迷走神经刺激（VNS）已成为一种诱导前脑靶向突触可塑性以调节多种行为的工具。本方案描述了如何实施迷走神经刺激以促进恐惧消退记忆的巩固。
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本文内容
摘要
摘要
消退是指当原本维持某种行为的强化刺激不再出现时，个体对中性刺激的行为反应逐渐减弱的过程。恐惧与人类的焦虑密切相关，因此对消退学习的研究可能有助于揭示创伤后应激障碍等焦虑相关疾病的生物学本质，并为开发相应的治疗策略提供依据。临床前研究的目标是促进消退学习，并在消退相关神经环路中诱导靶向性的可塑性变化，以巩固新形成的消退记忆。迷走神经刺激（VNS）是一种有效的方法，能够实现时间精确且神经环路特异性的神经递质释放，从而调节参与当前任务的神经网络活动。VNS已在大鼠和人类中被证实可增强记忆巩固，将VNS与条件性刺激的暴露配对，可增强大鼠消退学习的记忆巩固。本文提供了用于大鼠VNS实验的定制部件制备及手术操作的详细方案。利用该方案，我们展示了VNS如何在听觉恐惧条件化任务中促进条件性恐惧反应的消退。此外，我们还提供了证据表明，VNS可调节内侧前额叶皮层下边缘区（IL）与杏仁核基底外侧复合体（BLA）之间通路的突触可塑性，该通路参与了消退记忆的表达与调控。
引言
经典恐惧条件反射为研究焦虑症的生物学基础提供了一种广泛使用的动物模型。在恐惧条件反射过程中，将一种厌恶刺激（非条件刺激，US，例如足底电击）与一种中性刺激（如声音和/或环境背景，即条件刺激；CS）配对呈现。在此过程中，CS 与 US 之间形成关联，最终仅呈现 CS 即可引发恐惧反应（条件反应；CR）。在恐惧消退过程中，CS 在没有 US 的情况下被反复呈现，导致 CR 逐渐减弱1。因此，条件性恐惧的消退是一个主动过程，当中性刺激不再预示厌恶结果时，对这些刺激产生的恐惧行为反应随之减弱。条件反应的消退需要新记忆的巩固，这些新记忆与已习得的关联相互竞争。焦虑症的一个显著特征是消退功能受损2-4。因此，动物模型中条件性恐惧的消退不仅为抑制性学习提供了重要范式，也为人类焦虑症的行为治疗提供了模型依据5,6。
由于恐惧与人类焦虑之间存在密切关联，人们认为这些研究有助于揭示与焦虑相关疾病（如创伤后应激障碍）的生物学本质，并有助于开发相应的治疗策略。临床前研究的一个重要目标是促进消退学习，并在消退相关神经环路中诱导靶向性可塑性，以巩固消退学习效果。迷走神经刺激（VNS）是一种微创性神经假体技术，可能用于对参与正在进行的任务的脑区和突触进行精确的时间控制和环路特异性调控。德克萨斯大学达拉斯分校Michael Kilgard团队近期开展的一系列研究表明，将VNS与特定的感觉或运动刺激配对使用（例如，
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方案
本方案中描述的所有操作均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》进行，并已获得德克萨斯大学达拉斯分校机构动物护理和使用委员会的批准。
1. VNS 套管的构建
- 用锯子将一根22½ G针头的尖端锯下，制成钻孔工具。
- 将此时已变钝的22½ G针头在金属锉上反复摩擦数次以使其端面平整。将针头以45º角抵住锉刀，并在来回摩擦的同时旋转针头，使金属变薄并向内卷曲。警告：将手术刀刀尖插入针头切割端内部，施加向下的力并旋转，以展开卷曲的金属。
- 第1节后续步骤需使用放大双目镜进行操作。
- 使用手术刀（10号或15号刀片）切割出长度为4 mm的管段。
- 将一段4 mm长的管子套在小型钻头或其他形状相似的工具上，以固定管子，便于后续操作。
- 在管子上钻出4个孔（图1A）。孔的位置应构成一个2 mm × 2 mm正方形的四个顶点，且孔边缘应整齐光滑，无毛刺。
注意：每钻2至3个孔后，需重新修锐钻孔工具（步骤1.2）。若此步骤操作困难，几乎可以确定是由于钻孔工具不够锋利所致。 - 保持管子套在钻头上的状态，使用手术刀沿管子纵向在孔之间切开，使两个孔位于切口的两侧（图1B）。
- 使用缝合针和缝线，将缝线穿过各孔，以构建用于最终将套管固定于迷走神经周围的系....
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结果
本部分展示了通过结合迷走神经刺激（VNS）与消退学习来降低大鼠条件性恐惧反应表达所能获得的结果示例。在第1天和第2天（听觉恐惧条件化），大鼠接受听觉恐惧条件化训练，期间将足底电击与声音刺激配对呈现。在第3天（治疗前测试），仅呈现声音刺激而不给予足底电击，以测量僵直水平并评估条件性恐惧反应的建立情况。在第4天（治疗日），大鼠接受分组特异性的消退训练和处理：4次声音刺激分别与VNS或假刺激配对；在扩展消退组中，则为20次声音刺激配以假刺激。在第5天再次测试大鼠对单独呈现4次条件刺激（CS）的僵直反应水平（治疗后测试）比较 时间线 图3A在消退阶段仅接受少量（4次）非强化条件性声音刺激的动物，在随后的恢复测试日仅表现出条件性恐惧反应的轻微减弱。图3B）。相比之下，经VNS治疗的大鼠在单次消退训练后表现出显著减少的僵直反应（图3B）。VNS处理动物的条件性恐惧反应降低程度与假手术处理动物在消退训练期间接受5倍非强化暴露（20次声音）时所观察到的降低程度相当（EE组）。 图3B）。利用上述特定实.......
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讨论
本文介绍了一种用于在单次暴露于条件性线索期间促进条件性恐惧消退，并调节介导消退学习的下边缘皮层与基底外侧杏仁核通路可塑性的实验方案1920。该方案成功的关键步骤是在消退训练期间准确地给予迷走神经刺激（VNS）。因此，必须特别注意套管电极的制作以及将其正确放置于迷走神经周围。在制作套管电极的过程中，应确保导线暴露部分的位置准确无误。同样，在手术过程中，需特别注意将套管准确放置在适当位置，并充分固定，以保证在整个实验过程中套管与刺激器之间的电路保持完整。手术后应检查套管功能是否正常（见步骤3.2.20），并在行为学测试结束后再次检查（见步骤4.8）。
迷走神经刺激（VNS）调节中枢神经系统活动的机制尚未完全阐明。颈部迷走神经主要由传入感觉纤维和传出运动纤维组成，其比例约为4:125。迷走神经传入纤维将信号传递至孤束核（NTS），后者进一步投射至臂旁核、下丘脑、丘脑、杏仁核和海马26,27。重要的是，脑干中的单胺类神经核团——蓝斑核（LC）和中缝核，接受来自NTS的直接和/或间接投射（.......
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披露
作者没有竞争利益或冲突。
致谢
本研究由美国国家心理健康研究所资助，项目编号 MH 086960-01A1（Christa K. McIntyre）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 酒精 | |||
| 阿托品 | Fisher | A0132-5G | |
| 聚维酮碘 | Henry Schein | 69066950 | |
| 过氧化氢 | CVS | 209478 | |
| 氯胺酮 | Henry Schein | 1129300 | |
| 布比卡因 | Henry Schein | 6312615 | |
| 矿物油 | CVS | 152355 | |
| 新孢霉素 | CVS | 629451 | |
| 氧气 | Home Depot | 304179 | |
| 青霉素 | Fisher | PENNA-10MU | |
| 丙烷 | Home Depot | 304182 | |
| 赛拉嗪 | Henry Schein | 4019308 | |
| 工具 | |||
| 珠宝喷枪 | Smith Equipment | 23-1001D | |
| 缝纫针 | Walgreens | 441831 | |
| #5 镊子（2个） | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| 电烙铁 | Home Depot | 203525863 | |
| AmScope SM-4TX-144A 3.5X-45X 电路板悬臂体视显微镜 + 144 LED | AmScope | SM-4TX-144A | |
| 辅助手架 | A-M Systems | 726200 | |
| 手术刀片夹持器 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| 金属锉刀 | Home Depot | 6601 | |
| 直尺 | Home Deopt | 202035324 | |
| 弯止血钳 | Fine Science Tools | 130009-12 | |
| 精细剪刀 | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| 刮勺 | Fine Science Tools | ||
| 小螺丝刀 | Home Depot | 646507 | |
| 磁性固定器牵开系统 | Fine Science Tools | 18200-04, 18200-01, 18200-05 | |
| 加热垫 | Walgreens | 30294 | |
| 电动剪毛器 | Walgreens | 277966 | |
| 记号笔（Sharpie） | Staples | 125328 | |
| 环形镊 | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| 定制玻璃微量移液管工具（J形和直形）— 硼硅酸盐玻璃 | Sutter Instrument | B150-110-10 | |
| 艾德森镊 | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| 套管 | |||
| 导管 | Braintree Scientific Inc | MRE-065 | |
| 铂铱合金导线 | Medwire | 10IR9/49T | |
| 金针 | Mill-Max | 1001-0-15-15-30-27-04-0 | |
| 缝合线 | Henry Schein | 100-5797 | |
| 22 G 针头 | Fisher | 14-815-525 | |
| 纸胶带 | Fisher | 03-411-602 | |
| 焊料 | Home Depot | 327793 | |
| 助焊剂 | Home Depot | 300142 | |
| 手术刀片，10 或 15 号 | Stoelting | 52173-10 | |
| 硅橡胶实验导管，内径 0.51 mm × 外径 0.94 mm | Fisher | 508-002 | |
| 头帽 | |||
| 连接器插头（公头） | Omnetics Connector Corporation | A25001-004 | |
| 头帽插孔（母头） | Omnetics Connector Corporation | A24001-004 | |
| Teets 牙科丙烯酸树脂，液体和粉末 | A-M Systems | 525000, 526000 | |
| 26 号实心铜导线 | Staples | 1016882 | |
| 手术 | |||
| 骨螺钉 | Stoelting+CB33:C61 | 51457 | |
| 手术刀片，10 或 15 号 | Stoelting | 52173-10 | |
| 1 ml 注射器 | Fisher | 14-826-261 | |
| 22 G 针头 | Fisher | 14-815-525 | |
| 27 G 针头 | Fisher | 14-826-48 | |
| 2" × 2" 纱布 | Fisher | 22-362-178 | |
| 棉签 | Fisher | 19-120-472 | |
| 宠物尿垫 | PetCo | 1310747 | |
| Kim Wipes 纸巾 | Fisher | 06-666-A | |
| 实验舱与行为测试环境 | |||
| Husky 金属前开门底柜（30英寸宽×19英寸深×34英寸高） | Home Depot | 100607961 | |
| Quiet Barrier HD 高性能隔音材料（板材）（压敏胶） | soundproofcow.com | 10203041 | |
| 波浪形声学泡沫板 | soundproofcow.com | 10432400 | |
| 隔离式脉冲刺激器 Model 2100 | A-M Systems | 720000 | |
| 数码相机 — Logitech Webcam C210 | Logitech | B003LVZO88 | |
| MatLab | Mathworks.com | ||
| Sinometer 10 MHz 单通道示波器 | Sinometer | CQ5010C | |
| OxyLED T-01 DIY 可粘贴四LED触摸式台灯 | OXYLED | B00GD8OKY0 | |
| 5k 欧姆电位器 | Alpha Electronics | B00CTWDHIO | |
| Extech 407730 40 至 130 分贝数字声级计 | Extech Instruments | B000EWY67W | |
| DSCK-C 双输出随机电击器 | Kinder Scientific Co |
参考文献
- Quirk, G. J., Mueller, D. Neural mechanisms of extinction learning and retrieval. Neuropsychopharmacol. 33 (1), 56-72 (1038).
- Milad, M. R., Orr, S. P., Lasko, N. B., Chang, Y., Rauch, S. L., Pitman, R. K. Presence and acquired origin of reduced recall ....
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