Summary
迷走神経刺激（VNS）は、行動の範囲を変更するには、前脳にターゲットを絞ったシナプス可塑性を誘導するためのツールとして浮上しています。このプロトコルは、恐怖の絶滅メモリの統合を容易にするためにVNSを実装する方法について説明します。
Introduction
古典的恐怖条件付けは、不安障害の生物学的基礎を研究するために広く使用されている動物モデルを提供します。恐怖条件付け、嫌悪刺激（無条件刺激、米国、 例えば、フットショック）中にこのようなトーンおよび/ またはコンテキスト（; CS条件刺激）として、中性刺激と一緒に提示されています。恐怖条件付けの間、CSと米国との間の関連が形成されています。最終的にはCSの提示だけでは恐怖反応（; CR条件反応）を誘発します。恐怖消去では、CSは、CRが徐々に1を減少させる、米国の非存在下で繰り返し提示されています。このように、条件付け恐怖の絶滅は、彼らはもはや嫌悪結果を予測する際、中性刺激に恐ろしい行動反応が減衰していないされているアクティブなプロセスです。馴化応答の消滅を学習団体と競合新しい思い出の統合を必要とします。不安障害の特徴はIMPAですIRED絶滅2-4。このように、動物モデルでの馴化恐怖の絶滅は、阻害学習と人間の不安障害5,6のための行動療法のモデルとしての両方の重要なパラダイムとして機能します。
恐怖と人間の不安との間に密接な対応があるので、これらの研究は、このような心的外傷後ストレス障害などの不安関連障害の生物学的性質への洞察を提供することができ、それらを扱うための戦略を開発するために役立つと考えられています。前臨床研究の重要な目標は、絶滅の学習を支援するために絶滅の学習を統合するために絶滅回路にターゲットを絞った可塑性を誘導することです。迷走神経刺激（VNS）の継続的な作業に従事した脳領域およびシナプスの緊密な時間的および回路固有の変調を提供するために使用されるかもしれない低侵襲neuroprostheticアプローチです。持っているテキサス大学ダラス校のMichael Kilgardのグループからの最近の一連の研究個別の感覚や運動刺激とその対VNSを示す（ 例えば、音やレバープル）が耳鳴り7を治療するため、または脳卒中8-10次の運動障害を克服するために皮質の可塑性を促進する上で非常に有効です。また、同様に、学習後の短い時間窓内で発生する非偶発VNS、皮質可塑性を促進し、ラットおよびヒト11-13でメモリの統合を強化します。
副交感神経経路における迷走神経の役割を考慮すると、それはメモリとシナプス可塑性の調節に関与することができることは驚くべきことではありません。非常に感情的なイベントは、非感情的な思い出よりも強い思い出を生成する傾向があります。これは、メモリの統合のストレスホルモンの影響に起因する可能性が高いです。ストレスホルモンのアドレナリンの訓練後の投与は、ヒトおよび非ヒト動物における記憶の固定を強化するが、アドレナリンは、15血液脳関門14を通過しません16は、アドレナリンの全身投与は迷走神経発火を増加し、扁桃体17にノルエピネフリンのレベルを増加させたことがわかりました。 βアドレナリン受容体は迷走神経が長期メモリに感情的に喚起する経験をオン経路の役割を果たしていることを示唆している扁桃体18にブロックされているときにアドレナリンの全身投与は、メモリの統合を強化していません。
このように、訓練をVNSをペアリングすると、ラット19,20における絶滅学習の統合を強化する補強材の存在しない状態で条件付け手がかりにメモリの統合と露出をサポートする脳の変化を強化する可能性を秘めています。ここでは、VNS Aの使用を記載していますSAツールは、皮質の可塑性を促進し、条件付け恐怖応答の消滅を容易にします。
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Protocol
このプロトコルで説明されているすべての手順は、実験動物の管理と使用に関するNIHガイドに従って実施されており、これらはテキサス大学ダラス校の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。
VNS袖口の1建設
- 22½G針の鋭い端をソーイングすることにより掘削ツールを作成します。
- 金属ファイルの上に平らに数回22½G針のようになりまし平滑末端を実行します。それを回転させながらファイルに45°の角度で針を保持し、ファイルにそれを数回実行します。これは、金属が内側に薄く、畳むになる場合があります。注意：針の切断端にメスの先端を挿入し、金属を広げるために、いくつかの下向きの力で回転します。
- セクション1の残りの手順のための拡大鏡、双眼鏡を使用してください。
- メス（10または15ブレード）を使用すると、チューブの4ミリメートルセグメントをカット。
- 上の1つの4mmセグメントを配置します小さなドリルビットまたは他の同様の形状のツール。これは、操作されている間、所定の位置にチューブを保持することです。
- チューブ（ 図1A）に4つの穴を開けます。穴は2mm角により2mmの4点を確認する必要があり、ノー荒削りできれいにする必要があります。
注：掘削工具は（ステップ1.2）ごとに2つまたは3つの穴resharpenedする必要があります。この手順で問題がほぼ確実に十分シャープではありません掘削工具に起因するものです。 - 二つの穴は、カット（ 図1B）のいずれかの側に終わるようにドリルビットにまだチューブを、穴の間に縦方向にチューブをカットするためにメスを使用しています。
- 縫い針と縫合糸を使用して、迷走神経の周囲にカフの最終的な配置のためにリギングを作成するための穴を通して縫合糸を渡します。カフ内の針を開始し、外部（ 図1C）から隣接する穴から戻って、穴の1つを介して、それを渡します。 threaを結びますDプラスチックから一緒に1〜2センチようにチューブとスレッドが三角形を作ります。結び目後のスレッドの~8センチ許可とトリム。カットの反対側の穴のためのプロセスを繰り返します。チューブは現在、有線する準備ができました。
- 袖口のためのワイヤを準備します。
- 70ミリメートルのセグメントにプラチナイリジウム線をカットします。
- ジュエリートーチのための最高のヒントを使用して、可能な限り洗練されて、ワイヤからプラスチックコーティングの〜1cmにストリップするためにそれを使用する青色の中心とシャープな炎を作成します。小さなボールを作成するために、ワイヤのむき出し部分に難の青い中心を適用します。一緒に7ストランドを融合するために剥離された部分のいくつかの点に難の青い中心を適用します。これらのスポットでワイヤがねじれるように見えます。
- 線の反対側の端に、小さなボールを作成するために、最後に難の青い中心を適用します。この端部にプラスチックを除去最小化します。
- カフ（ 図1D）をワイヤ。
注：スイートセクション1.10でPSは拡大双眼鏡の下で行われなければなりません。- テープそれはカットが水平に延びるように配向されるように、スレッドを使用してダウンカフ。カフがオープン引っ張られ、その後、糸を下にテープであるように、タイトなスレッドを引き出します。
- ＃5鉗子で準備された電線の被覆の側のボール状の端をつかみ、右下の穴から押してください。カフの真ん中にワイヤの端部を残して、穴から鉗子を引き出します。
- （現在カフの中央）ストリッピングワイヤのボール状端部を再把握し、右上の穴を通って、それを押してください。カフの上部側のカフとルーズを完全に渡されたワイヤーを残して、穴から鉗子を引き出します。
- （今トップ側のカフ外）むき線のボール状端部を再把握し、内側から右上の穴を通してそれを押し戻します。線の反対側の端に引っ張ることによって試験：ワイヤが所定の位置にしっかりするまで、そうすることを続行します。
注意：このプロセスの間には、ワイヤのストリッピング/絶縁部分を区別することが重要です。最終的には、カフの「谷」に配置されているワイヤが取り除かれなければならないが、（下端部にカフ外）底穴下のすべてが絶縁されなければなりません。これは、迷走神経への電流の供給を保証します。 - 絶縁側のボール状端をつかみ、カフの内側から右下の穴に差し込み、一度それを周りにループ。
- 2本のワイヤは、チューブ、右側に1左側の一方に固定してしまうように、カフの左側に1.10.5 - 、手順1.10.2を繰り返します。
- 穴を上に向けて援助の手の腕の中に金色のピンを配置します。フラックスで穴を埋めます。
- ピンに（今カフに取り付けられた）は、ワイヤの絶縁端を半田付けします。
- はんだを冷却し、再度それを溶融することを可能にします。これは、ワイヤの端部とIとの間の良好な接続を保証しますピンのnside。必要に応じてより多くのはんだを適用します。第2のワイヤのために繰り返します。
- リード線は右に実行して、恒久的なマーカーでカフの先頭をマークします。また、トップリードに取り付けられた金のピンをマーク。
VNS入力サイトのヘッドキャップの2建設
- 26 AWG銅線の30ミリメートルのセグメントをカットします。各端に小さな部分を取り除きます。
- 緩い金色のピンを狭い方の端をカットし、金のピンの切断端にワイヤのむき出し部分を半田付けします。各所望の入力サイトのための2つのワイヤ/ピン化合物を作成します。助けの手にコネクタを置き、コネクタ（ 図2G）の2フラックスの歯のそれぞれにワイヤ/ピン化合物のワイヤ端をはんだ付けします。
- シャーピーとワイヤのマーク1。手術中に、マークされていない配線に著しいワイヤ吻側でインプラントを配置します。
3. VNS手術
- vaguの処理のためのカスタムガラスツールを作成します。手術中の神経。
- それは長い先細り先端部を有するように、マイクロピペットを引くためにホウケイ酸ガラスを使用してください。全くピペットプラーを使用できない場合は、長辺を作成するために、ガラスを破ります。
- 厚手の布でピペットの非テーパー状の端部を保持する（やけどを防ぐために）とテーパ端に宝石トーチから青い炎を印加しながら、滑らかな耐火性の面にテーパー/切断端を押してください。それは、表面に押されているガラスが曲がります。フックやJ形状が形成されるまで炎を適用します。
- VNSの外科手術
- すべてのツールを収集し、滅菌します。衛生、加熱された手術領域を準備します。
- ケタミン/キシラジン（85 mgの/ kgを、5mgの/ kg、腹腔内）で動物を麻酔。つま先および/またはテールピンチに応答して動物の発声と離脱反射を監視することにより、麻酔面の深さを評価します。
- 動物の首の頭の上と左サイドを剃ります。鉱山労働者と動物の目を保護アル油または眼軟膏。剃毛領域にガーゼでアルコールその後、ヨウ素クレンジングガーゼを含む溶液とを適用します。一回繰り返します。
- 頭の上にマーカイン皮下0.05ミリリットルを注入し、定位固定装置に動物を配置しながらボーラスが分散することができます。
- ラムダとブレグマの両方を公開するために頭蓋骨の皮膚に切開を作るためにメスを使用してください。首の左側に耳の前の左側面を下に切開部位からトンネル皮下に鈍鉗子を使用して、カフのパスを準備します。
- 止血剤とのオープン切開部位を引き出します。綿棒を使用して、任意の残りの組織を除去するために露出頭蓋骨に過酸化水素を加えます。
- メスを用いて、アンカーのネジを配置する頭蓋骨に2浅いスターター穴を開ける。彼らは十分離れてインプラントのスペースを確保するために、配置されたが、周囲の組織に近づきすぎないようにする必要があります。正中線上に直接ネジを配置しないでください。
- 力でPS、ドライバーは、両方の穴に骨ネジをドライブ。アクリルネジの下や周囲に記入するためのスペースを確保するために、頭蓋骨の表面の上3mmの - ネジは、キャップ2と、穴にタイトにする必要があります。
- 周囲の組織を避け、周りに、およびアクリル少量のネジの間に、下のスペースを埋めます。そして、2本のネジの間の頭蓋骨の途中でアクリルを大量に配置します。
- マークされたワイヤがマークされていないワイヤに吻側に向け、迅速に金色のピン、クラスプエリア、または上の入力部位にアクリルを取得しないように注意しながら、アクリルでインプラントを配置されるようにインプラントをつかみます。一度乾燥するまで〜5分を設定することができ位置付け。これは、支援のために定位のアームを使用して行うことができます。アクリルの低粘度のブレンドとインプラントと頭蓋骨の間の任意の亀裂やギャップを埋めます。乾燥することができます。
- 3.2節の残りの手順のための拡大鏡、双眼鏡を使用してください。
- 目を削除定位固定装置から電子動物。腹の位置に向かってわずかに回転させる、その右側に動物を置きます。
- 左頸静脈で約小さな切開を行います。顎の骨や鎖骨を切開部位にほぼ等距離である必要があります。筋層に達するまで鈍的切開を使用して切開部を広げます。胸骨、胸骨舌骨、および肩甲舌骨筋が表示されるはずです。オープンサイトを維持するために、筋肉の開創を使用してください。
- 筋肉の自然畝に沿って鈍い解剖を続行します。頸動脈のパルスを探します。パルス化に向けて筋を通して見出しは、頸動脈を明らかにします。筋肉の開創と筋肉を引き戻します。頸動脈を含むシースはまた、迷走神経が含まれています。慎重にはさみでシースを解剖鈍ら。
- 迷走神経を識別します。これは、頸動脈鞘で最大の神経であり、動脈の動物の左側に通常しかし、いずれの側にあります。カスタムガラスツールに切り替えて、頸動脈から迷走神経を分離します。神経は、少なくとも5ミリメートルのための任意の他の組織があってはなりません。
- 頭の上に切開から、リード線の反対側にカフ側のスレッドを使用して、鉗子や小さな止血を使用して、以前に作られた皮下トンネルを通って袖口を引っ張ります。首に切開部位に組織を通って、それを押してください。
- 静かにガラス器具を使用して神経を持ち上げ、神経の下リード反対カフ側のスレッドを押してください。神経擦れないように注意しながら、すべての方法を介してスレッドを引き出します。カフは、神経のすぐ隣にあるべきです。
- カフは、優れたマーク「トップ」側に配向していることを確認します。カフの中央に神経をドロップします。神経は今カフ（ 図2B）の谷に両方のワイヤを跨ぐ必要があります。カフを閉じるために一緒にスレッドを接続します。
- ヘッドキャップに、刺激入力サイト上の金色のピンにカフに取り付けられたピンを差し込みます。シミュレーション入力サイト上のほとんどの前歯に取り付けられた金のピンにマークされたピンを差し込みます。
- カフが適切に迷走神経を刺激することを確認するには、ヘッドキャップに刺激入力部位に刺激を接続し、刺激（10秒まで0.2ミリアンペア、60ヘルツを）実行する、ことによって呼吸テストの停止を行います。呼吸は簡単に停止する必要がありますし、心拍数が低下する必要があり、カフの機能を検証します。
- アクリルで刺激入力サイト上のピンを固定します。配線をカバーし、露出したピンとワイヤがショートにつながらないことを確認します。任意のバンプを取り繕うために、または任意のギャップを埋めるためにアクリルを使用します。乾燥することができます。
- 縫合糸は、両方の切開部位を閉じました。首の切開部位に近い0.05ミリリットルマーカインを皮下に注入します。切開部位に抗生物質軟膏を適用します。必要に応じて、への刺激入力サイト上の所定の位置にオスコネクタを残します治癒過程中の損傷または閉塞を防止します。
- 抗生物質で治療し、適切な鎮痛を含む標準的な術後のケアに従ってください。彼らは移動性を取り戻した後、動物飼育施設に動物を返します。回復のための5日を許可します。実験の残りのために単独で、ヘッドキャップの最大の寿命と機能を確保家の動物に。
注：偽VNSラットは同じ手術を受ける、しかし回路はヘッドキャップのレベルで短いように設計されている（ すなわち、ヘッドキャップが注入され、迷走神経は、頸動脈から分離されているが、何の電極カフは、周囲に配置されていません神経）。
4.聴覚恐怖条件付け
注：これらの実験の目的は、絶滅を高めることであるため、この恐怖条件付けプロトコルは、21ほとんどのより集約的です。簡単に消滅する穏やかな恐怖条件付けで、床効果は、この拡張機能を不明瞭にすることができます。
- 2日連続のそれぞれに8トーンフットショック（1秒、0.5ミリアンペア）のペアとの最初のトーンのプレゼンテーションに従ってください。二日目に再びトーンフットショックのペアを繰り返します。すべての試験のために3分を平均し、2と4分の間に刺激間間隔（ISI）を変化させます。ショックが音の間に発生するポイントをランダム化します。
- stimulatoからオスコネクタを挿入することにより、刺激にラットを差し込み刺激入力部位にrをチャンバー（ 図2A、2C）に動物を配置します。 30 Hzで0.4ミリアンペア、500マイクロ秒のパルス幅に刺激を設定します。音の開始前に150ミリ秒を開始し、30.15秒の全持続時間に刺激を設定します。動物を（ステップ4.6のように）4トーンを再生し、VNSまたは偽VNSで各トーンのプレゼンテーションをペアリング。
- 通常通りに動物を接続し、オシロスコープに刺激からの出力を分割します。
- +20 V、-20 Vのようなオシロスコープの範囲を設定し、刺激を実行します。 30 Hzの刺激の波形をオシロスコープで表示されるはずです。サイズが10 Vを超える刺激は高インピーダンスになり、不適切に機能してカフ又は刺激入力サイトでの接続を示しています。
誘発フィールド電位のインビボレコーディング5.
注：このステップはオプションです。誘発電場電位（EFPの）は、標準的な手順23,24以下の定位固定装置に搭載されたイソフルラン麻酔したラットにおいて、復職の試験後24時間（5日目）に記録されています。
- すべてのツールを収集し、滅菌します。
- 透明なプラスチックチャンバー内のイソフルラン（5％、100％の酸素、流量1リットル/分）で麻酔を誘導します。つま先および/またはテールピンチに応答して動物の発声と離脱反射を監視することにより、麻酔面の深さを評価します。目を保護するために、鉱物油や眼軟膏を使用してください。
- 頭の上にマーカイン皮下0.05ミリリットルを注入し、ボーラスが分散することができます。頭蓋骨からヘッドキャップを除去するために、メスと止血剤を使用してください。ブレグマを曖昧にすることを避けるためにできるだけ力を使用してください。
- 定位固定装置に動物を置きます。ラムダとブレグマの両方を露出するように切開部を広げるためにメスを使用してください。ノーズコーンを介してイソフルラン（酸素100％で3％、流速1リットル/分）で麻酔面を維持します。
- infralimbic前頭前皮質（IL）と基底外側扁桃体（BLA）上記の頭蓋骨にドリル穴。とstimulat BLA（7.2、A / P：2.7、M / L 4.9ブレグマからD / V）に、ガラス微小電極（1-2メガオーム抵抗2MのKCl）を下げます内側前頭前皮質のIL領域へのイオン電極（D / V：4.6、A / P：3.0、M / L：ブレグマから0.7）（ 図4A）。
- BLAでのEFPを喚起するためにILを刺激します。 図4に示したデータは、以下の設定で取得された：最大フィールド応答を誘発最小電流強度の40％に相当する刺激強度を用いて、0.3ミリ秒の持続時間の刺激パルス（前に決定された入力-出力曲線に基づいて、ベースラインデータの収集）は、15秒毎に送達しました。
- シナプス可塑性を誘導する前に15分 - 10の最小のベースラインデータを収集します。
注：シナプス可塑性を誘発するために使用されるプロトコルは、実験の要件に応じて変化し、慎重に各実験者が選択する必要があります。 図4Cのデータは呼び起こす最小電流強度で20秒のバースト間の間隔で、50ヘルツ（2秒）で100パルスの3バーストを次のEFPの変化を示しています最大フィールド応答をdは。 - 電場電位の負のピークに対応し、刺激アーティファクト後25ミリ秒 - 刺激アーティファクトの前に5ミリ秒のウィンドウの平均および5ミリ秒の窓の平均約20の間の差としてEFPの振幅を測定します。ベースラインにデータを正規化し、100％と10分間のベースラインの平均値を設定します。 EFP振幅の長期的な変化を評価するために- （50分の誘導後例えば 40）可塑性の誘導後、別の10分期間の平均EFP振幅を使用してください。
- 録画終了後、麻酔した動物を刎ねると脳を抽出します。電極配置の組織学的検証のための組織を準備します。
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Representative Results
このセクションでは、ラットにおける条件付け恐怖応答の発現を減少させるために消光学習と組み合わせてVNSを用いることにより得ることができる結果の例を示します。 1日目及び2日目（聴覚恐怖条件付け）のために、ラットをfootshocksがトーンとペアにされた聴覚恐怖条件付け作業に訓練しました。 3日目（前処理試験）で、トーンが凍結レベルを測定し、条件付け恐怖反応の獲得を推測するfootshocksの非存在下で発表されました。 4日目（治療）のラットは、グループ固有の絶滅のトレーニングと治療を受け：4トーンのプレゼンテーションがVNSまたは偽刺激や、偽刺激と拡張消光群では、20トーンのプレゼンテーションのいずれかと対になりました。凍結のレベルだけではCS（ポスト処理試験）（ 図3AのCFタイムライン）の4プレゼンテーションに応じて5日目で再度試験しました。共に非強化暴露限られた数の（4）を受けた動物絶滅段階中のnditionedトーンは以下の復職日（ 図3B）に馴化恐怖でわずかな減少を示します。対照的に、VNS治療ラットは、単一吸光トレーニングセッション（ 図3B）後に凍結における有意な減少を実証します。 VNS処置動物の条件付け恐怖応答の減少量は、絶滅の訓練（ 図3BのグループEE）の間に非強化暴露（20階調）の5倍の量を受けた偽処置動物において見られるものに匹敵します。上記で概説特定の実験設定を使用して、VNSは、コンテキストに消滅を促進することができます。 図3Cに示すように、VNS動物はまた、絶滅の訓練は、コンテキストに一般化することを示唆し、空調音の提示外減少凍結挙動を示しました。また、絶滅の訓練とVNSをペアリングすると、経路betweにmetaplasticityを変化させることを示しています麻酔した動物でinfralimbic皮質（IL）と基底外側扁桃体（BLA）（ 図4）が備わっています。絶滅の訓練、BLAで誘発局所場のIL誘起さLTDの短いバースト刺激（HFS）（ 図4）を受けなかった恐怖馴化動物では。それらは単一消光セッション中に拡張消光トレーニングやVNSを与えられたかどうかは、このシナプスのうつ病は、条件付け恐怖の大絶滅を示す動物に逆転しました。拡張消光群の動物は、HFSの応答の変化を示さなかったが、消滅時VNSの投与は、LTPの誘導を促進しました。この結果は、4つトーン消光基で偽刺激された動物において観察されました。それは絶滅コンテキストで配信されたときに重要なのは、VNSは、ILとBLA間の経路における可塑性を変化させました。対照的に、VNSは、それらのホームケージに訓練を受けていない動物に送達synaptiに影響を及ぼさありませんでしたIL-BLA経路（ 図4B）におけるcの可塑性。
図1.迷走神経袖口の構築。安定性のためのドリルビットのチューブの4ミリメートル片の（A）の配置、チューブに穴をドリルするように変更針の使用を示す。（B）穴がなされていますチューブ、およびチューブは、カフの穴を通して縫合糸の真ん中。（C）の配置を削減されています。スレッドは、カフの唇を乗り越えていることに注意してください。袖口にプラチナイリジウム線の（D）挿入。トップショーは、配線を完了し、底部は、プロセス内の配線を示します。（E、F）のワイヤの端部に取り付けられた金のピンを備えた完成カフが。スケールのための（F）に挿入を参照してください。（G）Cを表示ステップ3に記載の手術中に頭蓋に取り付けますorrespondingヘッドキャップピースこの図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2迷走神経刺激及び実験設定。（A）迷走神経刺激（VNS）のために使用されるセットアップの概略図。動物は、2白金iridum線は迷走神経の周りに巻かれているカスタムメイドのカフ電極の皮下につながる、そこからヘッドキャップを介して刺激隔離ユニットに接続されている。迷走神経の周りのカフ電極の（B）の配置。カフ電極は、その周りに縫合される前に、外科的切開し、露出した迷走神経の顕微鏡写真。のために使用されたセットアップの（C）写真刺激に接続された動物と聴覚恐怖条件付け、。 （文献20から改変図）。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3. VNSは、聴覚恐怖条件の消滅を強化する。（A）実験のタイムライン。 1日目および2日目：聴覚恐怖条件付け、1日8トーン（CS）/ショックのペア（米国）。 3日目：4対になっていない音のプレゼンテーション中に測定し、凍結、恐怖のテスト前に馴化。 4日目：治療、3グループ：VNSと対をなす4音のプレゼンテーション、偽刺激と対をなす4音のプレゼンテーション、偽刺激（EE）と対になった20トーンのプレゼンテーション。 5日目：4不対トーンのプレゼンテーション中に測定し、凍結、恐怖のテストポストを馴化（B）。 （C）の割合（ITI）3日目（D3、白いバーにB. VNS動物で示された同じグループの）および5日目（D5）は、コンディショニングトーンのプレゼンテーション外の凍結挙動の低下を示しました。 （* p <0.05、エラーバーは平均の標準誤差を表します）。 （文献20から改変図）。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図4. VNSは、IL-BLA経路にmetaplasticityを変更します。（A）代表刺激およびILとBLAで記録サイトおよびILのBLA刺激後に記録された電場電位の入出力曲線の代表的なトレース。（Bラットの4つのグループでの短いバースト刺激に応答してIL-BLA経路における）シナプス可塑性。右上は：恐怖馴化したラットでは、ILの短いバースト刺激は、BLAにLTDを誘導します。左中央：偽刺激と4トーン絶滅の訓練を受けたラットはまた、LTDを示します。左下：偽刺激と拡張絶滅の訓練を受けたラットは何の変化、または恐怖条件付けのみのグループと偽刺激群で誘導された株式会社の回復を示していません。右中央：VNSで処置されたラットにおいて、単一の内線中inctionセッションは、シナプス強度はさらにLTPにつながる、増強されます。右下：VNSは、ホームケージでのお届けは、可塑性に変化はありません。略語：IL、infralimbic皮質。 PL、縁前方の皮質。 BLA、扁桃体の基底外側核、LA、扁桃体の外側核; CE、扁桃体の中心核。 （* p <0.05、エラーバーは平均の標準誤差を表します）。 （文献20から改変図）。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図5は迷走神経および2次以上の突起によって脳幹神経支配の概略を単純化した。青斑核（LC）と縫線nucle含む脳幹モノアミン核のその間接的調節を通じて、I（DRN）、迷走神経が重要前頭前皮質（PFC）を含む絶滅回路の構成要素、扁桃体（Amyg）、海馬（ヒップ）と側坐核（NAC）を調節することができる。 表示するにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版。
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Discussion
ここでは、馴化の合図への曝露19の単一のセッション中に馴化恐怖の絶滅を容易にし、infralimbic皮質および20の学習消滅を媒介することができる基底外側扁桃体との間の経路における可塑性を調節するために使用されるプロトコルを提示します。このプロトコルの成功のための重要なステップは、絶滅のトレーニング中VNSの適切な配信です。そのため、特別なケアは、カフ電極の構造及び迷走神経の周りのカフの配置に与えられるべきです。カフ電極の建設プロセスでは、配線の露出部分が正しい位置にあることを確認することが重要です。同様に、手術中に、特別な努力が適切な位置にカフを配置するとカフと刺激間の回路は、実験の過程で無傷のままであるような場所で十分にそれを固定するためになされるべきです。カフの適切な機能は、bの必要があります（ステップ4.8で概説されるように）行動試験後に再び（ステップ3.2.20に概説されるように）、eは、手術後にチェック。
VNSは、中枢神経系で活性を調節するを通じてメカニズムは完全には理解されていません。子宮頸部迷走神経は、それぞれ25、約4対1の割合で求心性感覚および遠心性運動線維で構成されています。迷走神経は、その後、核、視床、視床、扁桃体、および海馬26,27を parabrachialに突出孤束核（NTS）に信号を中継求心。重要なことは、脳幹におけるモノアミン核、青斑核（LC）と縫線核は、NTS（ 図5）からの直接および/ または間接的な投影を受けます。したがって、VNSは、複数の神経調節物質の相乗作用を介して皮質可塑性と記憶を調節することができます。迷走神経刺激に関連する提案の効果はにNTSからの突起によってノルエピネフリン（NE）のリリースの変更が含まれますLC、抑制性GABAのレベルの上昇、および網状システム起動28,29,30による異常な皮質活動の阻害。アセチルコリン、セロトニン、および脳由来神経栄養因子のための重要な役割はまた、31〜35が示されています。一般的には恐怖の思い出と絶滅の変調のために、送信機前頭前皮質（PFC）での放出、扁桃体、および海馬のVNSの効果は36,37特に関連する可能性があります。急性VNSは、内側PFC 33,38と扁桃体39,30の両方にノルエピネフリンおよびセロトニン放出を増加させます。急性VNSはまた、ノルエピネフリン38のレベルを増加させ、海馬40-42におけるシナプス伝達を向上させます。ノルエピネフリンは、以前に恐怖の発現の調節に関与することが示されています。前脳へのLCからNEの突起の病変はORIGの取得または保持を変更することなく、能動的回避の消滅を損ないますinal学習43,44。馴化恐怖の統合は、BLA 43内のβアドレナリン受容体の活性化に依存しており、いくつかの報告は、両方の薬物と恐怖絶滅のトレーニング46-49の記憶の中に内側PFCにおけるα-およびβアドレナリン受容体の両方の役割を示唆しています。 VNS、NEまたは5-HT様神経調節物質のVNS誘導性放出で絶滅のトレーニングをペアリングするときしたがって、絶滅の強化統合につながる、一人でトレーニングから生じるシナプス可塑性を促進するために表示されます。
VNSの主な利点は、その時間的、空間的特異性にあります。多くの場合、遅い発症を持っているし、アクションのオフセット全身あるいは局所薬物アプリケーションとは異なり、VNSは、選択対象の行動を規制これらのアクティブなネットワークにおけるシナプス可塑性を促進するために特定の動作と対にすることができます。ここではまた、下水処理のために臨床的に使用されるパラメータ使用VNSプロトコルを記述するヒトにおけるてんかんのNT（30 Hzで0.4ミリアンペア、500マイクロ秒のパルス幅、上の30秒と5分オフの刺激サイクル）。微小透析実験は、VNSは、これらのパラメータを使用する扁桃体39におけるNE放出の長期的な、ほぼ2倍の増加につながることを示しています。絶滅の訓練とペアにVNSは、それ自体で拡張された絶滅の訓練とは異なり、また、条件刺激の提示（試行間間隔）の外の挙動を凍結の消滅を促進する理由NEのこの大きく、比較的遅い増加が説明することができます。我々の実験で動物が聴覚恐怖条件と同じコンテキストに絶滅の訓練を受けたので、ITI中にすくみ行動の減少はVNSコンテキストに絶滅学習の一般化を容易にしたことを示しています。
しかし、NEリリースの潜在的長期的な影響にもかかわらず、動作やシナプス可塑性のVNSの効果は、それらがwがペアになっている場合にのみ明らかであり、特定の動作番目。彼らのホームケージでラットにVNSの応用恐怖絶滅の訓練は絶滅20を容易にしなかったすぐ後に 、同様に、VNSは、特定の行動文脈の外で適用されるが、IL-BLA経路におけるシナプス可塑性（CF 図3C）を変化させませんでした。それらが偶発配信されたとき一方、VNSのさえ短いアプリケーション（15パルスの列として例えば 、0.8ミリアンペア、500ミリ秒のための30 Hzで100マイクロ秒のパルス幅）は、感覚や運動のネットワーク内の特定および長期的な変化を引き起こします継続的な行動です。
マイケルKilgardのグループ7による精液の論文では、シングルトーンのプレゼンテーションとVNSの時間的に正確なペアリングはトーン周波数の聴覚皮質マップに可塑性につながることが示されました。これらの効果は、既に50耳鳴りを治療するための聴覚皮質における病理学的可塑性を逆に臨床的に使用されています。同様にモータの動作とVNSを繰り返し対は、運動皮質8を再編成することが示されており、この標的可塑性脳卒中9,10の異なる動物モデルにおける機能の回復に非常に有効です。
しかし、VNSは正確なタイミングVNS 51よりも比較的少ない改善をもたらしたリハビリトレーニングセッションやVNSの数倍多い量の後に2時間を配信遅延。このように、今後の研究では、タイミングや治療上の利点を最大化するためにVNSの量の両方を最適化する必要があります。我々の結果は、消滅の露光の効果を強化するために、学習固有の可塑性を調節するために臨床的に多剤耐性癲癇および治療抵抗性うつ病の治療のために承認されているVNSは、曝露療法の補助治療として使用することができることを示しています条件付け恐怖応答。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol | |||
| Atropine | Fisher | A0132-5G | |
| Betadine | Henry Schein | 69066950 | |
| Hydrogen peroxide | CVS | 209478 | |
| Ketamine | Henry Schein | 1129300 | |
| Marcaine | Henry Schein | 6312615 | |
| Mineral Oil | CVS | 152355 | |
| Neosporin | CVS | 629451 | |
| Oxygen | Home Depot | 304179 | |
| Pennicillin | Fisher | PENNA-10MU | |
| Propane | Home Depot | 304182 | |
| Xylazine | Henry Schein | 4019308 | |
| Tools | |||
| Jewelery Torch | Smith Equipment | 23-1001D | |
| Sewing Needle | Walgreens | 441831 | |
| #5 Forceps (2) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Soldering Iron | Home Depot | 203525863 | |
| AmScope SM-4TX-144A 3.5X-45X Circuit Board Boom Stereo Microscope + 144 LED | AmScope | SM-4TX-144A | |
| Helping Hands | A-M Systems | 726200 | |
| Scalpel Blade Holder | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Metal File | Home Depot | 6601 | |
| Ruler | Home Deopt | 202035324 | |
| Curved Hemostats | Fine Science Tools | 130009-12 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Spatula | Fine Science Tools | ||
| Small Screwdriver | Home Depot | 646507 | |
| Magnetic Fixator Retraction System | Fine Science Tools | 18200-04, 18200-01, 18200-05 | |
| Heating Pad | Walgreens | 30294 | |
| Clippers | Walgreens | 277966 | |
| Sharpie | Staples | 125328 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Custom Micropipette Glass Tools (J shape and Straight) - Borosilicate glass | Sutter Instrument | B150-110-10 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Cuffs | |||
| Tubing | Braintree Scientific Inc | MRE-065 | |
| Platinum Iridium Wire | Medwire | 10IR9/49T | |
| Gold Pins | Mill-Max | 1001-0-15-15-30-27-04-0 | |
| Suture Thread | Henry Schein | 100-5797 | |
| 22 G needles | Fisher | 14-815-525 | |
| Paper Tape | Fisher | 03-411-602 | |
| Solder | Home Depot | 327793 | |
| Flux | Home Depot | 300142 | |
| Scalpel Blade, 10 or 15 | Stoelting | 52173-10 | |
| Silastic Laboratory Tubing .51 mm ID x .94 mm OD | Fisher | 508-002 | |
| Headcaps | |||
| Connector Pieces (male) | Omnetics Connector Corporation | A25001-004 | |
| Headcap pieces (female) | Omnetics Connector Corporation | A24001-004 | |
| Teets Dental Acrylic, Liquid and Powder | A-M Systems | 525000, 526000 | |
| 26 Gauge Solid Copper Wire | Staples | 1016882 | |
| Surgery | |||
| Bone Screws | Stoelting+CB33:C61 | 51457 | |
| Scalpel Blades, 10 or 15 | Stoelting | 52173-10 | |
| 1 ml syringes | Fisher | 14-826-261 | |
| 22 G Needles | Fisher | 14-815-525 | |
| 27 G Needles | Fisher | 14-826-48 | |
| 2" x 2" Gauze | Fisher | 22-362-178 | |
| Swabs | Fisher | 19-120-472 | |
| Puppy Pads | PetCo | 1310747 | |
| Kim Wipes | Fisher | 06-666-A | |
| Chamber and Behavioral Setting | |||
| Husky Metal Front Base Cabinet (30WX19DX34H) | Home Depot | 100607961 | |
| Quiet Barrier HD Soundproofing Material (Sheet) (PSA) | soundproofcow.com | 10203041 | |
| Convoluted Acoustic Foam Panel | soundproofcow.com | 10432400 | |
| Isolated Pulse Stimulator Model 2100 | A-M Systems | 720000 | |
| Digital Camera - Logitech Webcam C210 | Logitech | B003LVZO88 | |
| MatLab | Mathworks.com | ||
| Sinometer 10 MHz Single Channel Oscilloscope | Sinometer | CQ5010C | |
| OxyLED T-01 DIY Stick-on Anywhere 4-LED Touch Tap Light | OXYLED | B00GD8OKY0 | |
| 5k ohm potentiomter | Alpha Electronics | B00CTWDHIO | |
| Extech 407730 40-to-130-Decibel Digital Sound Level Meter | Extech Instruments | B000EWY67W | |
| DSCK-C Dual Output, scrambled shocker | Kinder Scientific Co |
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