Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.
Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of >10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.
Voor RNA virologen de komst van recombinant DNA technologie in de late jaren 1970 maakte het mogelijk om virale RNA-genomen om te zetten in cDNA-klonen, die vervolgens kan worden vermeerderd zoals plasmiden in bacteriën voor de genetische manipulatie van RNA-virussen. 1 het eerste RNA-virus te zijn moleculair gekloond was bacteriofaag Qp, een positieve streng RNA virus dat Escherichia coli infecteert. Een plasmide dat een volledige cDNA kopie van de Qp-genoom RNA leidde tot infectieuze fagen QP wanneer ingebracht in E. coli. 2 Kort daarna deze techniek werd toegepast op poliovirus, een positieve streng RNA-virus van mens en dier. Een plasmide dat een cDNA van volledige lengte van het poliovirus genomische RNA infectieus wanneer getransfecteerd in zoogdiercellen en staat de productie van infectieuze virions 3 In deze "-DNA geïntroduceerd" werd de gekloneerde cDNAs moeten intracellulair getranscribeerd virale RNA replicatie te initiëren.;het is echter onduidelijk hoe de transcriptie wordt geïnitieerd en hoe de transcripten worden verwerkt om de juiste virale sequentie. Deze bezorgdheid heeft geleid tot de ontwikkeling van een alternatieve "-RNA gestart" benadering, waarbij een volledige cDNA-kopie van het virale RNA-genoom is gekloneerd onder een promoter herkend door een E. coli of faag RNA-polymerase voor het produceren van synthetische RNA's in vitro met gedefinieerde 5 'en 3' uiteinden, waarbij de volledige virale replicatiecyclus ondergaan wanneer ingebracht in gastheercellen. 4,5 Het eerste succes van deze benadering werd gerapporteerd brome mosaic virus 6,7 een positieve streng RNA-virus van planten. Sindsdien is de RNA-gelanceerd aanpak ontwikkeld voor een breed scala aan positieve streng RNA-virussen, waaronder calicivirussen, alfavirussen, flavivirussen, arterivirussen en coronavirussen. 1,4,5,8
In zowel de DNA- en RNA-gelanceerde reverse genetics systemen, de bouw van een vl-cDNA-kloon is de sleutel tot het genereren van infectieus DNA of RNA van positieve streng RNA virussen, maar het wordt een aanzienlijke technische uitdaging als de grootte van het virale genoom toeneemt. 17/09 met name een groot RNA-genoom van ~ 10 -32 kb bevat drie belangrijke obstakels voor het klonen van een full-length cDNA functioneel. 18 Het eerste probleem is de synthese van een cDNA getrouwe kopie, aangezien de betrouwbaarheid van RT-PCR is omgekeerd evenredig met de lengte van het virale RNA. De tweede hindernis is de aanwezigheid van potentieel toxische sequenties, al lang RNA moleculen vaker onverwachte sequenties die in staat is de cDNA-fragment in onstabiele plasmiden in E. bevatten coli. De derde en meest kritische punt is de beschikbaarheid van een geschikte vector, aangezien het moeilijk is een kloneringsvector die een virale cDNA-insert van> 10 kb kunnen onderbrengen vinden. In de afgelopen drie decennia hebben deze barrières overwonnen door een aantal ontwikkelingen in de enzymologie, methodologie, eend vectorology. 1,4,5,8 Van deze, de meest veelbelovende en innovatieve ontwikkeling is het klonen van grote positieve streng RNA-virussen zoals besmettelijke bacteriële kunstmatige chromosomen (BAC). De BAC vector is een low-copy klonen plasmide (1-2 kopieën / cel) op basis van de E. coli vruchtbaarheid factor, met een gemiddelde grootte van insert DNA ~ 120-350 19-21 kb DNA-fragment wordt in de BAC vector op een gelijkaardige manier ingevoegd kloneren in algemene kloneringsvectoren.; de verkregen BAC klonen stabiel gedurende vele generaties E. coli. 22,23 Tot op heden heeft het RCB technologie gebruikt van infectieuze cDNA-klonen voor> 10 leden van drie positieve streng RNA virus families, namelijk Flaviviridae, 24-29 Arteriviridae, 30 en Coronaviridae creëren. 9,16,17 , 31,32
Met behulp van Japanse encefalitisvirus (JEV) als voorbeeld, dit werk rapporteert de gedetailleerde procedures die kunnen wordengebruikt om een genetisch stabiele full-length infectieuze BAC voor verschillende positieve streng RNA-virussen te construeren. JEV is een zoönotische flavivirus 33 die in de natuur tussen vogels, varkens en andere gewervelde gastheer wordt overgebracht door muggen vectoren. 34,35 Bij mensen JEV infectie kan het ernstige vaak dodelijke neurologische ziekte Japanse encefalitis (JE), 36 die optreedt in Azië en delen van de westelijke Stille Oceaan, 37,38 met een geschatte jaarlijkse incidentie van ~ 50,000-175,000 klinische gevallen. 39,40 Het genoom van JEV is een ~ 11-kb, enkelstrengs, positieve-sense RNA-molecuul en bestaat uit een enkel open leesraam (ORF) geflankeerd door twee niet-coderende regio (NCR) van het 5 'en 3' uiteinden. 41,42 Het ORF codeert voor een polyproteïne dat wordt gesplitst door gastheer en virale proteases tot 10 afzonderlijke eiwitten genereren aangewezen C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B en NS5 in de N- naar C-terminus. 34,43,44 Ook eXtended vorm van NS1 (NS1) wordt door -1 ribosomale frameshifting uitgedrukt in codons 8-9 van NS2A. 45,46 Van deze 11 eiwitten, de drie structurele eiwitten (C, prM en E) zijn essentieel voor de vorming van infectieuze virions, 47,48 en de resterende acht structurele eiwitten (NS1 tot NS5 en NS1 ") zijn noodzakelijk voor virale RNA-replicatie, 49-51 deeltje assemblage, 52-56 en aangeboren immuniteit fraude. 57-59 zowel de 5 'en 3 'NCRs bevatten geconserveerde primaire sequenties en vorm RNA secundaire / tertiaire structuren, 60-62 die belangrijk zijn voor het moduleren van viraal RNA replicatie. 63,64
Dit protocol beschrijft de gereedschappen, werkwijzen en strategieën voor het genereren van een full-length infectieuze BAC van JEV SA 14 -14-2. 28 Deze functionele BAC kloon bevat een volledig cDNA kopie van het RNA genoom JEV, 65 die is omgeven door een promoter de SP6 RNA polymerase upstreamvan de virale 5'-uiteinde en een unieke XbaI-restrictieplaats stroomafwaarts van het virale 3'-end in vitro run-off transcriptie. Deze BAC technologie is toepasbaar op het construeren van een volledig functionele cDNA-kloon moleculaire voor een serie van positieve streng RNA virussen.
Het huidige protocol is met succes gebruikt om full-length infectieuze cDNA-klonen van twee verschillende stammen (CNU / LP2 SA 27 en 14 -14-2 28) van JEV, een flavivirus waarvan de functionele cDNA bleek inherent moeilijk samen te stellen is en genereren propageren vanwege toxiciteit gastheercel en de genetische instabiliteit van gekloneerde cDNA 8,74-76 Dit protocol omvat drie hoofdcomponenten. eerste, het maximaliseren van de synthese / amplificatie van cDNA een getrouwe kopie van het virale RNA met behulp van high-fidelity reverse transcriptase / DNA polymerase; tweede, het kloneren van de virale prM-E coderend gebied dat toxische sequenties (ongepubliceerde gegevens) 74,77,78 in een zeer lage kopieaantal vector BAC uit de oorspronkelijke cDNA subkloneren tot de uiteindelijke volledige lengte cDNA montagestappen; en de derde, gebruik van een kloneringsvector die BAC kan een vreemd DNA met een gemiddelde grootte van 120-350 kb, 19-21 die blijkbaar tolereert grotere DNA inserts dan andere kloneringsvectoren. Deze klonering wordt algemeen toepasbaar op vele andere positieve streng RNA-virussen, met name die met een groot RNA-genoom van ~ 10 tot 32 kb. Genereren van een infectieuze cDNA-kloon is een belangrijke stap in de ontwikkeling van een reverse genetics voor RNA-virussen, met name positieve streng RNA-virussen, omdat het genoom treedt virale mRNA dat vertaald in eiwitten door gastheercel ribosomen. Aldus kan virale replicatie worden gestart door de introductie van een cDNA-afgeleide genoom-lengte RNA molecuul in een vatbare gastheercel. De beschikbaarheid van een infectieus JEV cDNA-kloon, in combinatie met recombinant DNA-technologie, heeft ons begrip van verschillende aspecten van de virale levenscyclus verhoogd op moleculair niveau, zoals genexpressie 73,79 en genoomreplicatie. 63,64 ook een full-length JEV cDNA-kloon blijkt een waardevol instrument voor de ontwikkeling van antivirale vaccins 28 en gentherapie vectoren. <sup> 80,81
Zoals bij alle positieve streng RNA virussen er meerdere kritische stappen bij het construeren van een betrouwbare functionele cDNA voor JEV waaruit zeer besmettelijke RNAs kunnen worden gesynthetiseerd in vitro. Idealiter zou de sequentie van de synthetische RNA getranscribeerd van een kloon van volledige lengte cDNA identiek zijn aan die van het virale genomische RNA, met name de 5'- en 3'-terminale sequenties die nodig zijn voor de initiatie van virale RNA replicatie . 60-62 In het huidige protocol, de authentieke 5'- en 3'-uiteinden werden verzekerd door het plaatsen van de SP6-promotersequentie stroomopwaarts van de eerste adenine nucleotide van het virale genoom en positioneren van een unieke kunstmatige XbaI-restrictieplaats stroomafwaarts van de laatste thymine nucleotide van het virale genoom, respectievelijk. Capped synthetische RNAs met authentieke 5 'en 3' uiteinden werden geproduceerd door run-off transcriptie van een XbaI-gelineariseerd en MBN behandelde cDNA template gebruik SP6 RNA polymerase geprimed met m 7 G (5 ') ppp (5') Dop analoog. Dit protocol kan worden gemodificeerd op verschillende manieren. Voor in vitro transcriptie kan een bacteriofaag RNA-polymerase (bijvoorbeeld T3 of T7) worden gebruikt in combinatie met een goed gedefinieerde promotorsequentie. 27 als run-off site, kan een andere restrictieplaats worden toegepast als het niet presenteren het virale genoom en als synthetische RNA van de gelineariseerde cDNA eindigt met de authentieke 3 'uiteinde. Het belang van het 3'-uiteinde nucleotidesequentie werd aangetoond door een ~ 10-voudige afname in infectiviteit RNA wanneer een synthetisch RNA bevat drie of vier-verbonden-virus nucleotiden aan het 3 'uiteinde. 27 In een in vitro transcriptie reactie, zowel de m 7 G (5 ') ppp (5') A en m 7 G (5 ') ppp (5') G cap analoog kan evengoed gebruikt, hoewel deze plaatsen een ongerelateerde extra G nucleotide stroomopwaarts van het virale 5 '-end, maar datBovendien neemt niet weg infectiviteit of replicatie van synthetisch RNA. 27 Bovendien is het verwijderen van de matrijs cDNA van het RNA transcripten met DNase I digestie is niet noodzakelijk RNA infectiviteit testen, omdat de cDNA sjabloon zelf is niet besmettelijk. 27
De BAC-technologie is nu toegepast op de bouw van infectueuze cDNA-klonen voor een handvol positieve streng RNA-virussen, namelijk twee JEVs, CNU / LP2 27 en SA 14 -14-2 28 (genoomgrootte, ~ 11 kb); twee dengue virussen, BR / 90, 26 en NGC 29 (~ 11 kb); het bovine virale diarree virus, SD1 (~ 12 kb), 25 twee klassieke varkenspest virussen, C en Paderborn (~ 12 kb), 24 de border disease virus, Gifhorn (~ 12 kb), 24 het porcien reproductief en respiratoir syndroom virus , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb); 30 de overdraagbare gastro-enteritis virus, PUR46-MAD (~ 29 kb); 16 de feline infectieuze peritonitis virus,DF-2 (~ 29 kb); 32 het Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus, Urbani (~ 30 kb); 9 het Midden-Oosten respiratoir syndroom coronavirus, EMC / 2012 (~ 30 kb), 17 en het menselijk coronavirus, OC43 (~ 31 kb) 31 Het belangrijkste voordeel van het gebruik van BAC's voor cDNA constructie is het hoge genetische stabiliteit van de grote, 1- of 2-kopie plasmiden BAC.; De intrinsieke aard van zijn extreem lage aantal kopieën is ook een groot nadeel, omdat zeer lage opbrengsten van BAC DNA en de daaruit voortvloeiende verlaging van de zuiverheid van het BAC DNA opzichte van chromosomaal DNA gastheer. In het huidige protocol is de opbrengst van BAC DNA gemaximaliseerd door groeiende E. coli DH10B getransformeerd met de besmettelijke BAC pBAC / SA 14 -14-2 in een voedselrijke medium, 2xYT. Dit neemt de gemiddelde opbrengst slechts ~ 15 pg BAC DNA van 500 ml 2xYT bouillon. Tevens is de zuiverheid van het BAC DNA best bereikt door CsCl-dichtheidsgradiënt centrifugatie EtBr voor zuiveringIn plaats van de gebruikelijke kolommen gebaseerde plasmide-isolatie. Het is echter belangrijk om in gedachten te houden dat de BAC-getransformeerde E. coli mag niet overwoekeren, omdat het de genetische stabiliteit van het gekloonde cDNA in gevaar kan brengen, en een hogere groei leidt niet noodzakelijk tot een grotere opbrengst of hogere zuiverheid BAC DNA.
De hier beschreven protocol is een geoptimaliseerde, efficiënte en gestroomlijnde werkwijze voor de constructie en vermeerdering van een genetisch stabiele full-length infectueuze cDNA-kloon als een BAC voor JEV, een procedure ooit gedacht praktisch onmogelijk. Dezelfde klonen strategie kan ook worden toegepast op vele andere positieve streng RNA virussen. In het algemeen infectieuze cDNA-klonen kunnen wij verschillende mutaties (bijvoorbeeld deleties, inserties en puntmutaties) introduceren in een viraal RNA-genoom van hun biologische functies te bestuderen virale replicatie en pathogenese. Deze cDNA-gebaseerde reverse genetics systeem maakt het mogelijk om de ontwikkeling en test vaccins en therapeutische kandidaten richten een virulentiefactor (en) van een bepaalde positieve streng RNA-virus van belang. Bovendien kan deze infectieuze cDNA techniek ook worden gebruikt als een virale vector, in staat is tot expressie van een vreemd gen (en) van belang voor vele toepassingen in biomedisch onderzoek.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge the Utah Science Technology and Research fund for support of YML and the Korea National Research Foundation grants (2009-0069679 and 2010-0010154) for support of SIY. This research was supported by the Utah Agricultural Experiment Station, Utah State University, and approved as journal paper number UAES #8753. Also, the authors thank Dr. Deborah McClellan for editorial assistance.
1. Molecular Cloning | |||
2xYT Broth | Sigma-Aldrich | Y2377 | |
[3H]UTP | PerkinElmer | NET380250UC | Radioactive |
50-mL Tube | Thermo Scientific (Nalgene) | 3114-0050 | |
250-mL Bottle | Beckman Coulter | 356011 | |
Agarose | Lonza | 50004 | |
Agarose (Low Melting Point) | Life Technologies (Invitrogen) | 16520-100 | |
AvaI | New England BioLabs | R0152S | |
AvrII | New England BioLabs | R0174S | |
BamHI | New England BioLabs | R0136S | |
BsiWI | New England BioLabs | R0553S | |
BsrGI | New England BioLabs | R0575S | |
Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
Cap Analog [m7G(5ʹ)ppp(5ʹ)A] | New England BioLabs | S1405S | |
Cesium Chloride | Fisher Scientific | BP1595-1 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | Carcinogenic |
DE-81 Filter Paper | GE Healthcare Life Sciences | 3658-023 | |
dNTP mix | Life Technologies (Invitrogen) | 18427-088 | |
E. coli DH10B | Life Technologies (Invitrogen) | 18297-010 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | Toxic and highly mutagenic |
Filter Column (Plasmid Maxiprep Kit) | Life Technologies (Invitrogen) | K2100-26 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | Irritating |
Glucose | Sigma-Aldrich | G5400 | |
Glycogen | Roche | 10901393001 | |
High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491S | |
Isoamyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9392 | Flammable |
Isopropanol | Amresco | 0918 | Flammable |
LB Broth | Life Technologies (Invitrogen) | 12795-027 | |
Lithium Chloride | Sigma-Aldrich | L9650 | |
Lysozyme | Amresco | 0663 | |
Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
M-MLV Reverse Transcriptase | Life Technologies (Invitrogen) | 18080-044 | |
Mung Bean Nuclease | New England BioLabs | M0250S | |
Needle (18G, 20G) | BD | 305196, 305175 | Biohazardous (Sharps waste) |
NotI | New England BioLabs | R0189S | |
Oligonucleotide | Integrated DNA Technologies | Custom Oligonucleotide Synthesis | |
PacI | New England BioLabs | R0547S | |
pBeloBAC11 | New England BioLabs | ER2420S (E4154S) | |
Phenol (Buffer-Saturated) | Life Technologies (Invitrogen) | 15513-039 | Toxic and highly corrosive |
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Life Technologies (Invitrogen) | 15593-031 | Toxic and highly corrosive |
Phenol:Guanidine Isothiocyanate | Life Technologies (Ambion) | 10296-010 | Toxic, corrosive, and irritating |
Pme I | New England BioLabs | R0560S | |
Potassium Acetate | Amresco | 0698 | |
RNase Inhibitor | Life Technologies (Invitrogen) | 10777-019 | |
rNTP Set | GE Healthcare Life Sciences | 27-2025-01 | |
Sealable Polypropylene Tube (16 × 76 mm) | Beckman Coulter | 342413 | |
SfiI | New England BioLabs | R0123S | |
Sma I | New England BioLabs | R0141S | |
Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | 0227 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
SP6 RNA Polymerase | New England BioLabs | M0207S | |
Spin Column (Plasmid Miniprep Kit) | Life Technologies (Invitrogen) | K2100-11 | |
Syringe | HSW NORM-JECT | 4200.000V0 | |
T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
Tris | Amresco | 0826 | |
tRNA (yeast) | Life Technologies (Invitrogen) | 15401-011 | |
XbaI | New England BioLabs | R0145S | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2. Cell Culture | |||
Alpha Minimal Essential Medium | Life Technologies (Gibco) | 12561-049 | |
Conical Tube (50 mL) | VWR | 21008-242 | |
Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C0775 | |
Culture Dish (150 mm) | TPP | 93150 | |
Cuvette (2-mm Gap) | Harvard Apparatus | 450125 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies (Gibco) | 16000-044 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | Toxic and carcinogenic |
Glutamine | Life Technologies (Gibco) | 25030-081 | |
Minimal Essential Medium | Life Technologies (Gibco) | 61100-061 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies (Gibco) | 15070-063 | |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
Six-Well Plate | TPP | 92006 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | S3264 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies (Gibco) | 25200-056 | |
Vitamins | Sigma-Aldrich | M6895 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3. Equipment | |||
Agarose Gel Electrophoresis System | Mupid | MPDEXU-01 | |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | Heracell 150i | |
Desktop Centrifuge | Thermo Scientific | ST16R | |
Electroporator | Harvard Apparatus | ECM 830 | |
Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld) | UVP | UVGL-58 | |
Tabletop Centrifuge | Beckman Coulter | 368826 | |
Thermocycler | Life Technologies (Applied Biosystems) | GeneAmp PCR System 9700 | |
Vortexer | Scientific Industries | G-560 | |
Water Bath | Jeio Tech | WB-10E |