Summary
Vagus nervstimulering (VNS) har vuxit fram som ett verktyg för att framkalla riktat synaptisk plasticitet i framhjärnan för att ändra en rad beteenden. Detta protokoll beskriver hur man genomför VNS för att underlätta konsolideringen av rädsla utrotning minne.
Introduction
Klassisk rädsla konditione ger en allmänt använd djurmodell för att studera den biologiska grunden för ångestsyndrom. Under rädsla luftkonditionering, är ett obehagligt stimulus (det obetingade stimulus, USA, till exempel, en fotchock) presenteras i samband med ett neutralt stimulus, t.ex. en ton och / eller ett sammanhang (det betingade stimulus, CS). Under rädsla konditione är associationer mellan CS och USA bildas. Så småningom presentationen av CS enbart framkallar en rädsla svar (den betingad respons, CR). I rädsla utrotning, är CS presenteras upprepade gånger i frånvaro av USA, vilket gör att CR gradvis minska 1. Således är utrotning av konditionerat rädsla en aktiv process där fruktansvärda beteende svar på neutrala stimuli dämpas när de inte längre förutsäga aversiva utfall. Utrotning av betingade svar kräver konsolidering av nya minnen som konkurrerar med lärda associationer. Ett kännetecken av ångestsyndrom är Impaired utrotning 2-4. Således, utrotning av konditionerat rädsla i djurmodeller fungerar som en viktig paradigm både hämmande lärande och som en modell för beteendeterapi för mänskliga ångest 5,6.
Eftersom det finns nära korrespondens mellan rädsla och mänsklig ångest, är det tänkt att dessa studier kan ge en inblick i den biologiska natur ångestrelaterade sjukdomar såsom posttraumatiskt stressyndrom och kommer att bidra till att utveckla strategier för att behandla dem. Ett viktigt mål för den prekliniska forskningen är att hjälpa utrotning lärande och att inducera riktad plasticitet i utrotning kretsar för att konsolidera utrotning lärande. Vagus nervstimulering (VNS) är en minimalinvasiv neuroprosthetic metod som kan användas för att tillhandahålla snäva tidsmässiga och kretsspecifika modulering av områden i hjärnan och synapser som deltar i ett pågående arbete. En rad nya studier från Michael Kilgard grupp vid University of Texas at Dallas harvisat att parning VNS med diskreta sensoriska eller motoriska stimuli (t.ex. ett ton eller en spak pull) är mycket effektiva för att främja kortikala plasticitet för att behandla tinnitus 7, eller att övervinna motoriken efter stroke 8-10. Dessutom, icke-kontingent VNS som inträffar inom en kort tid fönster efter att lära liknande främjar kortikala plasticitet och förbättrar minnet konsolidering hos råttor och människor 11-13.
Med tanke på rollen av vagusnerven i det parasympatiska reaktionsvägen, är det inte överraskande att det skulle kunna medverka i att modulera minnen och synaptisk plasticitet. Mycket känslomässiga händelser tenderar att ge starkare minnen än icke-känslomässiga minnen. Detta beror sannolikt på grund av påverkan av stresshormoner på minnet konsolidering. Posttraining administrering av stresshormonet adrenalin förbättrar minnet konsolidering i mänskliga och icke-mänskliga djur, men adrenalin inte passera blod-hjärn-barriären 14, 15 16 fann att systemisk administrering av adrenalin ökade vagusnerven bränning, och ökade nivåer av norepinefrin i amygdala 17. Systemisk administrering av adrenalin inte förbättra minnet konsolidering när β-adrenerga receptorer är blockerade i amygdala 18 vilket tyder på att vagusnerven spelar en roll i den väg som förvandlar emotionellt upphetsande erfarenheter till långtidsminnen.
Således, para ihop VNS med utbildning har potential att förbättra hjärnförändringar som stöder minne konsolidering och exponering för rade signaler i frånvaro av armering ökar konsolideringen av utrotning lärande hos råttor 19,20. Här beskriver vi användningen av VNS ensa verktyg för att främja kortikal plasticitet och underlätta utrotningen av en betingad rädsla svar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer som beskrivs i detta protokoll genomförs i enlighet med NIH Guide för skötsel och användning av försöksdjur, och de har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Texas at Dallas.
1. Konstruktion av VNS manschetter
- Skapa ett borrverktyg genom att såga av den vassa änden av en 22 ½ G-nål.
- Kör nu trubbiga änden av 22 ½ G nål över en metall fil flera gånger för att platta till den. Håll nålen i en 45º vinkel till filen och kör den flera gånger under filen medan du roterar det. Detta kommer att bringa metallen att bli tunnare och furl inåt. VARNING: Sätt spetsen på skalpellen i den avskurna ändan av nålen och vrid med några nedåtriktad kraft för att veckla ut metallen.
- Använd förstorande kikare för de återstående stegen i avsnitt 1.
- Med användning av en skalpell (10 eller 15 blad) skär 4 mm segment av slangen.
- Placera en 4 mm segment över enlitet borr eller annat på liknande sätt formade verktyg. Detta för att hålla slangen på plats medan det är manipuleras.
- Borra 4 hål i slangen (Figur 1A). Hål bör göra fyra punkter av en 2 mm med 2 mm och måste vara rena med ojämna kanter.
OBS: borrverktyget behöver slipas (steg 1,2) var 2 eller 3 hål. Svårigheter med det här steget är nästan säkert på grund av ett borrverktyg som inte är tillräckligt skarp. - Med slangen fortfarande på borrkronan, använda en skalpell för att skära slangen på längden mellan hålen, så att två hål hamnar på vardera sidan av snittet (Figur 1B).
- Med användning av en synål och suturtråd, passera sutur genom hålen för att skapa riggn för den ultimata placering av manschetten kring vagusnerven. Börja med nålen inuti manschetten och för den genom ett av hålen, och sedan gå tillbaka genom det angränsande hålet från utsidan (Figur 1C). Knyt thread tillsammans ~ 2 cm från plasten så att slangen och tråd gör en triangel. Tillåt ~ 8 cm tråd efter knuten och trim. Upprepa processen för hålen på den motsatta sidan av snittet. Slangen är nu redo att anslutas.
- Förbered ledningar för manschetter.
- Klipp platina iridium tråd i 70 mm segment.
- Använda finaste tips för smycken facklan, skapa en skarp eld med blå center som är så raffinerat som möjligt och använda den för att strippa ~ 1 cm av plastbeläggningen från tråden. Applicera blå centrum av lågan till avskalade änden av kabeln för att skapa en liten boll. Applicera blå mitten av lågan till flera punkter i den avskalade delen att smälta de sju strängarna tillsammans. Tråden i dessa fläckar visas att trassla.
- På den motsatta änden av tråden, applicera den blå centrum av flamman till slutet för att skapa en liten boll. Minimera strippa plast på detta ändamål.
- Tråd manschetten (Figur 1D).
OBS: Steps i avsnitt 1.10 måste göras under förstorande kikare.- Tejpa manschetten nedåt med gängorna, så att den är orienterad med den skurna löper horisontellt. Dra trådarna ordentligt så att manschetten dras öppna och sedan tejpa ner trådarna.
- Ta tag i balled slutet av den avskalade sidan av det beredda tråd med # 5 pincett och driva igenom det nedre högra hålet. Dra tången ut ur hålet, som lämnar änden av kabeln i mitten av manschetten.
- Åter förstå balled slutet av den avskalade tråden (nu i mitten av manschetten) och driva igenom det övre högra hålet. Dra tången ut ur hålet och lämnar tråden passerade helt genom manschetten och löst på ovansidan av manschetten.
- Åter förstå balled slutet av den avskalade tråden (nu utanför manschetten på ovansidan) och skjut den tillbaka genom det övre högra hålet från insidan. Fortsätt att göra det tills tråden är säkert på plats: test genom att slita på den motsatta änden av tråden.
NOTERA:Under denna process är det viktigt att skilja de skalade / isolerade partierna av tråden. Tråden som slutligen är placerad i "tråg" av manschetten måste strippas, men allt under bottenhålen (utanför manschetten på bottenänden) måste isoleras. Detta säkerställer leverans av ström till endast vagusnerven. - Ta tag i balled slutet av den isolerade sidan och driva igenom det nedre högra hålet från insidan av manschetten, kretsa runt en gång.
- Upprepa steg 1.10.2 - 1.10.5 på vänster sida av manschetten så att två trådar hamna fäst vid slangen, en på höger sida och en på vänster sida.
- Placera en guldstift in i armen på hjälpande hand med hålet uppåt. Fyll hålet med flödet.
- Löd den isolerade änden av tråden (nu fästad till manschetten) i stiftet.
- Låt lodet svalna, och sedan smälta det igen. Detta säkerställer en god anslutning mellan änden av tråden och den i:nside av tappen. Applicera mer löda om det behövs. Upprepa för andra tråd.
- Med ledningarna kör till höger, markera toppen av manschetten med märkpenna. Markera även guld stift fäst vid den övre ledningen.
2. Konstruktion av Headcap för VNS Input Site
- Skär 30 mm segment av 26 AWG koppartråd. Strip en liten del på varje ände.
- Skär den smala änden bort lösa guld stift och löda den avskalade änden av kabeln till den avskurna ändan av guldstiftet. Skapa två tråd / stift föreningar för varje önskad ingångs webbplats. Placera en kontakt i hjälpande händer och löda trådänden av en tråd / tapp förening till var och en av de två flussat tänder kontakten (figur 2G).
- Markera en av trådarna med sharpie. Under operationen, placera implantatet med den märkta ledningen rostralt till den omärkta tråden.
3. VNS Kirurgi
- Skapa anpassade glas verktyg för hantering av vagus nerv under operationen.
- Använd borsilikatglas för att dra en mikropipett, så att den har en lång avsmalnande spets. Om ingen pipett avdragare är tillgänglig, bryta glaset för att skapa en längre kant.
- Håll icke-avsmalnande änden av pipetten med en tjock trasa (för att förhindra brännskador) och tryck den avsmalnande / brutna änden i en jämn brandsäkra ytan samtidigt som den blå låga från smycken facklan till den avsmalnande änden. Glaset kommer att böja då den pressas in i ytan. Applicera låga tills en krok eller J form former.
- VNS kirurgiska ingrepp
- Samla och sterilisera alla verktyg. Förbered en sanitär, uppvärmd operationsområdet.
- Söva djur med ketamin / xylazin (85 mg / kg, 5 mg / kg, IP). Utvärdera djupet av bedövningsmedlet planet genom att övervaka djurets läten och uttags-reflexer som svar på tå och / eller svans klämmande.
- Raka toppen av huvudet och vänstra sidan av djurets hals. Skydda djurets ögon med gruvarbetareal olja eller ögonsalva. Applicera jod rengöringslösning med gasbinda och sedan alkohol med gasväv för att de rakade områden. Upprepa en gång.
- Injicera 0,05 ml Marcaine subkutant på toppen av huvudet och låta bolus att skingra medan placera djuret i stereotaxic instrument.
- Använd en skalpell för att göra ett snitt i huden på skallen för att exponera både lambda och bregma. Förbered en väg för manschetten med trubbiga pincett till tunnel subkutant från snittet plats på vänsterkanten framför örat till vänster sida av halsen.
- Dra snittet plats öppen med peanger. Med hjälp av bomullspinnar, tillämpa väteperoxid till den exponerade skallen för att avlägsna eventuell kvarvarande vävnad.
- Med hjälp av en skalpell, borra två grunda starter hål i skallen att placera förankringsskruvar. De bör placeras tillräckligt långt ifrån varandra för att ge utrymme för implantatet, men inte för nära den omgivande vävnaden. Undvik att placera skruvar direkt på mittlinjen.
- Med kraftps och skruvmejsel, kör en benskruv i båda hålen. Skruvarna bör vara täta i hålen, med lock 2-3 mm ovanför ytan av skallen för att ge utrymme för akryl att fylla i under och runt skruvarna.
- Fyll utrymmet under, runt och mellan skruvarna med en liten mängd av akryl, undvika den omgivande vävnaden. Placera sedan en större mängd akryl i mitten av skallen mellan de två skruvarna.
- Ta implantatet så den märkta ledaren är orienterad rostralt till den omärkta tråden och snabbt placera implantatet i akryl, noga med att inte få akryl i guldnålar, spännet området, eller ingångs plats på toppen. När placerade gör det möjligt att ställa ~ 5 minuter tills det är torrt. Detta kan också göras med hjälp av armen av stereotaxic för stöd. Fyll i sprickor eller springor mellan implantatet och skallen med en lågviskös blandning av akryl. Låt torka.
- Använd förstorande kikare för de återstående stegen i avsnitt 3.2.
- Avlägsna the djuret från stereotaxic instrument. Placera djuret på sin högra sida, vrida den något mot ventrala positionen.
- Gör ett litet snitt ungefär över den vänstra halsvenen. Käkbenet och nyckelbenet bör vara ungefär lika långt till snittstället. Bredda snittet med hjälp av dissektion tills muskelskiktet har nåtts. Sternocleidomastoideus, sternohyoid och omohyoid muskler ska synas. Använd muskel upprullningsdon att hålla platsen öppen.
- Fortsätt trubbig dissekera längs naturliga fåror mellan musklerna. Leta efter pulserande av halspulsådern. Rubrik genom muskeln mot pulserande kommer att avslöja halspulsådern. Dra musklerna tillbaka med muskel upprullningsdonet. Manteln innehåller karotidartären innehåller också vagusnerven. Försiktigt trubbigt dissekera manteln med saxen.
- Identifiera vagusnerven. Det är den största nerven i hals manteln och är vanligen till djurets vänstra sida av artärenmen kan hittas på någon sida. Växla till anpassade glas verktyg och separera vagusnerven från halspulsådern. Nerven bör vara fri från någon annan vävnad i minst 5 mm.
- Från snittet på huvudet, med hjälp av gängorna på den sida av manschetten motsatt ledningarna, dra manschetten genom den tidigare gjort subkutan tunnel med pincett eller små hemostater. Tryck in den genom vävnaden in i snittstället på halsen.
- Lyft försiktigt nerven på användande av de glas verktyg och tryck trådarna på den sida av manschetten motsatt ledningarna under nerven. Dra trådarna hela vägen igenom, noga med att inte gnida mot nerven. Manschetten ska vara omedelbart intill nerven.
- Se till att manschetten är orienterad med den markerade "topp" sida överlägsen. Släpp nerven i mitten av manschetten. Nerven bör nu ligga över båda trådarna i tråget av manschetten (fig 2B). Knyt trådarna tillsammans för att stänga manschetten.
- På headcap, plugga stift som är fästa manschetten i guldstift på stimulans input webbplats. Anslut den markerade stiftet i guld stift fäst vid de främre tanden på ingångssimulerings webbplats.
- För att kontrollera att manschetten stimulerar korrekt vagusnerven, utför ett upphörande av andnings testet genom att ansluta stimulatorn till att stimulera ingångs plats på headcap och kör stimulering (0,2 mA, 60 Hz, upp till 10 sek). Andningen ska kort stanna och hjärtfrekvens ska sjunka, kontrollera manschetten funktion.
- Säkra stiften på stimulering ingångsstället med akryl. Täck trådarna och kontrollera att exponerade stift och ledningar inte leda till kortslutning. Använd akryl att släta över alla gupp eller fylla i eventuella luckor. Låt torka.
- Suture stängt båda snitt platser. Injicera 0,05 ml Marcaine subkutant nära halsen snitt webbplats. Applicera antibiotisk salva till snittet webbplatser. Eventuellt lämna en hankontakt på plats på stimulans input webbplats tillförebygga skada eller obstruktion under läkningsprocessen.
- Behandla med antibiotika och följa standard postoperativ vård inklusive lämplig smärtlindring. Återgå djur till djurstallar anläggningen efter de återfår rörlighet. Låt 5 dagar för återhämtning. För att säkerställa maximal livslängd och funktion av headcap, hysa djur ensamma under återstoden av experimentet.
OBS: Sham-VNS råttor genomgå samma operation, men kretsen är utformad för att kort på samma nivå som den headcap (dvs är en headcap implanteras och vagusnerven separeras från karotidartären, men ingen elektrod manschett placeras runt nerv).
4. Auditory rädsla Conditioning
OBS: Denna rädsla konditione protokollet är mer intensiv än de flesta 21 eftersom målet med dessa experiment är att öka utrotning. Med mild rädsla konditionering som är lätt släckt, kan en golveffekt skymma denna förbättring.
- Följ de första tonen presentationer med 8 ton-fotchock (1 sek, 0,5 mA) ligaspel på varje 2 dagar i följd. Upprepa ton-fotchock pair igen på den andra dagen. Variera mellan stimulus-intervall (ISI) mellan 2 och 4 minuter, i genomsnitt 3 minuter för varje prövning. Randomisera den punkt vid vilken chocken inträffar under tonen.
- Anslut råttorna i stimulatorn genom att sätta hankontakterna från stimulator in stimuleringsingångs webbplats. Placera djur in i kammaren (Figur 2A, 2C). Ställ stimulatorn till 0,4 mA, 500 ps pulsbredd på 30 Hz. Ställ stimulans till en total varaktighet på 30,15 sek, börjar 150 ms före inträdet i tonen. Spela djur 4 toner (som i steg 4.6) och koppla ihop varje ton presentation med VNS eller Sham VNS.
- Anslut djuret i som vanligt och dela utsignalen från stimulatorn till oscilloskopet.
- Ställ in intervallet på oscilloskopet som -20 V till +20 V och köra stimulans. Vågformen för 30 Hz stimulering bör vara synlig på oscilloskopet. Stimuleringar som överstiger 10 V i storlek indikerar hög impedans och en felaktigt fungerande manschetten eller anslutning till stimuleringsingångs webbplats.
5. In vivo Inspelningar av Evoked Field Potentials
Obs! Detta steg är valfritt. Framkallade fält potentialer (EFPS) registreras 24 timmar efter tester av återställande (Dag 5) i isofluran-sövda råttor monterade i en stereotaktisk apparat, följande standardprocedurer 23,24.
- Samla och sterilisera alla verktyg.
- Inducera anestesi med isofluran (5% i 100% syre, flöde 1 liter / minut) i en klar plastkammare. Utvärdera djupet av bedövningsmedlet planet genom att övervaka djurets läten och uttags-reflexer som svar på tå och / eller svans klämmande. Använd mineralolja eller ögonsalva att skydda ögonen.
- Injicera 0,05 ml Marcaine subkutant på toppen av huvudet och låta bolus att skingra. Använd en skalpell och peanger att avlägsna headcap från skallen. Använd så lite kraft som möjligt för att undvika att fördunkla bregma.
- Placera djuret i stereotaxic instrument. Använd en skalpell för att vidga snittet att exponera både lambda och bregma. Upprätthålla anestesiplan med isofluran (3% i 100% syre, flöde 1 liter / min) via en noskon.
- Borra hål i skallen ovanför infralimbic prefrontala cortex (IL) och basolaterala amygdala (BLA). Sänk ett glas mikroelektroder (2M KCl, 1-2 MOhms motstånd) i BLA (D / V: 7,2, A / P: 2,7, M / L: 4,9 från bregma) och en stimulatjonelektrod in IL regionen av den mediala prefrontala cortex (D / V: 4,6, A / P: 3,0, M / L: 0,7 från bregma) (Figur 4A).
- Stimulera IL att framkalla EFPS i BLA. Data som visas i Figur 4 förvärvades med följande inställningar: En stimuleringspuls på 0,3 ms varaktighet, med hjälp av en stimulering intensitet som motsvarade 40% av den minsta strömstyrka som framkallade en maximal fält svar (baserat på en input-output kurvan, som bestämts innan insamling av utgångsdata), levereras varje 15 sek.
- Samla basdata för ett minimum på 10 - 15 minuter före induktion av synaptisk plasticitet.
OBS: Det protokoll som används för att framkalla synaptisk plasticitet kommer att variera med kraven i experimenten och måste väljas omsorgsfullt för varje försöksledaren. Data i Figur 4C visar förändringar i EFP efter 3 skurar av 100 pulser vid 50 Hz (2 sek), med 20 sek samman brast intervall på minsta strömstyrka som väckerd är maximal fältsvaret. - Mät amplitud av EFP som skillnaden mellan medelvärdet av ett 5 ms fönstret innan stimulerings artefakt och medelvärdet av ett fönster 5 msek omkring 20-25 ms efter stimulering artefakt, som motsvarar den negativa toppen av fältpotentialen. Normalisera data till baslinjen och ställ in genomsnitt 10 minuter baslinje som 100%. Använd genomsnitt EFP amplituder av ytterligare 10 minuters period efter plasticitet induktion (t.ex. 40-50 min efter induktion) att bedöma långsiktiga förändringar i EFP amplitud.
- Efter slutet av inspelningen decapitate bedövade djuret och extrahera hjärnan. Förbered vävnad för histologisk verifiering av elektrodplacering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det här avsnittet visar exempel på resultat som kan uppnås med hjälp av VNS i kombination med utrotning lära sig att minska uttrycket av den betingade rädsla svar i råttor. För dagar 1 och 2 (Auditory rädsla Conditioning) råttor tränade på en auditiv rädsla konditione uppgift där footshocks var parat med en ton. På dag 3 (Pre Behandling Test), var toner presenteras i frånvaro av footshocks att mäta frysningspunkter och härleda rade rädsla svars förvärvet. Dag 4 (behandling) råttor fick gruppspecifika utrotning utbildning och behandling: 4 ton presentationer var parat med antingen VNS eller sham-stimulering eller, i den utökade utrotning gruppen, 20 ton presentationer med bluff-stimulering. Frysnings testades igen på dag 5 som svar på 4 presentationer av CS ensam (efter behandling test) (jfr tidslinje i figur 3A). Djur som fått ett begränsat antal (4) icke-förstärkta exponeringar till conditioned ton under utrotning fasen visar bara en liten minskning i konditionerat rädsla på följande återanställning dag (Figur 3B). Däremot VNS-behandlade råttor uppvisar en signifikant minskning av frysning efter en enda extinktion träningspass (figur 3B). Mängden reduktion i det konditionerade rädsla svaret av VNS-behandlade djur är jämförbar med den som ses i skenbehandlade djur som erhöll 5 gånger mängden av icke förstärkta exponeringar (20 toner) under utrotning utbildning (grupp EE i figur 3B). Använda specifika experimentuppställning som beskrivs ovan, kan VNS också underlätta utrotning till sammanhanget. Såsom visas i figur 3C, även VNS djur uppvisade nedsatt frys beteende utanför presentationen av det konditionerade tonen, vilket tyder på att deras utdöende utbildning generaliserad också för sammanhanget. Vi visar också att para ihop VNS utrotnings utbildning ändrar metaplasticity i vägen betwesv infralimbic cortex (IL) och basolaterala amygdala (BLA) i sövda djur (Figur 4). I rädsla konditionerade djur som inte genomgått utrotning utbildning, kort skurstimuleringen (HFS) av IL-inducerad LTD av framkallade lokala fältet i BLA (Figur 4). Oavsett om de fick förlängas utrotning utbildning eller VNS under en enda utrotning session, var detta synaptiska depression vände i djur som uppvisar betydande utrotning av konditionerat rädsla; emellertid administrering av VNS under utrotning främjade induktion av LTP, medan djur i den utökade utrotning gruppen visade ingen förändring i respons till HFS. Detta resultat observerades också hos djur som sken stimulerade i fyra ton utrotning grupp. Viktigt bara VNS ändrade plasticitet i vägen mellan IL och BLA när den levererades i en utdöende sammanhang. Däremot VNS levereras till otränade djur i deras hem burar hade ingen effekt på synaptic plasticitet i IL-BLA vägen (Figur 4B).
Figur 1. Konstruktion av vagusnerven Cuffs. (A) Placering av den 4 mm slang på borrkronan för stabilitet, som visar användningen av en modifierad nål för att borra hål i slangen. (B) Hål har gjorts i slangar, och slangen har skurits i mitten. (C) Placering av suturtråden genom hålen i manschetten. Notera att tråden går över läppen av manschetten. (D) Insättning av de platina iridium kablar till manschetten. Sammanfattning visar färdig ledningar, visar botten ledningar i processen. (E, F) Den ifyllda manschetten med guld stift som är fästa till änden av trådarna. Se infoga i (F) för skalan. (G) Visar corresponding headcap pjäs som blir fäst vid skallen under operationen som beskrivs i steg 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. vagus nervstimulering och försöksuppställningen. (A) Schematisk bild av set-up som används för vagusnerven stimulering (VNS). Djur är anslutna till en stimulans isoleringsenhet via en headcap som 2 platina-iridum trådar leder subkutant till skräddarsydda manschetten-elektrod som lindas runt vagusnerven. (B) Placering av manschetten-elektroden runt vagusnerven. Mikrofotografi av det kirurgiska snittet och den exponerade vagusnerven innan manschetten elektroden sutureras runt den. (C) Ett fotografi av installationen som används förhörsel rädsla konditione, med djuret är ansluten till stimulatorn. (Figur modifierad från referens 20). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. VNS förbättrar utrotning av hörsel rädsla konditione. (A) Experimentell tidslinje. Dag 1 och 2: Auditory rädsla Conditioning, 8 ton (CS) / stötligaspel (US) per dag. Dag 3: Rade Rädsla Test Pre, frysning mätt under 4 oparade ton presentationer. Dag 4: Behandling, 3 grupper: 4 ton presentationer parat med VNS, 4 ton presentationer parat med bluff-stimulering, 20 ton presentationer parade med bluff-stimulering (EE). Dag 5: Rade Rädsla Test Post, frysning mätt under 4 oparade ton presentationer (B). (C) Del av tiden tillbringade frysning under mellantonsintervall (ITI) på dag 3 (D3, vita staplar ) och Dag 5 (D5) för samma grupper som visas i B. VNS djur visade också minskat frys beteende utanför presentationen av rade tonen. (* P <0,05, felstaplarna representerar standardfelet av medelvärdet). (Figur modifierad från referens 20). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. VNS förändrar metaplasticity i IL-BLA vägen. (A) representant stimulans och inspelningsplatser i IL och BLA och representativa spår av en input-output-kurvan av fältpotentialer registreras i BLA efter stimulering av IL. (B ) Synaptic plasticitet i IL-BLA väg som svar på kort skurstimuleringen i 4 grupper av råttor. Överst till höger: I rädsla konditionerade råttor kort burst stimulering av IL inducerar LTD i BLA. USA vänster: råttor som fick 4 ton utrotning utbildning med bluff stimulering visar också LTD. Nederst till vänster: råttor som fick förlängd utrotning utbildning med bluff stimulering visar ingen förändring, eller en återhämtning av LTD som induceras i rädsla rade enda grupp och skenstimuleringsgruppen. USA höger: hos råttor som behandlats med VNS under en enda extinction session är synaptisk styrka ytterligare förstärkas, vilket leder till LTP. Nederst till höger: VNS levereras i buren medför ingen förändring i plasticitet. Förkortningar: IL, infralimbic cortex; PL, prelimbic cortex; BLA, basolateral kärna av amygdala, LA, lateral kärna amygdala; CE, centrala kärnan av amygdala. (* P <0,05, felstaplarna representerar standardfelet av medelvärdet). (Figur modifierad från referens 20). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Förenklad schematisk bild av hjärnstammen innervation av vagusnerven och andra eller högre ordningens prognoser. Genom sitt indirekt modulering av monoamin kärnor i hjärnstammen, inklusive locus coeruleus (LC) och raphe nucleI (DRN), kan vagusnerven modulera viktiga komponenter i utrotning kretsen, som omfattar prefrontala cortex (PFC), amygdala (Amyg), hippocampus (Hipp) och nucleus accumbens (NAC). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterar här ett protokoll som används för att underlätta utrotning av konditionerat rädsla under en enda session av exponering för kondition signaler 19 och modulera plasticitet i vägen mellan infralimbic cortex och basolaterala amygdala som kan förmedla utrotning lärande 20. Ett viktigt steg för att lyckas med detta protokoll är korrekt leverans av VNS under utrotning utbildning. Därför bör särskild omsorg ägnas åt konstruktionen av manschetten elektroderna och placeringen av manschetten runt vagusnerven. I byggprocessen av manschetten elektroden är det viktigt att säkerställa att den exponerade delen av trådarna är på rätt plats. På samma sätt, under operationen, särskilda ansträngningar bör göras för att placera manschetten i rätt läge och att förankra det tillräckligt på plats så att kretsen mellan manschetten och stimulatorn förblir intakt under loppet av experimentet. Den fungerar korrekt manschetten bör be kontrolleras efter operationen (som beskrivs i steg 3.2.20) och återigen efter beteendetestning (som beskrivs i steg 4,8).
De mekanismer genom vilka VNS modulerar aktivitet i det centrala nervsystemet är inte helt klarlagda. Den cervical vagusnerven består av afferenta sensoriska och efferenta motoriska fibrer i ungefär en 4-till-1-förhållande, respektive 25. Vagala afferenta nerver reläsignaler till kärnan tractus solitarius (NTS), som sedan projekt parabrachial kärnan, hypotalamus, talamus, amygdala och hippocampus 26,27. Viktigt monoamin kärnor i hjärnstammen, locus coeruleus (LC) och raphe kärnorna får direkta och / eller indirekta prognoser från NTS (Figur 5). VNS kan således modulera kortikal plasticitet och minne via den synergistiska verkan av flera neuromodulatorer. Föreslagna effekter relaterade till vagusstimulering inkluderar ändring av noradrenalin (NE) frisättning av prognoser från NTS tillLC, förhöjda nivåer av hämmande GABA, och hämning av avvikande kortikal aktivitet genom retikulära aktiveringssystem 28,29,30. Viktiga roller för acetylkolin, serotonin, och BDNF har också visats 31-35. För moduleringen av rädsla minnen och utrotning i allmänhet, effekterna av VNS på transmittorfrisättning i prefrontala cortex (PFC), amygdala och hippocampus kommer sannolikt att vara särskilt relevant 36,37. Akut VNS ökar noradrenalin och serotonin release i både den mediala PFC 33,38 och amygdala 39,30. Akut VNS ökar också nivåerna av noradrenalin 38 och förstärker synaptisk transmission i hippocampus 40-42. Noradrenalin har tidigare visat sig vara inblandade i moduleringen av rädsla uttryck. Skador av NE prognoser från LC till framhjärnan försämra utrotning av aktiva undvikande utan att ändra förvärv eller bibehållande av origInal learning 43,44. Konsolidering av konditionerat rädsla beror på β-adrenoceptor-aktivering inom BLA 43, och flera rapporter tyder på en roll för både α- och β-adrenerga receptorer i den mediala PFC i minnet konsolidering av både läkemedels- och rädsla utrotning utbildning 46-49. Således, när du kopplar utrotning träning med VNS, i VNS-inducerad frisättning av neuromodulators som NE eller 5-HT tycks underlätta synaptisk plasticitet som är resultatet av utbildning ensam, vilket leder till ökad konsolidering av utrotning.
En stor fördel med VNS ligger i dess temporala och spatiala specificitet. Till skillnad från systemisk eller lokal drogansökan, som ofta har en långsam start och avklingande effekten kan VNS selektivt paras med specifika beteenden för att underlätta synaptisk plasticitet i de aktiva nätverk som reglerar beteendet av intresse. Vi beskriver här en VNS protokoll som använder parametrar som används också kliniskt för att bearbent av epilepsi hos människa (0,4 mA, 500 ps pulsbredd på 30 Hz, stimulering cykel 30 sekunder på och 5 minuter bort). Microdialysis experiment visar att VNS använda dessa parametrar leder till en långvarig, ungefär 2-faldig ökning av NE release i amygdala 39. Denna stora och relativt långsam ökning i NE kan förklara varför VNS parade med utrotning utbildning, till skillnad från förlängd utrotning utbildning av sig själv, underlättade också utrotning av frysning beteende utanför presentationen av betingat stimulus (det intertrial intervall). För i våra experiment djur genomgick utrotning utbildning i samma sammanhang som hörsel rädsla konditione, minskning av frys beteende under ITI visar att VNS lättat generalisering av utrotning lära sig sammanhanget.
Trots de potentiellt långvariga effekter på NE release, effekter av VNS på beteende eller synaptisk plasticitet är bara uppenbart när de är ihopkopplade wed ett visst beteende. Tillämpning av VNS till råttor i sina homecages kort efter rädsla utrotning träning inte lätta utrotning 20, och på liknande sätt, appliceras VNS utanför en specifik beteende sammanhang förändrade inte synaptisk plasticitet i IL-BLA-vägen (jfr fig 3C). Å andra sidan, även korta tillämpningar av VNS (t.ex. 0,8 mA som ett tåg av 15 pulser, 100 ps pulsbredd på 30 Hz för 500 msek) orsaka specifika och långvariga förändringar i sensoriska eller motoriska nät när de levereras kontingenten med fortlöpande beteende.
En inflytelserika tidskrift av Michael Kilgard grupp 7 visade att tidsmässigt exakt parning av VNS med presentationen av en enda ton leder till plasticitet i hörselbarken karta över tonfrekvens. Dessa effekter har redan använts kliniskt för att vända patologisk plasticitet i hörselbarken att behandla tinnitus 50. På liknande sättUpprepad hopkoppling av VNS med en motor beteende har visat att omorganisera motor cortex 8 och denna riktade plasticitet är mycket effektiv i återhämtningen av funktion i olika djurmodeller av stroke 9,10.
Men försenade VNS levererade 2 timmar efter rehabiliterande träning eller flerfaldigt större mängder VNS resulterade i jämförelsevis mindre förbättring än exakt tidsinställd VNS 51. Således framtida studier behöver för att optimera både timingen och mängden VNS att maximera terapeutiska fördelar. Våra resultat visar att VNS, som kliniskt godkänt för behandling av multiresistent epilepsi och behandlingsresistent depression, skulle kunna användas som en tilläggsbehandling vid exponering terapi eftersom det modulerar lärande specifika plasticitet för att förstärka effekten av exponering på utrotning av rade rädsla svara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol | |||
| Atropine | Fisher | A0132-5G | |
| Betadine | Henry Schein | 69066950 | |
| Hydrogen peroxide | CVS | 209478 | |
| Ketamine | Henry Schein | 1129300 | |
| Marcaine | Henry Schein | 6312615 | |
| Mineral Oil | CVS | 152355 | |
| Neosporin | CVS | 629451 | |
| Oxygen | Home Depot | 304179 | |
| Pennicillin | Fisher | PENNA-10MU | |
| Propane | Home Depot | 304182 | |
| Xylazine | Henry Schein | 4019308 | |
| Tools | |||
| Jewelery Torch | Smith Equipment | 23-1001D | |
| Sewing Needle | Walgreens | 441831 | |
| #5 Forceps (2) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Soldering Iron | Home Depot | 203525863 | |
| AmScope SM-4TX-144A 3.5X-45X Circuit Board Boom Stereo Microscope + 144 LED | AmScope | SM-4TX-144A | |
| Helping Hands | A-M Systems | 726200 | |
| Scalpel Blade Holder | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Metal File | Home Depot | 6601 | |
| Ruler | Home Deopt | 202035324 | |
| Curved Hemostats | Fine Science Tools | 130009-12 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Spatula | Fine Science Tools | ||
| Small Screwdriver | Home Depot | 646507 | |
| Magnetic Fixator Retraction System | Fine Science Tools | 18200-04, 18200-01, 18200-05 | |
| Heating Pad | Walgreens | 30294 | |
| Clippers | Walgreens | 277966 | |
| Sharpie | Staples | 125328 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Custom Micropipette Glass Tools (J shape and Straight) - Borosilicate glass | Sutter Instrument | B150-110-10 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Cuffs | |||
| Tubing | Braintree Scientific Inc | MRE-065 | |
| Platinum Iridium Wire | Medwire | 10IR9/49T | |
| Gold Pins | Mill-Max | 1001-0-15-15-30-27-04-0 | |
| Suture Thread | Henry Schein | 100-5797 | |
| 22 G needles | Fisher | 14-815-525 | |
| Paper Tape | Fisher | 03-411-602 | |
| Solder | Home Depot | 327793 | |
| Flux | Home Depot | 300142 | |
| Scalpel Blade, 10 or 15 | Stoelting | 52173-10 | |
| Silastic Laboratory Tubing .51 mm ID x .94 mm OD | Fisher | 508-002 | |
| Headcaps | |||
| Connector Pieces (male) | Omnetics Connector Corporation | A25001-004 | |
| Headcap pieces (female) | Omnetics Connector Corporation | A24001-004 | |
| Teets Dental Acrylic, Liquid and Powder | A-M Systems | 525000, 526000 | |
| 26 Gauge Solid Copper Wire | Staples | 1016882 | |
| Surgery | |||
| Bone Screws | Stoelting+CB33:C61 | 51457 | |
| Scalpel Blades, 10 or 15 | Stoelting | 52173-10 | |
| 1 ml syringes | Fisher | 14-826-261 | |
| 22 G Needles | Fisher | 14-815-525 | |
| 27 G Needles | Fisher | 14-826-48 | |
| 2" x 2" Gauze | Fisher | 22-362-178 | |
| Swabs | Fisher | 19-120-472 | |
| Puppy Pads | PetCo | 1310747 | |
| Kim Wipes | Fisher | 06-666-A | |
| Chamber and Behavioral Setting | |||
| Husky Metal Front Base Cabinet (30WX19DX34H) | Home Depot | 100607961 | |
| Quiet Barrier HD Soundproofing Material (Sheet) (PSA) | soundproofcow.com | 10203041 | |
| Convoluted Acoustic Foam Panel | soundproofcow.com | 10432400 | |
| Isolated Pulse Stimulator Model 2100 | A-M Systems | 720000 | |
| Digital Camera - Logitech Webcam C210 | Logitech | B003LVZO88 | |
| MatLab | Mathworks.com | ||
| Sinometer 10 MHz Single Channel Oscilloscope | Sinometer | CQ5010C | |
| OxyLED T-01 DIY Stick-on Anywhere 4-LED Touch Tap Light | OXYLED | B00GD8OKY0 | |
| 5k ohm potentiomter | Alpha Electronics | B00CTWDHIO | |
| Extech 407730 40-to-130-Decibel Digital Sound Level Meter | Extech Instruments | B000EWY67W | |
| DSCK-C Dual Output, scrambled shocker | Kinder Scientific Co |
References
- Quirk, G. J., Mueller, D. Neural mechanisms of extinction learning and retrieval. Neuropsychopharmacol. 33 (1), 56-72 (1038).
- Milad, M. R., Orr, S. P., Lasko, N. B., Chang, Y., Rauch, S. L., Pitman, R. K. Presence and acquired origin of reduced recall for fear extinction in PTSD: results of a twin study. J Psychiat Res. 42 (7), 515-520 (2008).
- Jovanovic, T., Norrholm, S. D., Blanding, N. Q., Davis, M., Duncan, E., Bradley, B., Ressler, K. J. Impaired fear inhibition is a biomarker of PTSD but not depression. Depress Anxiety. 27 (3), 244-251 (2010).
- Norrholm, S. D., et al. Fear extinction in traumatized civilians with posttraumatic stress disorder: relation to symptom severity. Biol Psychiat. 69 (6), 556-563 (2011).
- Phelps, E. A., LeDoux, J. E. Contributions of the amygdala to emotion processing: from animal models to human behavior. Neuron. 48 (2), 175-187 (2005).
- Pape, H. C., Paré, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).
- Engineer, N. D., et al. Reversing pathological neural activity using targeted plasticity. Nature. 470 (7332), 101-104 (2011).
- Porter, B. A., et al. Repeatedly pairing vagus nerve stimulation with a movement reorganizes primary motor cortex. Cereb Cortex. 22 (10), 2365-2374 (2012).
- Hays, S. A., et al. Vagus nerve stimulation during rehabilitative training improves functional recovery after intracerebral hemorrhage. Stroke. 45, 3097-3100 (2014).
- Khodaparast, N., et al. Vagus nerve stimulation delivered during motor rehabilitation improves recovery in a rat model of stroke. Neurorehab Neural Re. 28 (7), 698-706 (2014).
- Clark, K. B., Krahl, S. E., Smith, D. C., Jensen, R. A. Post‐training unilateral vagal stimulation enhances retention performance in the rat. Neurobiol Learn Mem. 63 (3), 213-216 (1995).
- Clark, K. B., Smith, D. C., Hassert, D. L., Browning, R. A., Naritoku, D. K., Jensen, R. A. Posttraining electrical stimulation of vagal afferents with concomitant vagal efferent inactivation enhances memory storage processes in the rat. Neurobiol Learn Mem. 70 (3), 364-373 (1998).
- Clark, K. B., Naritoku, D. K., Smith, D. C., Browning, R. A., Jensen, R. A. Enhanced recognition memory following vagus nerve stimulation in human subjects. Nat. Neurosci. 2, 94-98 (1999).
- McGaugh, J. L. amygdala modulates the consolidation of memories of emotionally arousing experiences. Annu Rev Neurosci. 27, 1-28 (2004).
- McGaugh, J. L., Roozendaal, B. Role of adrenal stress hormones in forming lasting memories in the brain. Curr Opin Neurobiol. 12, 205-210 (2002).
- Miyashita, T., Williams, C. L. Epinephrine administration increases neural impulses propagated along the vagus nerve: Role of peripheral beta-adrenergic receptors. Neurobiol Learn Mem. 85 (2), 116-124 (2006).
- Williams, C. L., Men, D., Clayton, E. C., Gold, P. E. Norephinephrine release in the amygdala after systemic injection of epinephrine or escapable footshock: contribution of the nucleus of the solitary tract. Behavioral Neurosci. 112 (6), 1414-1422 (1998).
- Liang, K. C., Juler, R. G., McGaugh, J. L. Modulating effects of post-training epinephrine on memory: involvement of the amygdala noradrenergic system. Brain Res. 368 (1), 125-133 (1986).
- Peña, D. F., Engineer, N. D., McIntyre, C. K. Rapid remission of conditioned fear expression with extinction training paired with vagus nerve stimulation. Biol Psychiat. 73 (11), 1071-1077 (2013).
- Peña, D. F., Childs, J. E., Willett, S., Vital, A., McIntyre, C. K., Kroener, S. Vagus nerve stimulation enhances extinction of conditioned fear and modulates plasticity in the pathway from the ventromedial prefrontal cortex to the amygdala. Front Behav Neurosci. 8 (327), (2014).
- Maren, S. Overtraining does not mitigate contextual fear conditioning deficits produced by neurotoxic lesions of the basolateral amygdala. J Neurosci. 18 (8), 3088-3097 (1998).
- Blanchard, R. J., Blanchard, D. C. Crouching as an index of fear. J Comp Physiol Psych. 67 (3), 370-375 (1969).
- Maroun, M. Stress reverses plasticity in the pathway projecting from the ventromedial prefrontal cortex to the basolateral amygdala. Eur J Neurosci. 24 (10), 2917-2922 (2006).
- Moussawi, K., et al.
- Paintal, A. S. Vagal sensory receptors and their reflex effects. Physiol. Rev. 53 (1), 159-227 (1973).
- Aalbers, M., Vles, J., Klinkenberg, S., Hoogland, G., Majoie, M., Rijkers, K. Animal models for vagus nerve stimulation in epilepsy. Exp Neurol. 230 (2), 167-175 (2011).
- Ricardo, J. A., Koh, E. T. Anatomical evidence of direct projections from the nucleus of the solitary tract to the hypothalamus, amygdala, and other forebrain structures in the rat. Brain Res. 153, 1-26 (1978).
- Takigawa, M., Mogenson, G. J. A study of inputs to antidromically identified neurons of the locus coeruleus. Brain Res. 135 (2), 217-230 (1977).
- Groves, D. A., Bowman, E. M., Brown, V. J. Recordings from the rat locus coeruleus during acute vagal nerve stimulation in the anaesthetised rat. Neurosci Lett. 379 (3), 174-179 (2005).
- Manta, S., Dong, J., Debonnel, G., Blier, P. Enhancement of the function of rat serotonin and norepinephrine neurons by sustained vagus nerve stimulation. J Psychiatr Neurosci. 34 (4), 272-280 (2009).
- Manta, S., El Mansari, M., Debonnel, G., Blier, P. Electrophysiological and neurochemical effects of long-term vagus nerve stimulation on the rat monoaminergic systems. Int J Neuropsychoph. 16 (2), 459-470 (2013).
- Dorr, A. E., Debonnel, G. Effect of vagus nerve stimulation on serotonergic and noradrenergic transmission. J Pharmacol Exp Ther. 318, 890-898 (2006).
- Follesa, P., et al. Vagus nerve stimulation increases norepinephrine concentration and the gene expression of BDNF and bFGF in the rat brain. Brain Res. 1179 (7), 28-34 (2007).
- Biggio, F., et al. Chronic vagus nerve stimulation induces neuronal plasticity in the rat hippocampus. Int J Neuropsychoph. 12 (9), 1209-1221 (1017).
- Nichols, J. A., Nichols, A. R., Smirnakis, S. M., Engineer, N. D., Kilgard, M. P., Atzori, M. Vagus nerve stimulation modulates cortical synchrony and excitability through the activation of muscarinic receptors. Neuroscience. 189, 207-214 (2011).
- Peters, J., Kalivas, P. W., Quirk, G. J. Extinction circuits for fear and addiction overlap in prefrontal cortex. Learn Memory. 16, 279-288 (2009).
- Ji, J., Maren, S. Hippocampal involvement in contextual modulation of fear extinction. Hippocampus. 17 (9), 749-758 (2007).
- Roosevelt, R. W., Smith, D. C., Clough, R. W., Jensen, R. A., Browning, R. A. Increased extracellular concentrations of norepinephrine in cortex and hippocampus following vagus nerve stimulation in the rat. Brain Res. 1119 (1), 124-132 (2006).
- Hassert, D. L., Miyashita, T., Williams, C. L. The effects of peripheral vagal nerve stimulation at a memory-modulating intensity on norepinephrine output in the basolateral amygdala. Behav Neurosci. 118 (1), 79-88 (2004).
- Ura, H., et al. Vagus nerve stimulation induced long-lasting enhancement of synaptic transmission and decreased granule cell discharge in the hippocampal dentate gyrus of urethane-anesthetized rats. Brain Res. 1492, 63-71 (2013).
- Zuo, Y., Smith, D. C., Jensen, R. A. Vagus nerve stimulation potentiates hippocampal LTP in freely-moving rats. Physiol Behav. 90 (4), 583-589 (2007).
- Shen, H., Fuchino, Y., Miyamoto, D., Nomura, H., Matsuki, N. Vagus nerve stimulation enhances perforant path-CA3 synaptic transmission via the activation of β-adrenergic receptors and the locus coeruleus. Int J Neuropsychophl. 15 (4), 523-530 (2012).
- Fibiger, H. C., Mason, S. T. The effects of dorsal bundle injections of 6-hydroxydopamine on avoidance responding in rats. Bitr J Pharmacol. 64 (4), 601-605 (1978).
- Mason, S. T. Fibiger H.C. 6-OHDA lesion of the dorsal noradrenergic bundle alters extinction of passive avoidance. Brain Res. 152, 209-214 (1978).
- McGaugh, J. L. Memory consolidation and the amygdala: a systems perspective. Trends Neurosci. 25 (9), 456-461 (2002).
- LaLumiere, R. T., Niehoff, K. E., Kalivas, P. W. The infralimbic cortex regulates the consolidation of extinction after cocaine self-administration. Learn Memory. 17, 168-175 (2010).
- Mueller, D., Cahill, S. P. Noradrenergic modulation of extinction learning and exposure therapy. Behav Brain Res. 208 (1), 1-11 (2010).
- Smith, R. J., Aston-Jones, G. α(2) Adrenergic and imidazoline receptor agonists prevent cue-induced cocaine seeking. Biol Psychiat. 70 (8), 712-719 (2011).
- Buffalari, D. M., Baldwin, C. K., See, R. E. Treatment of cocaine withdrawal anxiety with guanfacine: relationships to cocaine intake and reinstatement of cocaine seeking in rats. Psychopharmacol. (Berl). 223 (2), 179-190 (2012).
- De Ridder, D., Vanneste, S., Engineer, N. D., Kilgard, M. P. Safety and efficacy of vagus nerve stimulation paired with tones for the treatment of tinnitus: a case series). Neuromodulation. 17 (2), 170-179 (2014).
- Hays, S. A., et al. The timing and amount of vagus nerve stimulation during rehabilitative training affect poststroke recovery of forelimb strength. Neuroreport. 25, 676-682 (2014).
