Summary
La estimulación del nervio vago (VNS) se ha convertido en una herramienta para inducir plasticidad sináptica específica en el cerebro anterior para modificar una serie de comportamientos. Este protocolo describe cómo implementar VNS para facilitar la consolidación de la memoria miedo extinción.
Introduction
Clásica miedo acondicionado proporciona un modelo animal ampliamente utilizado para estudiar las bases biológicas de los trastornos de ansiedad. Durante el condicionamiento del miedo, un estímulo aversivo (el estímulo no condicionado, Estados Unidos, por ejemplo, una descarga en las patas) se presenta en conjunción con un estímulo neutro, tal como un tono y / o un contexto (el estímulo condicionado; CS). Durante el condicionamiento del miedo, se forman asociaciones entre el CS y los EE.UU.. Finalmente, la presentación de la CS solo provoca una respuesta de miedo (la respuesta condicionada; CR). En el miedo extinción, el CS se presenta repetidamente en ausencia de los EE.UU., haciendo que el CR para disminuir gradualmente 1. Por lo tanto, la extinción del miedo condicionado es un proceso activo en el que se atenúan las respuestas de comportamiento de miedo a los estímulos neutros cuando ya no predicen resultados aversivos. La extinción de las respuestas condicionadas requiere consolidación de nuevos recuerdos que compiten con las asociaciones aprendidas. Una característica distintiva de los trastornos de ansiedad es impaextinción ired 2-4. Por lo tanto, la extinción del miedo condicionado en modelos animales sirve como un paradigma importante tanto para el aprendizaje inhibitorio y como un modelo de terapia de comportamiento para los trastornos de ansiedad humanos 5,6.
Debido a que existe una estrecha correspondencia entre el miedo y la ansiedad humana, se cree que estos estudios pueden dar una idea de la naturaleza biológica de los trastornos relacionados con la ansiedad, como el trastorno de estrés post-traumático y ayudarán a desarrollar estrategias para tratarlas. Un objetivo importante de la investigación preclínica es para ayudar a la extinción de aprendizaje e inducir plasticidad específica en los circuitos de extinción para consolidar el aprendizaje extinción. Estimulación del nervio vago (VNS) es un enfoque neuroprosthetic mínimamente invasiva que podría utilizarse para proporcionar modulación temporal y específica de circuito apretado de las áreas del cerebro y las sinapsis que participan en una tarea en curso. Una serie de estudios recientes del grupo de Michael Kilgard en la Universidad de Texas en Dallas tienense muestra que el apareamiento VNS con estímulos sensoriales o motoras discretas (por ejemplo, un tono o un tirón de la palanca) es altamente eficaz en la promoción de plasticidad cortical para tratar el tinnitus 7, o para superar los déficits motores después del accidente cerebrovascular 8-10. Además, no contingente VNS que ocurre dentro de una corta ventana de tiempo después de aprender promueve igualmente la plasticidad cortical y mejora la consolidación de la memoria en ratas y en humanos 11-13.
Teniendo en cuenta el papel del nervio vago en la vía parasimpático, no es sorprendente que podría participar en la modulación de las memorias y la plasticidad sináptica. Eventos emocionales altamente tienden a producir recuerdos más fuertes que los recuerdos no emocionales. Esto es probablemente debido a la influencia de las hormonas del estrés en la consolidación de la memoria. Post-entrenamiento la administración de la hormona del estrés adrenalina aumenta consolidación de la memoria en los animales humanos y no humanos, pero la adrenalina no cruza la barrera sangre-cerebro-barrera 14, 15 16 encontraron que la administración sistémica de adrenalina aumentó de tiro del nervio vago, y el aumento de los niveles de norepinefrina en la amígdala 17. La administración sistémica de adrenalina no mejora la consolidación de la memoria cuando los receptores β-adrenérgicos están bloqueados en la amígdala 18 lo que sugiere que el nervio vago juega un papel en la vía que convierte experiencias excitantes emocionalmente en recuerdos a largo plazo.
Por lo tanto, la vinculación VNS con el entrenamiento tiene el potencial para mejorar los cambios cerebrales que apoyan la consolidación de la memoria y la exposición a las señales condicionadas en ausencia de refuerzo aumenta la consolidación del aprendizaje de la extinción en ratas 19,20. Aquí se describe el uso de un VNSsa herramienta para promover la plasticidad cortical y facilitar la extinción de una respuesta de miedo condicionado.
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Protocol
Todos los procedimientos descritos en este protocolo se llevan a cabo de conformidad con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, y que fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Texas en Dallas.
1. Construcción de VNS Puños
- Crear una herramienta de perforación por cortar la punta de una aguja de 22 G ½.
- Ejecute el final ahora romo de la aguja de 22 G ½ sobre un archivo de metal varias veces para aplanarlo. Mantenga la aguja en un ángulo de 45º en el fichero y ejecutarlo varias veces en el archivo mientras gira. Esto hará que el metal se convierta en más delgado y furl hacia adentro. PRECAUCIÓN: Inserte la punta del bisturí en el extremo cortado de la aguja y girar con un poco de fuerza hacia abajo para desplegar el metal.
- Use binoculares de aumento para los pasos restantes de la sección 1.
- Usando un bisturí (10 o 15 de la cuchilla) cortar segmentos de 4 mm de tubo.
- Coloque un segmento de 4 mm sobre unapequeña broca u otra herramienta de forma similar. Esto es para mantener el tubo en su lugar mientras está siendo manipulado.
- Perforar 4 agujeros en el tubo (Figura 1A). Los agujeros deben hacer los cuatro puntos a 2 mm por 2 mm de lado y deben estar limpias y sin asperezas.
NOTA: La herramienta de perforación necesita ser afiladas (paso 1.2) cada 2 o 3 agujeros. Dificultad con este paso es casi seguro que debido a una herramienta de perforación que no es lo suficientemente fuerte. - Con el tubo todavía en la broca, utilizar un bisturí para cortar el tubo longitudinalmente entre los agujeros de modo que dos agujeros terminan a ambos lados del corte (Figura 1B).
- Utilizando una aguja de coser e hilo de sutura, pasar la sutura a través de los agujeros para crear el aparejo para la colocación definitiva de la banda alrededor del nervio vago. Comience con la aguja en el interior del manguito y pasarlo a través de uno de los agujeros, y luego volver a través del agujero adyacente desde el exterior (Figura 1C). Ate el thread juntos ~ 2 cm desde el plástico de modo que el tubo y el hilo de hacer un triángulo. Permitir ~ 8 cm de hilo después de que el nudo y el asiento. Repita el proceso para los orificios en el lado opuesto del corte. El tubo está ahora listo para ser conectado.
- Prepare los cables de los puños.
- Cortar el alambre de platino iridio en segmentos de 70 mm.
- Utilizando el mejor consejo para la antorcha de la joyería, crear una llama fuerte con azul de centro que es tan refinada como sea posible y lo utilizan para despojar ~ 1 cm del revestimiento plástico del alambre. Aplicar el centro azul de la llama al extremo pelado del cable para crear una pequeña bola. Aplicar el centro azul de la llama a varios puntos de la parte desnuda de fusionar los siete hilos juntos. El cable en estos lugares se parecen doblar.
- En el extremo opuesto del cable, aplicar el centro azul de la llama hasta el final para crear una pequeña bola. Minimizar separar el plástico en este extremo.
- Conectar el manguito (Figura 1D).
NOTA: Steps en la sección 1.10 debe hacerse bajo los prismáticos de aumento.- Tape el manguito hacia abajo usando los hilos de manera que se orienta con el corte corriendo horizontalmente. Tire de los hilos apretados para que el brazalete se abrió y luego con cinta adhesiva por las roscas.
- Sujete el extremo balled del lado pelado del cable preparado con # 5 pinzas y empujar a través del orificio inferior derecha. Tire de las pinzas fuera del agujero, dejando el extremo del alambre en el medio del manguito.
- Vuelva a captar el final balled del cable pelado (ahora en el centro del manguito) y empujarlo a través del agujero superior derecha. Tire de las pinzas fuera del agujero, dejando el alambre pasa completamente a través del manguito y suelta en el lado superior del manguito.
- Vuelva a captar el final balled del cable pelado (ahora fuera del manguito en la parte superior) y empuje de nuevo a través del orificio superior derecha de la parte interior. Continúa haciéndolo hasta que el cable esté firmemente en su lugar: prueba tirando en el extremo opuesto del cable.
NOTA:Durante este proceso es crítico para diferenciar las porciones aisladas / pelados del alambre. El alambre que se coloca en última instancia en el "canal 'del manguito debe ser despojado, pero todo por debajo de los orificios inferiores (fuera del manguito en el extremo inferior) debe estar aislado. Esto asegura el suministro de corriente sólo para el nervio vago. - Sujete el extremo balled del lado aislado y empujarlo a través del agujero de la parte inferior derecha de la parte interior del manguito, enrollarlo alrededor de una vez.
- Repita los pasos 1.10.2 - 1.10.5 en el lado izquierdo del manguito de manera que dos alambres terminan fijado a la tubería, uno en el lado derecho y otro en el lado izquierdo.
- Coloque un alfiler de oro en el brazo de la mano con el agujero hacia arriba. Llene el agujero con fundente.
- Suelda el extremo aislado del alambre (ahora unido al manguito) en el pasador.
- Permita que la soldadura se enfríe, y luego se funden de nuevo. Esto asegura una buena conexión entre el extremo del alambre y el inside del pasador. Aplicar más de soldadura si es necesario. Repita para el segundo alambre.
- Con los cables corriendo hacia la derecha, marque la parte superior del manguito con marcador permanente. También marcará el broche de oro unido a la iniciativa parte superior.
2. Construcción de casquete de VNS Sitio entrada
- Cortar 30 segmentos de 26 mm de alambre de cobre AWG. Franja de una pequeña porción en cada extremo.
- Corte el extremo estrecho de alfileres de oro sueltos y soldar el extremo pelado del cable al extremo del corte de la espiga de oro. Cree dos compuestos alambre / pin para cada sitio de entrada deseada. Coloque un conector en las manos que ayudan y soldar el extremo del cable de un compuesto de alambre / pin a la cada uno de los dos dientes fundente del conector (Figura 2G).
- Marque uno de los cables con Sharpie. Durante la cirugía, colocar el implante con el rostral alambre marcado al cable sin marcar.
3. VNS Cirugía
- Crear herramientas de vidrio personalizada para manejo de Vagus nervio durante la cirugía.
- Utilice vidrio borosilicato para tirar de una micropipeta para que tenga una punta larga cónica. Si no extractor de pipeta está disponible, romper el vidrio para crear un borde más largo.
- Mantenga el extremo no ahusada de la pipeta con un paño grueso (para evitar quemaduras) y presione el extremo cónico / roto en una superficie resistente al fuego suave, mientras que la aplicación de la llama azul de la antorcha de la joyería para el extremo cónico. El vidrio se dobla ya que se presiona en la superficie. Aplicar la llama hasta que un gancho o formas forma J.
- Procedimientos quirúrgicos VNS
- Reunir y esterilizar todas las herramientas. Prepare un área quirúrgica sanitaria, calefacción.
- Anestesiar los animales con ketamina / xilazina (85 mg / kg, 5 mg / kg, IP). Evaluar la profundidad del plano anestésico mediante la supervisión de las vocalizaciones de los animales y de abstinencia-reflejos en respuesta a los pies y / o pellizcos cola.
- Afeitarse la parte superior de la cabeza y el lado izquierdo del cuello del animal. Proteja los ojos del animal con la mineraaceite o ungüento al ojo. Aplique una solución de yodo de limpieza con una gasa y luego alcohol con una gasa para las áreas afeitadas. Repita una vez.
- Inyectar 0,05 ml marcaına por vía subcutánea en la parte superior de la cabeza y permitir que el bolo para dispersar mientras que la colocación del animal en el instrumento estereotáxico.
- Utilice un bisturí para realizar una incisión en la piel sobre el cráneo para exponer tanto lambda y bregma. Preparar el camino para el manguito utilizando fórceps romos para subcutáneamente túnel desde el lugar de la incisión en el lado izquierdo en la parte delantera de la oreja en el lado izquierdo del cuello.
- Tire de la zona de la incisión abierta con pinzas hemostáticas. El uso de hisopos de algodón, aplique peróxido de hidrógeno en el cráneo expuesto a eliminar cualquier tejido restante.
- El uso de un bisturí, perforar dos agujeros de arranque poco profundas en el cráneo para colocar tornillos de anclaje. Deben colocarse lo suficientemente separados para dejar espacio para el implante, pero no demasiado cerca de los tejidos circundantes. Evite colocar tornillos directamente en la línea media.
- Con la fuerzaps y un destornillador, conducir un tornillo de hueso en los dos agujeros. Los tornillos deben estar apretados en los agujeros, con las tapas de 2-3 mm por encima de la superficie del cráneo para dejar espacio para el acrílico para rellenar debajo y alrededor de los tornillos.
- Llenar el espacio debajo, alrededor y entre los tornillos con una pequeña cantidad de acrílico, evitando el tejido circundante. A continuación, colocar una mayor cantidad de acrílico en el medio del cráneo entre los dos tornillos.
- Coge el implante de modo que el cable marcado está orientado rostral al cable sin marcar y colocar rápidamente el implante en el acrílico, teniendo cuidado de no obtener acrílico en los pines de oro, la zona del corchete, o en el sitio de entrada en la parte superior. Una vez colocado dejar solidificar ~ 5 min hasta que se seque. Esto también se puede hacer usando el brazo de la estereotáxico para el apoyo. Rellene las grietas o huecos entre el implante y el cráneo con una baja viscosidad de la mezcla de acrílico. Deje que se seque.
- Use binoculares de aumento para los pasos restantes de la sección 3.2.
- Retire ªe animales desde el instrumento estereotáxico. Colocar el animal sobre su lado derecho, girando ligeramente hacia la posición ventral.
- Hacer una pequeña incisión aproximadamente sobre la vena yugular izquierda. El hueso de la mandíbula y la clavícula deben ser más o menos la misma distancia a la zona de la incisión. Ampliar la incisión utilizando disección roma hasta que se alcance la capa muscular. Los esternocleidomastoideo, esternohioideo y omohioideo músculos deben ser visibles. Use retractores músculo para mantener el sitio libre.
- Continuar disección roma lo largo de los surcos naturales entre los músculos. Busque el pulso de la arteria carótida. La partida a través del músculo hacia el pulsante revelará la arteria carótida. Tire de los músculos de la espalda con el retractor muscular. La vaina que contiene la arteria carótida también contiene el nervio vago. Cuidadosamente embotar diseccionar la vaina con las tijeras.
- Identifique el nervio vago. Es el nervio más grande en la vaina carotídea y es por lo general hacia el lado del animal izquierda de la arteriapero se puede encontrar en cualquier lado. Cambie a las herramientas de cristal de encargo y separar el nervio vago de la arteria carótida. El nervio debe estar libre de cualquier otro tejido durante al menos 5 mm.
- A partir de la incisión en la cabeza, utilizando los hilos en el lado opuesto del manguito de los cables, tire del manguito a través del túnel subcutáneo previamente hecha con fórceps o pinzas hemostáticas pequeñas. Empujarlo a través del tejido en el sitio de la incisión en el cuello.
- Levante con cuidado el nervio usando las herramientas de vidrio y empujar los hilos en el lado del manguito opuesta los cables bajo el nervio. Tire de los hilos hasta el final, con cuidado de no rozar el nervio. El manguito debe ser inmediatamente adyacente al nervio.
- Asegúrese de que el brazalete está orientado con el lado marcado 'top' superior. La caída de la nervio en el centro del manguito. El nervio ahora debe mentir a través de ambos cables en el canal del manguito (Figura 2B). Ate los hilos juntos para cerrar el puño.
- En el casquete, conecte los pernos fijados al manguito en los pines de oro en el sitio de entrada de la estimulación. Conecte la clavija marcada en el broche de oro unido al diente más anterior en el sitio de entrada de simulación.
- Para verificar que el manguito estimula adecuadamente el nervio vago, realizar una interrupción de la respiración de prueba por, que conecta el estimulador para el sitio de entrada de la estimulación en el headcap y funcionando estimulación (0,2 mA, 60 Hz, hasta 10 segundos). La respiración debe detenerse brevemente y de la frecuencia cardíaca debe caer, la verificación de la función del manguito.
- Asegure los pasadores en el sitio de entrada de la estimulación con acrílico. Cubra los cables y verifique que los pernos y cables expuestos no conducen a cortocircuitos. Utilice acrílico para suavizar las irregularidades o para llenar los vacíos. Deje que se seque.
- Sutura cerrada ambos sitios de incisión. Inyectar 0,05 ml por vía subcutánea marcaına cerca del sitio de la incisión del cuello. Aplique ungüento antibiótico a la incisión sitios. Opcionalmente, deje un conector macho en su lugar en el sitio de entrada a la estimulaciónevitar daños o la obstrucción durante el proceso de curación.
- Se trata con antibióticos y siga el cuidado post-operatorio estándar, incluyendo la analgesia adecuada. Vuelta de los animales a las instalaciones de alojamiento de los animales después de recuperar la movilidad. Permita 5 días de recuperación. Para asegurar la longevidad máxima y la función de la headcap, animales de casa individualmente para el resto del experimento.
NOTA: ratas Sham-VNS se someten a la misma cirugía, sin embargo, el circuito está diseñado para corto a nivel de la headcap (es decir, un headcap se implanta y el nervio vago se separa de la arteria carótida, pero no del manguito de electrodo se coloca alrededor de la nervio).
4. auditivo miedo acondicionado
NOTA: Este protocolo acondicionado temor es más intensa que la mayoría 21 porque el objetivo de estos experimentos es para mejorar la extinción. Con leves condicionamiento del miedo que se extingue fácilmente, un efecto suelo puede ocultar esta mejora.
- Siga las presentaciones de tono iniciales con 8 tonos-descarga en las patas (1 seg, 0,5 mA) emparejamientos en cada uno de 2 días consecutivos. Repita los emparejamientos tono estímulo eléctrico plantar de nuevo en el segundo día. Varíe la-estímulo-intervalo entre (ISI) entre 2 y 4 minutos, con un promedio de 3 minutos para cada prueba. Aleatorizar el punto en el que se produce el choque durante el tono.
- Conecte las ratas en el estimulador mediante la inserción de los conectores macho de la stimulatoR en el sitio de entrada de estimulación. Coloque los animales en la cámara (Figura 2A, 2C). Ajuste el estimulador a 0,4 mA, 500 mu s de ancho de pulso a 30 Hz. Establecer estimulación para una duración total de 30,15 seg, comenzando 150 mseg antes de la aparición del tono. Juega animales 4 tonos (como en el paso 4.6) y vincular cada presentación tono con VNS o Sham VNS.
- Enchufe el animal en como normal y dividir la salida del estimulador para el osciloscopio.
- Ajuste el rango en el osciloscopio como -20 V a +20 V y ejecutar la estimulación. La forma de onda de la estimulación de 30 Hz debe ser visible en el osciloscopio. Estímulos que superen los 10 V de tamaño indican una alta impedancia y un manguito mal funcionamiento o conexión en el lugar de entrada de la estimulación.
5. En Vivo Grabaciones de potenciales evocados de campo
Nota: Este paso es opcional. Potenciales evocados de campo (EFP) se registran 24 horas después de las pruebas de restauración (día 5) en ratas anestesiadas con isoflurano montados en un aparato estereotáxico, siguiendo procedimientos estándar 23,24.
- Reunir y esterilizar todas las herramientas.
- Inducir la anestesia con isoflurano (5% en el 100% de oxígeno, caudal 1l / min) en una cámara de plástico transparente. Evaluar la profundidad del plano anestésico mediante la supervisión de las vocalizaciones de los animales y de abstinencia-reflejos en respuesta a los pies y / o pellizcos cola. Utilice aceite mineral o ungüento para los ojos para proteger los ojos.
- Inyectar 0,05 ml marcaına subcutánea en la parte superior de la cabeza y deje que el bolo se disperse. Utilice un bisturí y pinzas para quitar el casquete del cráneo. Utilice la menor fuerza posible para evitar oscurecer bregma.
- Colocar el animal en el instrumento estereotáxico. Utilice un bisturí para ampliar la incisión para exponer tanto lambda y bregma. Mantener plano anestésico con isoflurano (3% en oxígeno al 100%, caudal de 1 L / min) a través de un cono de nariz.
- Perforar los agujeros en el cráneo por encima de la corteza prefrontal infralímbica (IL) y la amígdala basolateral (BLA). Baje unos microelectrodos de vidrio (2 M KCl; 1.2 MOhms de resistencia) en el BLA (D / V: 7.2, A / P: 2,7, M / L: 4.9 de bregma) y una estimion electrodo en la región de IL de la corteza prefrontal medial (D / V: 4,6, A / P: 3,0, M / L: 0,7 de bregma) (Figura 4A).
- Estimular la IL evocar EFP en el BLA. Los datos mostrados en la Figura 4 se adquirieron con los siguientes ajustes: Un impulso de estimulación de 0,3 mseg de duración, utilizando una intensidad de estimulación que correspondió a 40% de la intensidad de la corriente mínima que evoca una respuesta de campo máxima (basan en una curva de entrada-salida determinado antes recopilación de datos de línea de base), entregado cada 15 seg.
- Recoger datos de referencia para un mínimo de 10 a 15 minutos antes de la inducción de la plasticidad sináptica.
NOTA: El protocolo utilizado para evocar la plasticidad sináptica variará con los requisitos de los experimentos y se debe seleccionar cuidadosamente por cada experimentador. Los datos en la Figura 4C muestra los cambios en la EFP siguiente 3 ráfagas de 100 pulsos a 50 Hz (2 seg), con intervalos entre ráfagas 20 segundos a la intensidad de corriente mínimo que evocand la respuesta de campo máxima. - Medir la amplitud de la EFP como la diferencia entre la media de una ventana de 5 mseg antes de que el artefacto de estimulación y la media de una ventana de 5 mseg alrededor de 20 - 25 mseg después de la estimulación artefacto, que corresponde al pico negativo del potencial de campo. Normalizar los datos a la línea de base y establecer el promedio de una línea de base 10 min como 100%. Utilice las amplitudes EFP promediados de otro período de 10 minutos después de la inducción de plasticidad (por ejemplo, 40 - 50 min después de la inducción) para evaluar los cambios a largo plazo en EFP amplitud.
- Después del final de la grabación decapitar al animal anestesiado y extraer el cerebro. Preparar tejido para la verificación histológica de colocación de los electrodos.
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Representative Results
Esta sección ilustra ejemplos de los resultados que se pueden obtener mediante el uso de VNS en combinación con aprendizaje de la extinción para reducir la expresión de la respuesta de miedo condicionado en ratas. Para los días 1 y 2 (auditivo miedo acondicionado), las ratas fueron entrenadas en una tarea auditiva condicionamiento del miedo en el que estímulo eléctrico plantar se emparejaron con un tono. En el Día 3 (Test Tratamiento Pre), los tonos se presentaron en ausencia de estímulo eléctrico plantar para medir los niveles de congelación y inferir adquisición respuesta de miedo condicionado. El día 4 (Tratamiento) ratas recibieron entrenamiento de extinción específico de grupo y el tratamiento: 4 presentaciones de tono se emparejaron con cualquiera VNS o simulacro de estimulación o, en el grupo de extinción extendida, presentaciones de 20 tonos con simulacro de estimulación. Niveles de congelación se probaron de nuevo en el Día 5 en respuesta a las 4 presentaciones de hablar de la CS (prueba Tratamiento Post) (línea de tiempo cf en la figura 3A). Los animales que recibieron un número limitado (4) de las exposiciones no reforzadas a la cotono nditioned durante la fase de extinción muestran sólo una pequeña reducción en el miedo condicionado en el siguiente día reincorporación (Figura 3B). En contraste, las ratas tratadas con VNS demuestran una reducción significativa en la congelación después de una sola sesión de entrenamiento de extinción (Figura 3B). El importe de la reducción en la respuesta de miedo condicionado de los animales tratados con VNS es comparable a la observada en los animales tratados con placebo que recibieron 5 veces el importe de las exposiciones no reforzadas (20 tonos) durante el entrenamiento de extinción (grupo de EE en la figura 3B). Uso de la configuración experimental específica señalado anteriormente, VNS también puede facilitar la extinción con el contexto. Como se muestra en la Figura 3C, VNS animales también mostraron una reducción en el comportamiento de congelación fuera de la presentación del tono acondicionado, lo que sugiere que su formación extinción también generalizarse para el contexto. También mostramos que el emparejamiento de la ENV con el entrenamiento de extinción altera la metaplasticidad en el betwe víaen la corteza infralimbic (IL) y la amígdala basolateral (BLA) en animales anestesiados (Figura 4). En los animales el miedo acondicionado, que no se sometieron a entrenamiento de extinción, la estimulación breve ráfaga (HFS) del LTD IL inducida del campo local, evocado en el BLA (Figura 4). Ya sea que se les dio entrenamiento de extinción extendida o VNS durante una sola sesión de extinción, esta depresión sináptica se invirtió en los animales que exhiben extinción significativa del miedo condicionado; Sin embargo, la administración de VNS durante la extinción promovió la inducción de LTP mientras que los animales en el grupo de extinción extendida no mostraron ningún cambio en respuesta a HFS. Este resultado también se observó en los animales que fueron estimuladas simulada en el grupo de extinción de cuatro tonos. Es importante destacar que la ENV sólo se alteró la plasticidad en la vía entre la IL y el BLA cuando fue entregado en un contexto de extinción. En contraste, VNS entregado a los animales no entrenados en sus jaulas de origen no tuvo efecto sobre synaptic plasticidad en la vía de IL-BLA (Figura 4B).
Figura 1. Construcción de Puños nervio vago. (A) Colocación de la pieza de 4 mm de tubo en la broca para la estabilidad, que muestra el uso de una aguja modificado para perforar agujeros en el tubo. (B) Los agujeros se han hecho en el tubo, y el tubo ha sido cortado por la mitad. (C) Colocación del hilo de sutura a través de los agujeros del manguito. Tenga en cuenta que el hilo pasa por encima del borde del manguito. (D) Inserción de los cables de iridio de platino para el manguito. Top muestra Terminado cableado, inferior muestra el cableado en proceso. (E, F) El manguito completado con los pasadores de oro fijadas al extremo de los cables. Ver insertar en (F) para la escala. (G) Muestra el cpieza headcap orresponding que se apega al cráneo durante la cirugía se describe en el paso 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. estimulación del nervio vago y experimental. (A) Esquema de la configuración utilizada para la estimulación del nervio vago (VNS). Animales están conectados a una unidad de aislamiento de estimulación a través de un casquete de la cual 2 alambres de platino-Iridum conducen por vía subcutánea en el manguito-electrodo a medida que se envuelve alrededor del nervio vago. (B) Colocación del manguito-electrodo alrededor del nervio vago. Microfotografía de la incisión quirúrgica y el nervio vago expuesta ante el electrodo manguito se sutura a su alrededor. (C) Fotografía de la configuración utilizada paraauditivo condicionamiento del miedo, con el animal conectado al estimulador. (Figura modificada de Referencia 20). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. VNS mejora la extinción de auditiva condicionamiento del miedo. (A) línea de tiempo experimental. Días 1 y 2: Auditivo miedo acondicionado, 8 tonos (CS) / emparejamientos de choque (US) por día. Día 3: Aire Miedo prueba Pre, congelación mide durante 4 presentaciones de tono no apareados. Día 4: El tratamiento, 3 grupos: 4 presentaciones de tono emparejado con VNS, 4 presentaciones de tono emparejado con sham-estimulación, presentaciones 20 tonos combinados con estimulación simulada (EE). Día 5: El miedo acondicionado Post Test, congelación medida durante 4 presentaciones de tono no apareados (B). (C) Porcentaje de tiempo dedicado a la congelación durante los intervalos entre tonos (ITI) en el día 3 (D3, barras blancas ) y el Día 5 (D5) para los mismos grupos que se muestran en los animales B. VNS también demostraron una reducción de comportamiento de congelación fuera de la presentación del tono acondicionado. (* P <0,05, barras de error representan el error estándar de la media). (Figura modificada de Referencia 20). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. VNS altera metaplasticidad en la vía IL-BLA. (A) estimulación Representante y los sitios de grabación de la IL y BLA y trazas representativas de una curva de entrada-salida de los potenciales de campo registrados en el BLA después de la estimulación de la IL. (B ) la plasticidad sináptica en la vía IL-BLA en respuesta a la estimulación de ráfaga corta en 4 grupos de ratas. Arriba a la derecha: En ratas miedo acondicionado breve estimulación estallido de la IL induce LTD en el BLA. Izquierda Secundaria: ratas que recibieron entrenamiento de extinción 4 tonos con estimulación simulada también muestran LTD. Abajo a la izquierda: las ratas que recibieron entrenamiento de extinción extendida con estimulación simulada no muestran cambios, o una recuperación de la LTD que fue inducida en el único grupo miedo condicionado y el grupo de estimulación simulada. Derecho Secundaria: en ratas tratadas con VNS durante una sola extsesión inction, la fuerza sináptica se potencia aún más, dando lugar a la LTP. Abajo a la derecha: VNS entregado en la jaula hogar provoca ningún cambio en la plasticidad. Abreviaturas: IL, corteza infralímbica; PL, corteza prelimbic; BLA, el núcleo basolateral de la amígdala, LA, núcleo lateral de la amígdala; CE, núcleo central de la amígdala. (* P <0,05, barras de error representan el error estándar de la media). (Figura modificada de Referencia 20). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. simplificado esquemático de la inervación del tronco cerebral por el nervio vago y proyecciones de segunda o de orden superior. A través de su modulación indirecta de núcleos de monoamina en el tronco cerebral, incluyendo el locus coeruleus (LC) y el nucle rafei (DRN), el nervio vago puede modular componentes importantes de los circuitos de la extinción, que incluyen la corteza prefrontal (PFC), la amígdala (Amyg), el hipocampo (Hipp) y el núcleo accumbens (NAC). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Presentamos aquí un protocolo que se utiliza para facilitar la extinción del miedo condicionado durante una sola sesión de la exposición a las señales condicionado 19 y para modular la plasticidad en la vía entre la corteza infralimbic y la amígdala basolateral que pueden mediar la extinción de aprendizaje 20. Un paso crucial para el éxito de este protocolo es la correcta entrega de VNS durante el entrenamiento de extinción. Por lo tanto, la atención especial se debe dar a la construcción de los electrodos del manguito y la colocación del manguito alrededor del nervio vago. En el proceso de construcción del electrodo de manguito es importante para asegurar que la porción expuesta de los cables están en el lugar correcto. Del mismo modo, durante la cirugía, se deben hacer esfuerzos especiales para colocar el manguito en la posición correcta y para anclar suficientemente en su lugar para que el circuito entre el manguito y el estimulador se mantiene intacta durante el transcurso del experimento. El correcto funcionamiento de la banda debe be comprueba después de la cirugía (como se indica en el paso 3.2.20) y de nuevo después de las pruebas de comportamiento (tal como se indica en el paso 4.8).
Los mecanismos mediante los cuales VNS modula la actividad en el sistema nervioso central no se entienden completamente. El nervio vago cervical se compone de fibras motoras eferentes sensoriales aferentes y en aproximadamente una proporción de 4 a 1, respectivamente 25. Vagal aferentes transmiten señales al núcleo del tracto solitario (NTS), que luego proyectos para parabrachial núcleo, hipotálamo, tálamo, la amígdala, hipocampo y 26,27. Es importante destacar que los núcleos de monoaminas en el tronco cerebral, el locus coeruleus (LC) y los núcleos del rafe, reciben proyecciones directas y / o indirectas de la NTS (Figura 5). Por lo tanto VNS puede modular la plasticidad cortical y la memoria a través de la acción sinérgica de varios neuromoduladores. Efectos propuestas relacionadas con la estimulación vagal incluyen alteración de la norepinefrina (NE) la liberación por las proyecciones de las NTS alLC, niveles elevados de GABA inhibitorio, y la inhibición de la actividad cortical aberrante por la activación del sistema reticular 28,29,30. Los papeles importantes de la acetilcolina, la serotonina, y el factor neurotrófico derivado del cerebro también se han demostrado 31-35. Para la modulación de recuerdos del miedo y la extinción en general, los efectos de la estimulación del nervio vago en la liberación del transmisor en la corteza prefrontal (PFC), la amígdala y el hipocampo, es probable que sean particularmente relevantes 36,37. Agudo VNS aumenta la norepinefrina y la serotonina liberación tanto en el medial PFC 33,38 y la amígdala 39,30. Agudo VNS también aumenta los niveles de norepinefrina 38 y aumenta la transmisión sináptica en el hipocampo 40-42. La norepinefrina ha sido previamente demostrado estar involucrados en la modulación de la expresión de miedo. Las lesiones de las proyecciones NE de la LC para el cerebro anterior perjudican la extinción de evitación activa sin alterar adquisición o retención de la original aprendizaje 43,44. Consolidación del miedo condicionado depende de la activación de β-adrenérgicos en el BLA 43, y varios informes sugieren un papel para ambos receptores α- y β-adrenérgico en el medial PFC en consolidación de la memoria tanto de las drogas y el miedo-extinción de entrenamiento 46-49. Así, cuando el emparejamiento entrenamiento de extinción con la ENV, la liberación inducida por la ENV de neuromoduladores como NE o 5-HT parece facilitar la plasticidad sináptica que resulta de la formación por sí sola, lo que lleva a una mayor consolidación de la extinción.
Una ventaja importante de VNS reside en su especificidad temporal y espacial. A diferencia de la aplicación del fármaco sistémico o incluso local, que a menudo tienen un inicio lento y desplazamiento de acción, VNS se puede combinar selectivamente con comportamientos específicos para facilitar la plasticidad sináptica en las redes activas que regulan la conducta de interés. Se describe aquí un protocolo VNS que utiliza parámetros también se utiliza clínicamente para la treatment de la epilepsia en humanos (0,4 mA, 500 mu s de ancho de pulso a 30 Hz, ciclo de estimulación de 30 segundos y 5 minutos en off). Experimentos de microdiálisis muestran que la ENV usando estos parámetros conduce a un aumento duradero, más o menos 2 veces de la liberación de NE en la amígdala 39. Este aumento grande y relativamente lento en NE puede explicar por qué VNS emparejados con entrenamiento de extinción, a diferencia de entrenamiento de extinción extendida por sí mismo, también facilitaron la extinción de congelación comportamiento fuera de la presentación del estímulo condicionado (el intervalo entre ensayos). Debido a que en nuestros experimentos animales se sometieron a entrenamiento de extinción en el mismo contexto que el auditiva condicionamiento del miedo, la reducción de la congelación de comportamiento durante el ITI indica que VNS facilitó generalización del aprendizaje de la extinción al contexto.
Sin embargo, a pesar de los efectos potencialmente de larga duración sobre la liberación de NE, efectos de la estimulación del nervio vago en el comportamiento o plasticidad sináptica son sólo aparentes cuando se emparejan won un comportamiento específico. Aplicación de VNS a ratas en sus homecages poco después de la formación miedo extinción no facilitó la extinción 20, y de manera similar, VNS aplica fuera de un contexto de comportamiento específico no alteró la plasticidad sináptica en la vía IL-BLA (cf Figura 3C). Por otra parte, incluso breves aplicaciones de VNS (por ejemplo, 0,8 mA como un tren de pulsos de 15, 100 microsegundos de ancho de pulso a 30 Hz para 500 ms) causan cambios concretos y duraderos en las redes sensoriales o motoras cuando se entregan contingente con el comportamiento en curso.
Un papel seminal por el grupo de Michael Kilgard 7 mostró que el emparejamiento temporal precisa de VNS con la presentación de un solo tono conduce a la plasticidad en la corteza auditiva mapa de frecuencia de tono. Estos efectos ya se han utilizado clínicamente para revertir la plasticidad patológica en la corteza auditiva para tratar el tinnitus 50. Del mismo modo, El emparejamiento repetido de VNS con un comportamiento motor se ha demostrado que reorganizar corteza motora 8 y esta plasticidad apuntado es altamente eficaz en la recuperación de la función en diferentes modelos animales de accidente cerebrovascular 9,10.
Sin embargo, retrasó VNS entregado 2 horas después de las sesiones de entrenamiento de rehabilitación o varias veces mayores cantidades de VNS dado lugar comparativamente menos mejoría que precisamente cronometrado VNS 51. Por lo tanto, los estudios futuros deben optimizar tanto la sincronización y la cantidad de estimulación del nervio vago para maximizar los beneficios terapéuticos. Nuestros resultados muestran que la ENV, que está clínicamente aprobado para el tratamiento de la epilepsia y la depresión resistente al tratamiento resistente a múltiples fármacos, podría ser utilizado como un tratamiento adyuvante a la terapia de exposición, ya que modula la plasticidad-específica de aprendizaje para mejorar el efecto de la exposición en la extinción de miedo condicionado responder.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol | |||
| Atropine | Fisher | A0132-5G | |
| Betadine | Henry Schein | 69066950 | |
| Hydrogen peroxide | CVS | 209478 | |
| Ketamine | Henry Schein | 1129300 | |
| Marcaine | Henry Schein | 6312615 | |
| Mineral Oil | CVS | 152355 | |
| Neosporin | CVS | 629451 | |
| Oxygen | Home Depot | 304179 | |
| Pennicillin | Fisher | PENNA-10MU | |
| Propane | Home Depot | 304182 | |
| Xylazine | Henry Schein | 4019308 | |
| Tools | |||
| Jewelery Torch | Smith Equipment | 23-1001D | |
| Sewing Needle | Walgreens | 441831 | |
| #5 Forceps (2) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Soldering Iron | Home Depot | 203525863 | |
| AmScope SM-4TX-144A 3.5X-45X Circuit Board Boom Stereo Microscope + 144 LED | AmScope | SM-4TX-144A | |
| Helping Hands | A-M Systems | 726200 | |
| Scalpel Blade Holder | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Metal File | Home Depot | 6601 | |
| Ruler | Home Deopt | 202035324 | |
| Curved Hemostats | Fine Science Tools | 130009-12 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Spatula | Fine Science Tools | ||
| Small Screwdriver | Home Depot | 646507 | |
| Magnetic Fixator Retraction System | Fine Science Tools | 18200-04, 18200-01, 18200-05 | |
| Heating Pad | Walgreens | 30294 | |
| Clippers | Walgreens | 277966 | |
| Sharpie | Staples | 125328 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Custom Micropipette Glass Tools (J shape and Straight) - Borosilicate glass | Sutter Instrument | B150-110-10 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Cuffs | |||
| Tubing | Braintree Scientific Inc | MRE-065 | |
| Platinum Iridium Wire | Medwire | 10IR9/49T | |
| Gold Pins | Mill-Max | 1001-0-15-15-30-27-04-0 | |
| Suture Thread | Henry Schein | 100-5797 | |
| 22 G needles | Fisher | 14-815-525 | |
| Paper Tape | Fisher | 03-411-602 | |
| Solder | Home Depot | 327793 | |
| Flux | Home Depot | 300142 | |
| Scalpel Blade, 10 or 15 | Stoelting | 52173-10 | |
| Silastic Laboratory Tubing .51 mm ID x .94 mm OD | Fisher | 508-002 | |
| Headcaps | |||
| Connector Pieces (male) | Omnetics Connector Corporation | A25001-004 | |
| Headcap pieces (female) | Omnetics Connector Corporation | A24001-004 | |
| Teets Dental Acrylic, Liquid and Powder | A-M Systems | 525000, 526000 | |
| 26 Gauge Solid Copper Wire | Staples | 1016882 | |
| Surgery | |||
| Bone Screws | Stoelting+CB33:C61 | 51457 | |
| Scalpel Blades, 10 or 15 | Stoelting | 52173-10 | |
| 1 ml syringes | Fisher | 14-826-261 | |
| 22 G Needles | Fisher | 14-815-525 | |
| 27 G Needles | Fisher | 14-826-48 | |
| 2" x 2" Gauze | Fisher | 22-362-178 | |
| Swabs | Fisher | 19-120-472 | |
| Puppy Pads | PetCo | 1310747 | |
| Kim Wipes | Fisher | 06-666-A | |
| Chamber and Behavioral Setting | |||
| Husky Metal Front Base Cabinet (30WX19DX34H) | Home Depot | 100607961 | |
| Quiet Barrier HD Soundproofing Material (Sheet) (PSA) | soundproofcow.com | 10203041 | |
| Convoluted Acoustic Foam Panel | soundproofcow.com | 10432400 | |
| Isolated Pulse Stimulator Model 2100 | A-M Systems | 720000 | |
| Digital Camera - Logitech Webcam C210 | Logitech | B003LVZO88 | |
| MatLab | Mathworks.com | ||
| Sinometer 10 MHz Single Channel Oscilloscope | Sinometer | CQ5010C | |
| OxyLED T-01 DIY Stick-on Anywhere 4-LED Touch Tap Light | OXYLED | B00GD8OKY0 | |
| 5k ohm potentiomter | Alpha Electronics | B00CTWDHIO | |
| Extech 407730 40-to-130-Decibel Digital Sound Level Meter | Extech Instruments | B000EWY67W | |
| DSCK-C Dual Output, scrambled shocker | Kinder Scientific Co |
References
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