Dette manuskript beskriver en metode til at kvantificere tumor celle ophobning i lungerne i en dyremodel af tumor metastaser.
For at undersøge de molekylære mekanismer for tumor metastaser, er blevet foreslået forskellige assays ved hjælp af musen som en model dyr. Her viser vi en simpel analyse for at vurdere tumor celle ekstravasation eller micrometastasis. I denne analyse, tumorceller blev injiceret gennem halen vene, og efter en kort periode, lungerne blev dissekeret og fordøjet for at tælle de akkumulerede mærket tumorceller. Denne analyse springer det første trin af primær tumor invasion ind i blodkar og letter undersøgelsen af begivenhederne i fjernt organ hvor tumor metastaser opstår. Antallet af celler injiceres ind i blodkar kan optimeres for at observere et begrænset antal metastaser. Det er blevet rapporteret, at stromale celler i Fjern organ bidrage til metastaser. Således, denne analyse kunne være et nyttigt redskab til at udforske potentielle terapeutiske lægemidler eller anordninger til forebyggelse af tumor metastaser.
Tumor metastaser konti for høj dødelighed i cancer-relaterede sygdomme. Fra synspunkt af undersøgelser på det molekylære niveau, metastaser kan opdeles i flere trin: tumor indledningen på den primære tumor site, primær tumorvækst og invasion i omkringliggende væv, intravasation, omsætning gennem blodkarrene , ekstravasation på fjerntliggende organer, og tumor re-vækst. Hvert trin indebærer forskellige sæt af molekyler/signaler1.
Undersøgelser til dato har drejet sig om hændelser, som forekommer i fjerntliggende organer før tumorcellerne, cirkulerer i blodet, hvilket er også kendt som den præ metastatisk fase2,3,4,5, 6. Vores mus model undersøgelser afslørede, at fasen forud metastatisk letter lunge metastaser ved at skabe langvarig og low-level inflammatoriske respons i lungerne. Den pre-metastatisk fase er kendetegnet ved hyperpermeability af themicrovasculature, rekruttering af knoglemarven afledt celler (BMDC) og opregulering af cytokin/chemokine-lignende molekyler herunder S100A8 og SAA33,4 . Det er blevet rapporteret, at lysyl oxidase ændrer den ekstracellulære matrix i lungerne til at rekruttere BMDCs7. En anden betænkning har afsløret betydningen af Angpt2, MMP3 og MMP10 i pre metastatisk fase8. Med andre ord, det indviklede samspil mellem primære tumorer, knoglemarv og fjerntliggende organer skal være forstået og korrekt moduleret (for eksempel ved hjælp af narkotika, der er målrettet proteiner involveret i disse interaktioner) at forhindre fremtidige metastase9 . For at regulere den pre metastatisk fase, bør det først visualiseret og evalueres for diagnostiske eller terapeutiske indgreb. Her rapporterer vi en lunge tumor celle rekruttering assay, der giver mulighed for undersøgelse af pre metastatisk fase i lungerne.
Tumorceller direkte sprøjtet ind i blodkar af musen er lig cirkulerende tumorceller i kræftpatienter, selv om der kan være forskelle mellem kulturperler celler og cirkulerende tumorceller. Cirkulerende tumorceller undergå sig nogle karakteristiske ændringer, når de indtaster omsætning fra den primære tumor. Ikke desto mindre kan kulturperler celler danne tumorer hos immundefekte mus når de er indsprøjtet i halen vene. Derudover i mus modelsystem, kan fluorescens mærket tumorceller bruges som tillader sporing af disse celler i kroppen. Opførsel af cirkulerende tumorceller er kritisk, da de afgør de endelige konsekvenser i kræft patienter10. Blod er ikke et godt sted for overlevelse af tumor celler2. De har brug at flygte fra angreb af immunsystemet vært og behovet for anti-apoptotiske signaler at forhindre apoptose mangel af fysisk støtte. Tumorceller med højere evner af tumor indledning på metastatisk sites generere flere tumor knuder. Hvis tumorceller vise specifikke orgel tropisme, bemærkes metastaser i disse særlige organer. De første trin af den metastatisk kaskade (primær tumorvækst og invasion) er ikke inkluderet i denne analyse, og så fokus er på samspillet mellem cirkulerende tumorceller og stromale celler (endotelceller, epitelceller og blodlegemer). I konventionelle tumor celle indsprøjtning assays har forskere til at vente indtil tumor knuder vokser til en konkret størrelse at påvise metastaser. I dette tilfælde ikke kan det nøjagtige antal tumorceller i blodkar kvantificeres. Denne proces indeholder desuden en tumor genvækst fase, der angiver, at andre faktorer i tumorcellerne kan påvirke resultatet.
Tælle er mærket tumorceller under et fluorescens stereomikroskop en enkel proces. Stereomikroskopet giver et bredt synsfelt, så hele lungen kan scannes. Flowcytometri er også et nyttigt værktøj, der straks giver en præcis antal tumorceller i vævet. Tælle fluorescerende celler i vævet under en Konfokal mikroskop er også muligt og viser de mest præcise billeder af metastatisk tumorceller, men det er tidskrævende og kan give partisk resultater, hvis kun et markeret område er optalt. Det ultimative mål for denne analyse er at observere, hvordan let tumorceller ophobes i lungerne. Som rapporteret tidligere3,4, hvis lungerne er i pre metastatisk fase på grund af inflammatorisk signalering fra den primære tumor, er injiceres tumorcellerne tilbøjelige til at ophobe sig i lungerne, hvilket således indebærer større chancer for lunge metastaser. Andre betingelser (leddegigt, astma, etc.), og deres behandling med anti-inflammatoriske lægemidler (såsom anti-TNFα) kan dæmpe lunge metastaser. Dermed, vi konkludere, at denne analyse er et kraftfuldt værktøj til at vurdere muligheden for lunge metastaser.
Forbehandling af mus med antistoffer, narkotika, højt fedtindhold kost eller tumor-aircondition medium før tumor celle indsprøjtning er muligt. Det sværeste skridt i denne analyse er hale vene injektion. Ufuldstændig injektion resulterer i uafklarede data. Hale vene i C57BL/6 er særligt vanskeligt at identificere, hvilket resulterer i fejlbehæftede injektioner. Placere mus på en varmepude (37 ° C) spile hjælper hale vene, således at injektionen bliver lettere.
Denne analyse bruger e…
The authors have nothing to disclose.
Ingen
Collagenase | Sigma | C6885 | |
Dispase | Gibco | 17105-041 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
DPBS | Gibco | 14190-144 | no calcium, no magnesium |
Deoxyribonuclease I | Sigma | DN-25 | trace amount |
RBC lysis buffer | Sigma | R7757 | |
Cell strainer | BD | 352340 | 40 micrometer mesh |
Fluorescence labeling kit | Sigma | MIN26-KIT | |
DMEM | Gibco | 11965-092 | |
0.22 μm syringe filter | sartorius | 17597K | |
O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 |