS außerhalb eines spezifischen Verhaltenskontextes nicht die synaptische Plastizität im IL-BLA Wegs (cf 3C) nicht verändern. Auf der anderen Seite, auch kurze Anwendungen von VNS (zB 0,8 mA als eine Folge von 15 Impulsen, 100 & mgr; s Pulsbreite bei 30 Hz für 500 ms) spezifische und dauerhafte Änderungen der sensorischen oder motorischen Netzwerke verursachen, wenn sie Kontingent geliefert werden mit laufenden Verhalten.
Ein Samen Papier von Michael Kilgard Gruppe 7 zeigte, dass die zeitlich genaue Paarung von VNS mit der Präsentation eines einzelnen Tones führt zu Plastizität im auditorischen Kortex Karte von Tonfrequenz. Diese Effekte wurden bereits klinisch verwendet worden, um krankhafte Plastizität im auditorischen Kortex umzukehren, um Tinnitus 50 zu behandeln. ÄhnlichWiederholte Paarung von VNS mit einem Motorverhalten hat sich gezeigt, motorischen Cortex 8 reorganisieren und diese gezielte Plastizität ist hoch wirksam bei der Wiederherstellung der Funktion in verschiedenen Tiermodellen von Schlaganfall 9,10.
Allerdings verzögerte VNS geliefert 2 h nach rehabilitativen Trainings oder ein Mehrfaches größere Mengen von VNS führte zu vergleichsweise weniger Verbesserung als zeitgenaue VNS 51. Daher müssen weitere Studien, um sowohl die Zeitsteuerung und die Menge des VNS therapeutische Vorteile zu maximieren optimieren. Unsere Ergebnisse zeigen, dass VNS, die klinisch für die Behandlung von multiarzneimittelresistenten Epilepsie und behandlungsresistenter Depression zugelassen ist, könnte als Ergänzung der Behandlung, um die Exposition der Therapie verwendet werden, weil es moduliert Lernspezifische Plastizität um die Wirkung der Exposition auf die Auslöschung der erweitern Anlage Angst reagiert.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol | |||
| Atropine | Fisher | A0132-5G | |
| Betadine | Henry Schein | 69066950 | |
| Hydrogen peroxide | CVS | 209478 | |
| Ketamine | Henry Schein | 1129300 | |
| Marcaine | Henry Schein | 6312615 | |
| Mineral Oil | CVS | 152355 | |
| Neosporin | CVS | 629451 | |
| Oxygen | Home Depot | 304179 | |
| Pennicillin | Fisher | PENNA-10MU | |
| Propane | Home Depot | 304182 | |
| Xylazine | Henry Schein | 4019308 | |
| Tools | |||
| Jewelery Torch | Smith Equipment | 23-1001D | |
| Sewing Needle | Walgreens | 441831 | |
| #5 Forceps (2) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Soldering Iron | Home Depot | 203525863 | |
| AmScope SM-4TX-144A 3.5X-45X Circuit Board Boom Stereo Microscope + 144 LED | AmScope | SM-4TX-144A | |
| Helping Hands | A-M Systems | 726200 | |
| Scalpel Blade Holder | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Metal File | Home Depot | 6601 | |
| Ruler | Home Deopt | 202035324 | |
| Curved Hemostats | Fine Science Tools | 130009-12 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Spatula | Fine Science Tools | ||
| Small Screwdriver | Home Depot | 646507 | |
| Magnetic Fixator Retraction System | Fine Science Tools | 18200-04, 18200-01, 18200-05 | |
| Heating Pad | Walgreens | 30294 | |
| Clippers | Walgreens | 277966 | |
| Sharpie | Staples | 125328 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Custom Micropipette Glass Tools (J shape and Straight) - Borosilicate glass | Sutter Instrument | B150-110-10 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Cuffs | |||
| Tubing | Braintree Scientific Inc | MRE-065 | |
| Platinum Iridium Wire | Medwire | 10IR9/49T | |
| Gold Pins | Mill-Max | 1001-0-15-15-30-27-04-0 | |
| Suture Thread | Henry Schein | 100-5797 | |
| 22 G needles | Fisher | 14-815-525 | |
| Paper Tape | Fisher | 03-411-602 | |
| Solder | Home Depot | 327793 | |
| Flux | Home Depot | 300142 | |
| Scalpel Blade, 10 or 15 | Stoelting | 52173-10 | |
| Silastic Laboratory Tubing .51 mm ID x .94 mm OD | Fisher | 508-002 | |
| Headcaps | |||
| Connector Pieces (male) | Omnetics Connector Corporation | A25001-004 | |
| Headcap pieces (female) | Omnetics Connector Corporation | A24001-004 | |
| Teets Dental Acrylic, Liquid and Powder | A-M Systems | 525000, 526000 | |
| 26 Gauge Solid Copper Wire | Staples | 1016882 | |
| Surgery | |||
| Bone Screws | Stoelting+CB33:C61 | 51457 | |
| Scalpel Blades, 10 or 15 | Stoelting | 52173-10 | |
| 1 ml syringes | Fisher | 14-826-261 | |
| 22 G Needles | Fisher | 14-815-525 | |
| 27 G Needles | Fisher | 14-826-48 | |
| 2" x 2" Gauze | Fisher | 22-362-178 | |
| Swabs | Fisher | 19-120-472 | |
| Puppy Pads | PetCo | 1310747 | |
| Kim Wipes | Fisher | 06-666-A | |
| Chamber and Behavioral Setting | |||
| Husky Metal Front Base Cabinet (30WX19DX34H) | Home Depot | 100607961 | |
| Quiet Barrier HD Soundproofing Material (Sheet) (PSA) | soundproofcow.com | 10203041 | |
| Convoluted Acoustic Foam Panel | soundproofcow.com | 10432400 | |
| Isolated Pulse Stimulator Model 2100 | A-M Systems | 720000 | |
| Digital Camera - Logitech Webcam C210 | Logitech | B003LVZO88 | |
| MatLab | Mathworks.com | ||
| Sinometer 10 MHz Single Channel Oscilloscope | Sinometer | CQ5010C | |
| OxyLED T-01 DIY Stick-on Anywhere 4-LED Touch Tap Light | OXYLED | B00GD8OKY0 | |
| 5k ohm potentiomter | Alpha Electronics | B00CTWDHIO | |
| Extech 407730 40-to-130-Decibel Digital Sound Level Meter | Extech Instruments | B000EWY67W | |
| DSCK-C Dual Output, scrambled shocker | Kinder Scientific Co |
References
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