Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.
Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions.
Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.
Målet med denne prosedyren er å utvikle beriket mitokondrielle fraksjoner som gir nok mitokondrielle metabolitter for metabolomics studier med bananflue. I vår erfaring, metabolomics analyser ved hjelp av hele mobilnettet utvinning metoder ikke er i stand til å oppdage subtile mitokondrielle metabolitt endringer i Drosophila. Men mitokondrie fraksjone før metabolomics analyser øker følsomheten for å identifisere mitokondrielle metabolitt skift.
Mitokondrier er cellulære organ som er ansvarlige for å gi 90% av den energien som cellene trenger for en normal funksjon. I de senere år har det vært kjent at mitokondriene spiller en mye mer dynamisk rolle i cellulære og organisme funksjon enn bare å produsere adenosin trifosfat (ATP), og er nå anerkjent som nav for regulering av metabolske homeostase 2,3. Mitokondriene er et resultat av en prosess hvor endosymbiotic distinct mikrobielle linjene slått sammen ~ 1,5 milliarder år siden fire. Som mitokondrier utviklet seg til ekte organeller, ble genene fra endosymbiont innlemmet i den nye atom genom. Hos dyr i dag, ca. 1500 mitokondrielle proteiner er atom-kodet mens 37 gener forblir i mtDNA, 13 som koder for proteiner som er mitokondrielle subenheter av enzymkomplekser av oksidativ fosforylering 5. Koordinering mellom mitokondrier og atom avdelinger er nødvendig for å opprettholde riktig mitokondrienes funksjon.
Ved hjelp av metodene beskrevet her var vi i stand til å oppdage mitokondrielle metabolske endringer i Drosophila som følge av manipulering av koordinering mellom mitokondrie og atom genomer. Vi brukte en stamme av Drosophila der mtDNA fra sin søster arter D. simulans ble plassert på en enkelt D. melanogaster atom bakgrunn seks. Denne "forstyrret" mitonucleargenotype ble sammenlignet med den "opprinnelige", eller co-utviklet mitonuclear genotype av D. melanogaster bærer samme atom genom med sin opprinnelige D. melanogaster mtDNA. D. melanogaster og D. simulans mtDNAs avvike fra ~ 100 aminosyrer og> 500 synonymt erstatninger som påvirker mitonuclear kommunikasjon 7,8. Vi genererte hele flue ekstrakter og mitokondrielle anrikede ekstrakter for å studere metabolitt skift i respons til farmakologisk stress. Her viser vi at når du bruker mitokondrielle beriket fraksjoner vi oppdager at vridninger i mitokondrie metabolitter mellom de innfødte, co-utviklet genotype bærer D. melanogaster mtDNAs og forstyrret genotype bærer D. simulans mtDNA. I kontrast til metabolitten endringer mellom disse to genotyper er subtile ved hjelp av vanlige metoder som utnytter hele flue ekstrakt. Derfor er denne fremgangsmåte ga en bane for å forstå hvordan mtDNAs mediere mitokondrielle endringerrespons på forskjellige medisiner.
De mest kritiske trinn i denne protokollen er: 1) oppdragelse nok fluer i rikelig plass. Det er veldig viktig å ikke overpopulate de demografi bur med mer enn 150 fluer hver; 2) endring av mat av merdene ofte for å unngå mat konkurranse og ernæringsmessig stress, og 3) å opprettholde alle prøver ved 4 ° C for å sikre integritet under isolering av mitokondrie fraksjonen. Det anbefales også å slappe av isolasjon buffer, vaskebuffer, og glass-teflon dounce homogenisator før bruk. For å redusere forurensning av …
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Adelphi University faculty development grant and grant R15GM113156 from NIGMS awarded to EVC, grant R01GM067862 from NIGMS and grant R01AG027849 from NIA awarded to DMR.
0.2% tegosept -methyl 4-hydroxybenzoate | VWR | AAA14289 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 792799 | |
Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma-Aldrich | M1254 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 38057 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
KCL | Sigma-Aldrich | P9333 | |
Tris HCL | Sigma-Aldrich | RES3098T-B7 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
CO2 pads to anesthetize flies | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
1 liter cage | Web Restaurant Store | 999RD32 | |
1 liter cage lid | Web Restaurant Store | 999LRD | |
a glass-teflon dounce homogenizer | Fisher Scientific | NC9661231 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
anti-porin | MitoSciences | MSA03 | |
anti-alpha tubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12G10 | |
Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
CO2 pad | Tritech Research, Inc | MINJ-DROS-FP | |
filter flask | enasco | SB08184M | |
rubber stopper | enasco | S08512M |