El uso de biosensores para cuantificar enzimática endógena ATP o H<sub> 2</sub> O<sub> 2</sub> En el riñón
Summary
Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney.
Abstract
Biosensores enzimáticos de microelectrodos han sido ampliamente utilizados para medir la señalización extracelular en tiempo real. La mayor parte de su uso se ha limitado a secciones de cerebro y cultivos de células neuronales. Recientemente, esta tecnología se ha aplicado a los órganos enteros. Los avances en el diseño del sensor han hecho posible la medición de la señalización celular en vivo en los riñones perfundidos con sangre. Los actuales protocolos enumeran los pasos necesarios para medir el ATP y H 2 O 2 de señalización en el intersticio de riñón de rata. Dos diseños de sensores separados se utilizan para la ex vivo y en los protocolos in vivo. Ambos tipos de sensor se recubren con una capa biológica enzimática delgada en la parte superior de una capa de permeabilidad selectiva para dar respondieron rápido, biosensores sensibles y selectivos. La capa permselectividad protege la señal de los interferentes en el tejido biológico, y la capa enzimática utiliza la reacción catalítica secuencial de glicerol quinasa y glicerol-3-phosfosfato oxidasa en presencia de ATP para producir H 2 O 2. El conjunto de sensores utilizados para los estudios ex vivo detecta más analito mediante la oxidación de H 2 O 2 en un platino / iridio (Pt-Ir) electrodo de alambre. Los sensores para los estudios in vivo se basan en su lugar la reducción de H 2 O 2 en un electrodo de oro mediador recubierta diseñada para el tejido perfundido con sangre. Cambios concentración final son detectados por amperometría en tiempo real seguido de calibración para concentraciones conocidas de analito. Además, la especificidad de la señal amperométrica se puede confirmar mediante la adición de enzimas como la catalasa y la apirasa que descomponen H 2 O 2 y ATP correspondientemente. Estos sensores también se basan en gran medida en las calibraciones precisas antes y después de cada experimento. Los dos protocolos siguientes establecen el estudio de la detección en tiempo real de ATP y H 2O 2 en los tejidos renales, y puede ser modificado adicionalmente para extender el método descrito para su uso en otras preparaciones biológicas u órganos enteros.
Introduction
Biosensores microelectrodos enzimática (También denominada sensores en el presente manuscrito) han sido una herramienta valiosa para el estudio de procesos de señalización dinámica en las células y tejidos vivos. Los sensores proporcionan una mayor resolución temporal y espacial de las moléculas de señalización celular en concentraciones biológicamente relevantes. En lugar de toma de muestras y el análisis de los fluidos extracelulares tomadas a intervalos durante largos períodos de tiempo, estos sensores responden tan rápido como sus enzimas reaccionan con el analito, produciendo de ese modo mediciones en tiempo real 1,2. Detección rápida de las concentraciones intersticiales de factores autocrinos y paracrinos, como purinas o el peróxido de hidrógeno, y la dinámica de su liberación se puede utilizar para establecer un perfil de los efectos de las drogas en condiciones normales y patológicas 3. En la actualidad, la mayoría de las aplicaciones que utilizan sensores de haber estado en cortes de tejido del cerebro y cultivos celulares 4-10. Los protocolos detallados en este objetivo manuscrito aestablecer los medios para medir con precisión las concentraciones en tiempo real de analitos en los riñones enteros.
Los siguientes protocolos se desarrollaron para estudiar ATP intersticial y H 2 O 2 de señalización en los riñones. En el entorno natural de los riñones, el ATP extracelular se cataboliza rápidamente por ectonucleotidasas endógenos en sus derivados (ADP, AMP y adenosina). Los sensores utilizados aquí son muy selectivos a la ATP sobre otras purinas o productos de degradación de ATP 11. Esto ofrece una gran ventaja, ya que permite la monitorización precisa de las concentraciones constantes y dinámicos de la liberación de ATP y su función de señalización. La concentración de ATP intersticial se mide usando la combinación de dos microelectrodos, un sensor de ATP y un sensor de Null. El sensor de Null en combinación con aplicaciones de catalasa es capaz de detectar intersticial H 2 O 2 concentraciones 12. Los siguientes protocolos utilizan dos diseños diferentes de sensors que tienen características óptimas para ya sea ex vivo o in vivo. aplicaciones
Ambos diseños se basan en la reacción catalítica secuencial de glicerol quinasa y glicerol oxidasa-3-fosfato contenida en una capa enzimática del sensor y está impulsado por la presencia de ATP. En el conjunto de sensores utilizados en los estudios ex vivo, H 2 O 2, el producto final de reacción enzimática, se detecta por oxidación en un platino / iridio (Pt-Ir) electrodo de alambre. Sensores para estudios in vivo en cambio se basan en H 2 O 2 reducción en un electrodo de oro mediador recubierto diseñado para el tejido perfundido con sangre. Se muestra en la Figura 1 es un esquema de ambos protocolos descritos en este manuscrito. El sensor Null es idéntica a su sensor de ATP correspondiente, excepto que carece de las enzimas unidas. Por lo tanto, además de la detección de H 2 O 2 con la enzima catalasa, la mea sensor NullSures interferencias no específicas. Concentraciones de ATP se calculan restando el Null detecta interferencias no específicas y fondo H 2 O 2 de la señal del sensor de ATP. Varios sensores también están disponibles comercialmente para detectar otros analitos incluyendo adenosina, ionosine, hipoxantina, la acetilcolina, colina, glutamato, glucosa, lactato, D-serina para aplicaciones ex vivo o adenosina, ionosine, e hipoxantina para in vivo cuando se combina con el Null correspondiente sensor.
La capacidad del sensor para detectar con precisión analitos depende de la pre adecuada y calibraciones posteriores 13. Esto asegura que el análisis representa la deriva en la sensibilidad del sensor que se produce durante el uso en los tejidos biológicos. El sensor tiene un depósito de glicerol que se utiliza como reactivo en las reacciones enzimáticas del sensor. Si el sensor no se utiliza en soluciones de baño que contiene glicerol, que se lave con el tiempo. Shorter rtiempos ecording son entonces necesarias para minimizar la deriva del sensor. Además del sensor de ensuciamiento por proteasas endógenas y los fragmentos de proteínas puede disminuir en gran medida la sensibilidad de los sensores 14.
El presente manuscrito establece el uso de microelectrodos de biosensores enzimáticos para ex vivo e in vivo en forma de preparados de riñón. Cuantificación de analitos en tiempo real ofrece un detalle sin precedentes de la señalización celular que puede revelar nuevos conocimientos sobre los mecanismos de las enfermedades renales y agentes farmacológicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los actuales protocolos fueron desarrollados para proporcionar una resolución temporal y espacial mejorada de ATP y H 2 O 2 de señalización para ex vivo aislados, perfundidos e in vivo riñones perfundidos sangre. Las diferencias entre los protocolos y los sensores utilizados aquí proporcionan la adquisición de datos óptima, ya sea para agentes farmacológicos o estudios fisiológicos. Los protocolos consisten en 1) la calibración del sensor, 2) procedimiento quirúrgico, 3) de config…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Apreciamos Sarissa Biomédica por su trabajo en el desarrollo de los sensores usados en el presente manuscrito. Esta investigación fue apoyada por el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre otorga HL108880 (A. Staruschenko), HL 116 264 (A. Cowley) y HL 122 662 (A. Staruschenko y A. Cowley), un proyecto financiado por el Colegio Médico de Comité de Asuntos de Investigación Wisconsin # 9306830 (O. Palygin) y al desarrollo de un Programa de Investigación y Educación Saludable Wisconsin # 9520217, y el joven investigador de subvención de la Fundación Nacional del Riñón (O. Palygin).
Materials
| Sensor Kit | Sarissa Biomedical | SBK-ATP-05-125 | The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes. Also included with the kit is the user's choice of sensors. |
| Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μm | Sarissa Biomedical | SBS-ATP-05-125 | store at 2-8 C before use |
| Sarissagold ATP Biosensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-ATP-10-50 | store at 2-8 C before use |
| Sarissaprobe null sensor 125μm | Sarissa Biomedical | SBS-NUL-20-125 | store at 2-8 C before use |
| Sarissagold null sensor 50 μm | Sarissa Biomedical | SGS-NUL-10-50 | store at 2-8 C before use |
| Sarissaprobe ATP Manual | Sarissa Biomedical | http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf | |
| Faraday cage | TMC | ||
| Dual channel potentiostat | Digi-Ivy | DY2021 | Type II Faraday cage |
| Data acquisition program | Digi-Ivy | DY2000 | |
| Perfusion pump | Razel Scientific Instruments | Model R99E | |
| Fiber optic illuminator | Schott | ACE 1 | |
| micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-8 | |
| air table | TMC | 63-500 | |
| isoflurane ventilator | LEI Medical | M2000 | |
| 3 ml petri dish | Fisher Scientific | S3358OA | |
| needle | Santa Cruz | 26-30 gauge | |
| pins | Standard dissection pins | ||
| catheter | Polyethylene tubing (PE50) | ||
| catheter tissue glue | Vetbond | 1469SB | |
| suture | Look | SP117 | |
| rubber bands | any 2-4 mm wide rubber bands | ||
| silicone | Momentive | RTV-615 Clear 1# | |
| clamp | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| standard dissection kit | Kit should include scalpel and dissection sissors | ||
| Kidney Cup | Of own design | ||
| standard chemicals | Sigma-Aldrich | ||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | 100 mM ATP solution |
| hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A7646 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| isoflurane | Clipper | 10250 | |
| inactin | Sigma-Aldrich | T133 | |
| ketamine | Clipper | 2010012 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 |
References
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