Summary

L'utilizzo di biosensori enzimatica per quantificare endogena ATP o H<sub> 2</sub> O<sub> 2</sub> Nel rene

Published: October 12, 2015
doi:

Summary

Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney.

Abstract

Biosensori microelettrodi enzimatici sono stati ampiamente utilizzati per misurare il segnale extracellulare in tempo reale. La maggior parte del loro uso è stato limitato a fettine di cervello e colture cellulari neuronali. Recentemente, questa tecnologia è stata applicata a tutto organi. I progressi nella progettazione dei sensori hanno reso possibile la misurazione di segnalazione delle cellule nel sangue-perfuso nei reni vivo. Elencare i presenti protocolli i passi necessari per misurare ATP e H 2 O 2 segnalazione nell'interstizio rene di ratto. Due disegni sensore separato sono utilizzati per la ex vivo e in vivo protocolli. Entrambi i tipi di sensori sono rivestiti con un biolayer enzimatico sottile sopra di uno strato permselettività dare rapida risposta, biosensori sensibili e selettivi. Lo strato permselettività protegge il segnale dagli interferenti in tessuto biologico, e lo strato enzimatica utilizza la reazione catalitica sequenziale di glicerolo chinasi e glicerolo-3-phosphate ossidasi in presenza di ATP per produrre H 2 O 2. La serie di sensori utilizzati per gli studi ex vivo ulteriormente rilevato analita mediante ossidazione di H 2 O 2 in un platino / iridio (Pt-Ir) elettrodo a filo. I sensori per gli studi in vivo sono invece basati sulla riduzione di H 2 O 2 in un mediatore rivestito elettrodo d'oro progettata per il tessuto sangue perfuso. Modifiche concentrazione finale vengono rilevati da amperometria tempo reale seguito da taratura a concentrazioni note di analita. Inoltre, la specificità del segnale amperometrico può essere confermato con l'aggiunta di enzimi quali catalasi e apyrase che rompono H 2 O 2 e ATP corrispondentemente. Questi sensori anche dipendono fortemente calibrazioni accurate prima e dopo ogni esperimento. I due protocolli seguenti stabiliscono lo studio di rilevamento in tempo reale di ATP e H 2O 2 in tessuti renali, e può essere ulteriormente modificato per estendere il metodo descritto per l'uso in altre preparazioni biologiche o organi interi.

Introduction

Biosensori microelettrodi enzimatico (anche riferimento come sensori nel presente manoscritto) sono stati uno strumento prezioso per lo studio dei processi di segnalazione dinamici nelle cellule e nei tessuti viventi. I sensori offrono una maggiore risoluzione temporale e spaziale delle molecole di segnalazione cellulare in concentrazioni biologicamente rilevanti. Invece di campionamento e analizzare fluidi extracellulari effettuate ad intervalli più lunghi periodi di tempo, questi sensori rispondono più velocemente loro enzimi reagiscono all'analita, producendo misurazioni in tempo reale 1,2. Rilevamento rapido delle concentrazioni interstiziali dei fattori autocrini e paracrini, come purine o perossido di idrogeno, e le dinamiche del loro rilascio può essere utilizzato per stabilire un profilo per gli effetti dei farmaci in condizioni normali e patologiche 3. Attualmente, la maggior parte delle applicazioni che utilizzano sensori sono stati in fettine di tessuto cerebrale e colture cellulari 4-10. I protocolli descritti in questo scopo manoscrittostabilire i mezzi per misurare con precisione le concentrazioni in tempo reale di analiti nei reni interi.

I seguenti protocolli sono stati sviluppati per studiare ATP interstiziale e H 2 O 2 segnalazione nei reni. In ambiente nativo del rene, l'ATP extracellulare viene rapidamente catabolizzata da ectonucleotidases endogeni nei suoi derivati ​​(ADP, AMP e adenosina). I sensori utilizzati sono altamente selettivi in ATP su altri purine o ATP prodotti di degradazione 11. Questo offre un grande vantaggio in quanto permette il monitoraggio accurato delle concentrazioni costanti e dinamiche di rilascio di ATP e la sua funzione di segnalazione. Concentrazione di ATP interstiziale viene misurata utilizzando la combinazione di due microelettrodi, un sensore di ATP e un sensore Null. Il sensore Null in combinazione con applicazioni catalasi è in grado di rilevare interstiziale H 2 O 2 12 concentrazioni. I seguenti protocolli utilizzano due diversi disegni di sensors che presentano caratteristiche ottimali sia per ex vivo o in vivo. in applicazioni

Entrambi i modelli sono basati sulla reazione catalitica sequenziale di glicerolo chinasi e glicerolo-3-fosfato ossidasi contenuta in uno strato sensore enzimatica ed è guidata dalla presenza di ATP. Nella serie di sensori utilizzati negli studi ex vivo, H 2 O 2, il prodotto finale di reazione enzimatica, viene rilevato mediante ossidazione su un platino / iridio (Pt-Ir) elettrodo a filo. Sensori per studi in vivo sono invece basati sulla riduzione H 2 O 2 in un mediatore rivestito elettrodo d'oro progettata per il tessuto sangue perfuso. In figura 1 è uno schema di entrambi i protocolli descritti in questo manoscritto. Il sensore Null è identico al suo sensore ATP corrispondente tranne che manca degli enzimi legati. Pertanto, in aggiunta al rilevamento di H 2 O 2 con l'enzima catalasi, il sensore mea NullSures interferenze aspecifiche. Concentrazioni di ATP sono calcolati sottraendo il Null rilevato interferenze aspecifiche e sfondo H 2 O 2 dal segnale sensore ATP. Diversi sensori sono anche disponibili in commercio per individuare altri analiti tra cui l'adenosina, ionosine, ipoxantina, acetilcolina, colina, glutammato, glucosio, lattato, d-serina per applicazioni ex vivo o adenosina, ionosine, e ipoxantina in vivo se abbinato con la corrispondente Null sensore.

La capacità del sensore di rilevare esattamente analiti dipende il corretto pre e post-13 calibrazioni. Questo assicura che l'analisi rappresenta la deriva della sensibilità del sensore che si verifica durante l'uso in tessuti biologici. Il sensore contiene un deposito di glicerolo che viene utilizzato come reagente nelle reazioni enzimatiche sensore. Se il sensore non è usato in soluzioni contenenti glicerolo bagno, laverà nel tempo. Shorter rvolte ecording sono poi necessarie per minimizzare la deriva del sensore. Inoltre sensore incrostazione da proteasi endogene e frammenti di proteine ​​può notevolmente diminuire la sensibilità dei sensori 14.

Il presente manoscritto stabilisce l'uso di biosensori microelettrodo enzimatiche per ex vivo e in vivo preparazioni renali. Real-time analita quantificazione fornisce dettagli senza precedenti di segnalazione cellulare che possono rivelare nuove informazioni sui meccanismi delle malattie renali e agenti farmacologici.

Protocol

Le seguenti procedure sugli animali aderito alla guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio. L'approvazione preventiva è stato ottenuto dalla cura e l'uso Comitato istituzionale animali (IACUC). NOTA: Revisione delle istruzioni del produttore del sensore dovrebbe essere fatto durante la progettazione dell'esperimento e prima del loro utilizzo. Seguendo queste istruzioni produrrà risultati ottimali quando si utilizzano i sensori. 1. Calibrazione sensore </p…

Representative Results

Il disegno del microelettrodo biosensore enzimatico consente il rilevamento in tempo reale di analiti nei reni interi. Il disegno esperimento generale sia ex vivo o in vivo è illustrato in Figura 1 .I sensori utilizzati e le procedure chirurgiche variano a seconda se lo studio è ex vivo o in vivo. Per ottenere risultati riproducibili, pre accurate calibrazioni e post sono critici. Figura 6A mostra una traccia rappresenta…

Discussion

Gli attuali protocolli sono stati sviluppati per fornire una maggiore risoluzione temporale e spaziale di ATP e H 2 O 2 di segnalazione per ex vivo isolati, perfusione e in vivo reni sangue-perfusione. Le differenze tra i protocolli ei sensori utilizzati qui garantiscono l'acquisizione dei dati ottimale sia per gli agenti farmacologici o studi fisiologici. I protocolli sono costituiti da 1) calibrazione del sensore, 2) intervento chirurgico, 3) l'installazione di acquisizi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Apprezziamo Sarissa biomedica per il loro lavoro nello sviluppo dei sensori utilizzati nel presente manoscritto. Questa ricerca è stata sostenuta dal National Heart, Lung, and Blood Institute concede HL108880 (A. Staruschenko), HL 116264 (A. Cowley) e HL 122.662 (A. Staruschenko e A. Cowley), un progetto finanziato dal Medical College of commissione per gli affari di ricerca Wisconsin # 9306830 (O. Palygin) e avanzando un sano Wisconsin Programma di Ricerca e Formazione # 9.520.217, e il giovane Investigator Grant del National Kidney Foundation (O. Palygin).

Materials

Sensor Kit Sarissa Biomedical SBK-ATP-05-125 The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes.  Also included with the kit is the user's choice of sensors.
Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μm Sarissa Biomedical SBS-ATP-05-125 store at 2-8 C before use
Sarissagold ATP Biosensor 50 μm Sarissa Biomedical SGS-ATP-10-50 store at 2-8 C before use
Sarissaprobe null sensor 125μm Sarissa Biomedical SBS-NUL-20-125 store at 2-8 C before use
Sarissagold null sensor 50 μm Sarissa Biomedical SGS-NUL-10-50 store at 2-8 C before use
Sarissaprobe ATP Manual Sarissa Biomedical http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf
Faraday cage  TMC
Dual channel potentiostat Digi-Ivy DY2021 Type II Faraday cage
Data acquisition program Digi-Ivy DY2000
Perfusion pump Razel Scientific Instruments Model R99E
Fiber optic illuminator Schott ACE 1
micromanipulator Narishige MM-3
micromanipulator magnetic stand Narishige GJ-8
air table TMC 63-500
isoflurane ventilator LEI Medical M2000
3 ml petri dish Fisher Scientific S3358OA
needle Santa Cruz 26-30 gauge
pins Standard dissection pins
catheter Polyethylene tubing (PE50)
catheter tissue glue Vetbond 1469SB
suture Look SP117
rubber bands any 2-4 mm wide rubber bands
silicone Momentive RTV-615 Clear 1#
clamp Fine Science Tools 18052-03
standard dissection kit Kit should include scalpel and dissection sissors 
Kidney Cup Of own design
standard chemicals Sigma-Aldrich
ATP Sigma-Aldrich A6559-25UMO 100 mM ATP solution
hydrogen peroxide Sigma-Aldrich 216763
glycerol Sigma-Aldrich G9012
Apyrase Sigma-Aldrich A7646
Catalase Sigma-Aldrich C40
isoflurane Clipper 10250
inactin Sigma-Aldrich T133
ketamine Clipper 2010012
Hanks Balanced Salt Solution  Gibco 14025092

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Palygin, O., Levchenko, V., Evans, L. C., Blass, G., Cowley Jr., A. W., Staruschenko, A. Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney. J. Vis. Exp. (104), e53059, doi:10.3791/53059 (2015).

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