L'utilizzo di biosensori enzimatica per quantificare endogena ATP o H<sub> 2</sub> O<sub> 2</sub> Nel rene
Summary
Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney.
Abstract
Biosensori microelettrodi enzimatici sono stati ampiamente utilizzati per misurare il segnale extracellulare in tempo reale. La maggior parte del loro uso è stato limitato a fettine di cervello e colture cellulari neuronali. Recentemente, questa tecnologia è stata applicata a tutto organi. I progressi nella progettazione dei sensori hanno reso possibile la misurazione di segnalazione delle cellule nel sangue-perfuso nei reni vivo. Elencare i presenti protocolli i passi necessari per misurare ATP e H 2 O 2 segnalazione nell'interstizio rene di ratto. Due disegni sensore separato sono utilizzati per la ex vivo e in vivo protocolli. Entrambi i tipi di sensori sono rivestiti con un biolayer enzimatico sottile sopra di uno strato permselettività dare rapida risposta, biosensori sensibili e selettivi. Lo strato permselettività protegge il segnale dagli interferenti in tessuto biologico, e lo strato enzimatica utilizza la reazione catalitica sequenziale di glicerolo chinasi e glicerolo-3-phosphate ossidasi in presenza di ATP per produrre H 2 O 2. La serie di sensori utilizzati per gli studi ex vivo ulteriormente rilevato analita mediante ossidazione di H 2 O 2 in un platino / iridio (Pt-Ir) elettrodo a filo. I sensori per gli studi in vivo sono invece basati sulla riduzione di H 2 O 2 in un mediatore rivestito elettrodo d'oro progettata per il tessuto sangue perfuso. Modifiche concentrazione finale vengono rilevati da amperometria tempo reale seguito da taratura a concentrazioni note di analita. Inoltre, la specificità del segnale amperometrico può essere confermato con l'aggiunta di enzimi quali catalasi e apyrase che rompono H 2 O 2 e ATP corrispondentemente. Questi sensori anche dipendono fortemente calibrazioni accurate prima e dopo ogni esperimento. I due protocolli seguenti stabiliscono lo studio di rilevamento in tempo reale di ATP e H 2O 2 in tessuti renali, e può essere ulteriormente modificato per estendere il metodo descritto per l'uso in altre preparazioni biologiche o organi interi.
Introduction
Biosensori microelettrodi enzimatico (anche riferimento come sensori nel presente manoscritto) sono stati uno strumento prezioso per lo studio dei processi di segnalazione dinamici nelle cellule e nei tessuti viventi. I sensori offrono una maggiore risoluzione temporale e spaziale delle molecole di segnalazione cellulare in concentrazioni biologicamente rilevanti. Invece di campionamento e analizzare fluidi extracellulari effettuate ad intervalli più lunghi periodi di tempo, questi sensori rispondono più velocemente loro enzimi reagiscono all'analita, producendo misurazioni in tempo reale 1,2. Rilevamento rapido delle concentrazioni interstiziali dei fattori autocrini e paracrini, come purine o perossido di idrogeno, e le dinamiche del loro rilascio può essere utilizzato per stabilire un profilo per gli effetti dei farmaci in condizioni normali e patologiche 3. Attualmente, la maggior parte delle applicazioni che utilizzano sensori sono stati in fettine di tessuto cerebrale e colture cellulari 4-10. I protocolli descritti in questo scopo manoscrittostabilire i mezzi per misurare con precisione le concentrazioni in tempo reale di analiti nei reni interi.
I seguenti protocolli sono stati sviluppati per studiare ATP interstiziale e H 2 O 2 segnalazione nei reni. In ambiente nativo del rene, l'ATP extracellulare viene rapidamente catabolizzata da ectonucleotidases endogeni nei suoi derivati (ADP, AMP e adenosina). I sensori utilizzati sono altamente selettivi in ATP su altri purine o ATP prodotti di degradazione 11. Questo offre un grande vantaggio in quanto permette il monitoraggio accurato delle concentrazioni costanti e dinamiche di rilascio di ATP e la sua funzione di segnalazione. Concentrazione di ATP interstiziale viene misurata utilizzando la combinazione di due microelettrodi, un sensore di ATP e un sensore Null. Il sensore Null in combinazione con applicazioni catalasi è in grado di rilevare interstiziale H 2 O 2 12 concentrazioni. I seguenti protocolli utilizzano due diversi disegni di sensors che presentano caratteristiche ottimali sia per ex vivo o in vivo. in applicazioni
Entrambi i modelli sono basati sulla reazione catalitica sequenziale di glicerolo chinasi e glicerolo-3-fosfato ossidasi contenuta in uno strato sensore enzimatica ed è guidata dalla presenza di ATP. Nella serie di sensori utilizzati negli studi ex vivo, H 2 O 2, il prodotto finale di reazione enzimatica, viene rilevato mediante ossidazione su un platino / iridio (Pt-Ir) elettrodo a filo. Sensori per studi in vivo sono invece basati sulla riduzione H 2 O 2 in un mediatore rivestito elettrodo d'oro progettata per il tessuto sangue perfuso. In figura 1 è uno schema di entrambi i protocolli descritti in questo manoscritto. Il sensore Null è identico al suo sensore ATP corrispondente tranne che manca degli enzimi legati. Pertanto, in aggiunta al rilevamento di H 2 O 2 con l'enzima catalasi, il sensore mea NullSures interferenze aspecifiche. Concentrazioni di ATP sono calcolati sottraendo il Null rilevato interferenze aspecifiche e sfondo H 2 O 2 dal segnale sensore ATP. Diversi sensori sono anche disponibili in commercio per individuare altri analiti tra cui l'adenosina, ionosine, ipoxantina, acetilcolina, colina, glutammato, glucosio, lattato, d-serina per applicazioni ex vivo o adenosina, ionosine, e ipoxantina in vivo se abbinato con la corrispondente Null sensore.
La capacità del sensore di rilevare esattamente analiti dipende il corretto pre e post-13 calibrazioni. Questo assicura che l'analisi rappresenta la deriva della sensibilità del sensore che si verifica durante l'uso in tessuti biologici. Il sensore contiene un deposito di glicerolo che viene utilizzato come reagente nelle reazioni enzimatiche sensore. Se il sensore non è usato in soluzioni contenenti glicerolo bagno, laverà nel tempo. Shorter rvolte ecording sono poi necessarie per minimizzare la deriva del sensore. Inoltre sensore incrostazione da proteasi endogene e frammenti di proteine può notevolmente diminuire la sensibilità dei sensori 14.
Il presente manoscritto stabilisce l'uso di biosensori microelettrodo enzimatiche per ex vivo e in vivo preparazioni renali. Real-time analita quantificazione fornisce dettagli senza precedenti di segnalazione cellulare che possono rivelare nuove informazioni sui meccanismi delle malattie renali e agenti farmacologici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli attuali protocolli sono stati sviluppati per fornire una maggiore risoluzione temporale e spaziale di ATP e H 2 O 2 di segnalazione per ex vivo isolati, perfusione e in vivo reni sangue-perfusione. Le differenze tra i protocolli ei sensori utilizzati qui garantiscono l'acquisizione dei dati ottimale sia per gli agenti farmacologici o studi fisiologici. I protocolli sono costituiti da 1) calibrazione del sensore, 2) intervento chirurgico, 3) l'installazione di acquisizi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Apprezziamo Sarissa biomedica per il loro lavoro nello sviluppo dei sensori utilizzati nel presente manoscritto. Questa ricerca è stata sostenuta dal National Heart, Lung, and Blood Institute concede HL108880 (A. Staruschenko), HL 116264 (A. Cowley) e HL 122.662 (A. Staruschenko e A. Cowley), un progetto finanziato dal Medical College of commissione per gli affari di ricerca Wisconsin # 9306830 (O. Palygin) e avanzando un sano Wisconsin Programma di Ricerca e Formazione # 9.520.217, e il giovane Investigator Grant del National Kidney Foundation (O. Palygin).
Materials
| Sensor Kit | Sarissa Biomedical | SBK-ATP-05-125 | The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes. Also included with the kit is the user's choice of sensors. |
| Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-ATP-05-125 | store at 2-8 C before use |
| Sarissagold ATP Biosensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-ATP-10-50 | store at 2-8 C before use |
| Sarissaprobe null sensor 125μm | Sarissa Biomedical | SBS-NUL-20-125 | store at 2-8 C before use |
| Sarissagold null sensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-NUL-10-50 | store at 2-8 C before use |
| Sarissaprobe ATP Manual | Sarissa Biomedical | http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf | |
| Faraday cage | TMC | ||
| Dual channel potentiostat | Digi-Ivy | DY2021 | Type II Faraday cage |
| Data acquisition program | Digi-Ivy | DY2000 | |
| Perfusion pump | Razel Scientific Instruments | Model R99E | |
| Fiber optic illuminator | Schott | ACE 1 | |
| micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-8 | |
| air table | TMC | 63-500 | |
| isoflurane ventilator | LEI Medical | M2000 | |
| 3 ml petri dish | Fisher Scientific | S3358OA | |
| needle | Santa Cruz | 26-30 gauge | |
| pins | Standard dissection pins | ||
| catheter | Polyethylene tubing (PE50) | ||
| catheter tissue glue | Vetbond | 1469SB | |
| suture | Look | SP117 | |
| rubber bands | any 2-4 mm wide rubber bands | ||
| silicone | Momentive | RTV-615 Clear 1# | |
| clamp | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| standard dissection kit | Kit should include scalpel and dissection sissors | ||
| Kidney Cup | Of own design | ||
| standard chemicals | Sigma-Aldrich | ||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | 100 mM ATP solution |
| hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A7646 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| isoflurane | Clipper | 10250 | |
| inactin | Sigma-Aldrich | T133 | |
| ketamine | Clipper | 2010012 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 |
References
- Palygin, O., Staruschenko, A. Detection of endogenous substances with enzymatic microelectrode biosensors in the kidney. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 305, 89-91 (2013).
- Clark, L. C., Lyons, C. Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery. Ann N Y Acad Sci. 102, 29-45 (1962).
- Haruyama, T. Micro- and nanobiotechnology for biosensing cellular responses. Adv Drug Deliv Rev. 55, 393-401 (2003).
- Huckstepp, R. T., et al. Connexin hemichannel-mediated CO2-dependent release of ATP in the medulla oblongata contributes to central respiratory chemosensitivity. J Physiol. 588, 3901-3920 (2010).
- Lopatar, J., Dale, N., Frenguelli, B. G. Minor contribution of ATP P2 receptors to electrically-evoked electrographic seizure activity in hippocampal slices: Evidence from purine biosensors and P2 receptor agonists and antagonists. Neuropharmacology. 61, 25-34 (2011).
- Avshalumov, M. V., Chen, B. T., Marshall, S. P., Pena, D. M., Rice, M. E. Glutamate-dependent inhibition of dopamine release in striatum is mediated by a new diffusible messenger, H2O2. J Neurosci. 23, 2744-2750 (2003).
- Frenguelli, B. G., Wigmore, G., Llaudet, E., Dale, N. Temporal and mechanistic dissociation of ATP and adenosine release during ischaemia in the mammalian hippocampus. J. Neurochem. 101, 1400-1413 (2007).
- Lalo, U., et al. Exocytosis of ATP from astrocytes modulates phasic and tonic inhibition in the neocortex. PLoS Biol. 12, e1001747 (2014).
- Heinrich, A., Ando, R. D., Turi, G., Rozsa, B., Sperlagh, B. K+ depolarization evokes ATP, adenosine and glutamate release from glia in rat hippocampus: a microelectrode biosensor study. Br.J Pharmacol. 167, 1003-1020 (2012).
- Dale, N. Purinergic signaling in hypothalamic tanycytes: potential roles in chemosensing. Semin Cell Dev Biol. 22, 237-244 (2011).
- Gourine, A. V., Llaudet, E., Dale, N., Spyer, K. M. Release of ATP in the ventral medulla during hypoxia in rats: role in hypoxic ventilatory response. J Neurosci. 25, 1211-1218 (2005).
- Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H2O2 release in freshly isolated kidneys. Am J Physiol Renal Physiol. , (2013).
- Thome-Duret, V., Gangnerau, M. N., Zhang, Y., Wilson, G. S., Reach, G. Modification of the sensitivity of glucose sensor implanted into subcutaneous tissue. Diabetes Metab. 22, 174-178 (1996).
- Wilson, G. S., Gifford, R. Biosensors for real-time in vivo measurements. Biosens. Bioelectron. 20, 2388-2403 (2005).
- Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-Channel Analysis of TRPC Channels in the Podocytes of Freshly Isolated Glomeruli. Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).
- Stockand, J. D., Vallon, V., Ortiz, P. In vivo and ex vivo analysis of tubule function. Compr Physiol. 2, 2495-2525 (2012).
- Turner, A. P. Biosensors: Fundamentals and applications – Historic book now open access. Biosens. Bioelectron. 65C, A1 (2014).
- Kauffmann, J. M., Guilbault, G. G. Enzyme electrode biosensors: theory and applications. Methods Biochem Anal. 36, 63-113 (1992).
- Barlett, P. N., Cooper, J. M. A review of the immobilization of enzymes in electropolymerized films. J Electroanal Chem. 362, 1-12 (1993).
- Kano, K., Morikage, K., Uno, B., Esaka, Y., Goto, M. Enzyme microelectrodes for choline and acetylcholine and their applications. Anal Chim Acta. 299, 69-74 (1994).
- Llaudet, E., Hatz, S., Droniou, M., Dale, N. Microelectrode biosensor for real-time measurement of ATP in biological tissue. Anal Chem. 77, 3267-3273 (2005).
- Llaudet, E., Botting, N. P., Crayston, J. A., Dale, N. A three-enzyme microelectrode sensor for detecting purine release from central nervous system. Biosens Bioelectron. 18, 43-52 (2003).
- Cosnier, S., Lepellec, A., Guidetti, B., Isabelle, R. -. L. Enhancement of biosensor sensitivity in aqueous and organic solvents using a combination of poly(pyrrole-ammonium) and poly(pyrrole-lactobionamide) films as host matrices. J Electroanal Chem. 449, 165-171 (1998).
- Gourine, A. V., et al. Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science. 329, 571-575 (2010).
- Kluess, H. A., Stone, A. J., Evanson, K. W. ATP overflow in skeletal muscle 1A arterioles. J. Physiol. 588, 3089-3100 (2010).
- Nishiyama, A., Jackson, K. E., Majid, D. S., Rahman, M., Navar, L. G. Renal interstitial fluid ATP responses to arterial pressure and tubuloglomerular feedback activation during calcium channel blockade. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, H772-H777 (2006).
- Jin, C., et al. Effects of renal perfusion pressure on renal medullary hydrogen peroxide and nitric oxide production. Hypertension. 53, 1048-1053 (2009).
- Khan, A. S., Michael, A. C. Invasive consequences of using micro-electrodes and microdialysis probes in the brain. Trends Anal. Chem. 22, 503-508 (2003).
