כתב יד זה מתאר שיטה לכמת הצטברות תאים גידול בריאות במודל חיה של גרורות הגידול.
כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המסדירים גרורות הגידול, הוצעו מבחני שונים באמצעות העכבר כחיה מודל. . הנה, נדגים וזמינותו פשוט להעריך הגידול תא extravasation או micrometastasis. ב הזה assay, תאים סרטניים הוזרקו דרך הווריד של הזנב, ו לאחר תקופה קצרה, הריאות היו גזור מתעכל לספור את תאי הגידול שכותרתו שהצטברו. Assay זה מדלג על השלב הראשוני של הגידול העיקרי הפלישה לתוך כלי דם ואסטמה ומקילה על המחקר של אירועים באיבר מרוחק שבו מתרחשת גרורות הגידול. ניתן למטב את מספר התאים מוזרק לתוך כלי הדם להתבונן במספר מצומצם של גרורות. בעבר דווח כי סטרומה תאים באיבר מרוחק לתרום גרורות. לפיכך, וזמינותו הזה יכול להיות כלי שימושי כדי לחקור תרופות טיפוליות או התקנים למניעת גרורות הגידול.
גרורות הגידול חשבונות עבור תמותה גבוהה במחלות הקשורים לסרטן. מנקודת מבט של חקירות ברמה המולקולרית, גרורות ניתן לחלק מספר השלבים: גידול חניכה הגידול העיקרי באתר, הגידול העיקרי ו הפלישה לתוך סביב רקמות, intravasation, זרימת הדם דרך כלי הדם , extravasation איברים רחוקים, וכן גידול מחדש את הצמיחה. כל שלב כרוך סטים שונים של מולקולות/אותות1.
מחקרים עד כה מעורב עם אירועים המתרחשים באיברים מרוחקים לפני לתאי הגידול במחזור הדם, אשר נקרא גם שלב גרורתי מראש2,3,4,5, 6. המחקרים שלנו דגם העכבר חשף כי שלב גרורתי מראש מקלה על גרורות ריאה על-ידי יצירת תגובות דלקתיות לטווח ארוך, ברמה נמוכה של הריאות. שלב טרום גרורתי מאופיין על-ידי hyperpermeability של themicrovasculature, גיוס של תאים במח העצם נגזר (BMDC), קולטנים upregulation של מולקולות ציטוקין/כימוקין-כמו כולל3,S100A8 ו- SAA34 . בעבר דווח שכי אוקסידאז lysyl משנה של מטריצה חוץ-תאית בריאות לגייס BMDCs7. דוח אחר חשף את החשיבות של Angpt2, MMP3 ו- MMP10 שלב גרורתי מראש8. במילים אחרות, מורכבות האינטראקציות בין גידולים העיקרי, מח עצם, ואיברים מרחוק צריך להיות מובן, מאופנן כראוי (למשל, באמצעות תרופות המיועדות החלבונים המעורבים אינטראקציות אלה) כדי למנוע בעתיד גרורות9 . כדי להסדיר את שלב גרורתי מראש, הוא צריך קודם להיות דמיינו, שחושבה עבור התערבויות אבחון או טיפולית. כאן, אנחנו מדווחים על ריאות הגידול תא גיוס assay המאפשרת הלימוד של שלב טרום גרורות בריאות.
תאים סרטניים מוזרק ישירות כלי הדם של העכבר דומים מחזורי תאים סרטניים חולי סרטן, אם כי ייתכנו הבדלים בין תאים בתרבית ופיזור תאים סרטניים. מחזורי תאים סרטניים עצמם עוברים שינויים אופייניים כאשר הם מזינים את זרימת הדם מן הגידול העיקרי. עם זאת, תאים בתרבית יכולים ליצור את גידולים בעכברים immunodeficient כשהם מוזרקים בווריד הזנב. בנוסף, במערכת מודל העכבר, זריחה עם התווית תאים סרטניים יכולים לשמש לאפשר מעקב של תאים אלה בגוף. ההתנהגות של מחזורי תאים סרטניים חיוני כפי שהם קובעים את ההשלכות האולטימטיבי חולי סרטן10. דם אינו מקום טוב להישרדות של תאי גידול2. הם צריכים לברוח מפני התקפה על ידי המערכת החיסונית מארח וזקוקים אנטי-מוות אותות כדי למנוע אפופטוזיס עקב חוסר תמיכה פיזית. תאים סרטניים עם יכולות גבוהות יותר של הגידול חניכה באתרים גרורתי להפיק יותר גושים סרטניים. אם תאים סרטניים מראים tropism איבר מסוים, גרורות להתייחס באיברים האלה מסוים. זה assay, השלבים הראשונים של המפל גרורתי (הגידול העיקרי ואת הפלישה) אינם כלולים ולאחר אז הדגש הוא על האינטראקציה בין מחזורי תאים סרטניים ותאים סטרומה (תאי אנדותל בתאי אפיתל, תאי דם). בגידול קונבנציונאלי מבחני הזרקת תא, חוקרים צריכים לחכות עד גושים סרטניים לגדול לגודל מוחשי כדי לזהות את גרורות. במקרה זה, המספר המדויק של תאי גידול כלי דם לא ניתן לכמת. בנוסף, תהליך זה כולל הגידול שלב לצמיחה מחודשת, המציין כי גורמים אחרים בתאי הגידול עשוי להשפיע על התוצאה.
ספירת שכותרתו תאים סרטניים תחת stereomicroscope קרינה פלואורסצנטית היא תהליך פשוט. Stereomicroscope מספק שדה ראייה רחב כך ניתן לסרוק את כל הריאה. Cytometry זרימה הוא גם כלי שימושי שנותן באופן מיידי מספר מדויק של תאים סרטניים ברקמה. ספירת תאים פלורסנט ברקמה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי אפשרי גם ומציג את התמונות המדויקות ביותר של תאים סרטניים גרורתי, אולם היא גוזלת זמן, עלולה להחזיר תוצאות מוטה אם רק אזור שנבחר נספרת. המטרה האולטימטיבית של זה וזמינותו היא לבחון איך בקלות תאים סרטניים להצטבר בתוך הריאות. כפי שדווח בעבר3,4, אם הריאות הן בשלב טרום גרורתי עקב איתות דלקתיות מן הגידול העיקרי, לתאי הגידול מוזרק נוטים להצטבר הריאות, ובכך רומז גבוהה יותר הסיכויים גרורות ריאה. תנאים אחרים (דלקת מפרקים שגרונית, אסטמה, וכו ‘), והטיפול עם סוכנים אנטי דלקתי (כגון אנטי-TNFα) עשוי להחליש גרורות ריאה. לפיכך, אנו מסיקים כי assay הזה הוא כלי רב עוצמה כדי להעריך את האפשרות של גרורות ריאה.
טיפול קדם של עכברים עם נוגדנים, תרופות, תזונה עתירת שומן או ממוזגים-גידול בינוני לפני הזרקת תאי הגידול הוא אפשרי. השלב הקשה ביותר זה וזמינותו היא הזריקה וריד הזנב. הזרקת לא שלם תוצאות חד משמעיות נתונים. וריד הזנב ב- C57BL/6 קשה במיוחד לזהות, וכתוצאה מכך זריקות שנכשלו. הנחת העכבר על כרית החימום (37…
The authors have nothing to disclose.
אף אחד
Collagenase | Sigma | C6885 | |
Dispase | Gibco | 17105-041 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
DPBS | Gibco | 14190-144 | no calcium, no magnesium |
Deoxyribonuclease I | Sigma | DN-25 | trace amount |
RBC lysis buffer | Sigma | R7757 | |
Cell strainer | BD | 352340 | 40 micrometer mesh |
Fluorescence labeling kit | Sigma | MIN26-KIT | |
DMEM | Gibco | 11965-092 | |
0.22 μm syringe filter | sartorius | 17597K | |
O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 |